美国国家科学院程序。2008年7月29日；105(30): 10513–10518.
循环microRNA作为癌症检测的稳定血基标记物
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L.Pogosova-Agadjanyan时代
¶临床研究，以及
珍妮弗·诺布姆
‖华盛顿大学泌尿系，西雅图，WA 98195；和
凯西·奥布莱恩特
††华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心公共卫生科学，邮编98109；
April Allen公司
††华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心公共卫生科学，邮编98109；
丹尼尔·W·林
††华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心公共卫生科学，邮编98109；
‖华盛顿大学泌尿系，西雅图，WA 98195；和
‡‡华盛顿州西雅图Puget Sound Health Care System退伍军人事务部，邮编98108
妮可·厄本
††华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心公共卫生科学，邮编98109；
查尔斯·德雷舍尔
††华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心公共卫生科学，邮编98109；
比阿特丽斯·克努森
††华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心公共卫生科学，邮编98109；
罗伯特绅士
††华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心公共卫生科学，邮编98109；
罗伯特·维塞拉
‖华盛顿大学西雅图分校泌尿外科，邮编98195；和
‡‡华盛顿州西雅图Puget Sound Health Care System退伍军人事务部，邮编98108
丹尼尔·马丁
的分区†人类生物学，
§§华盛顿州西雅图系统生物学研究所，邮编98103；
穆尼什·特瓦里
的分区†人类生物学，
¶临床研究，以及
的分区†人类生物学，
¶临床研究，以及
††华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心公共卫生科学，邮编98109；
§§华盛顿州西雅图系统生物学研究所，邮编98103；
‖华盛顿大学泌尿系，西雅图，WA 98195；和
‡‡华盛顿州西雅图Puget Sound Health Care System退伍军人事务部，邮编98108
由Leland H.Hartwell，Fred Hutchinson癌症研究中心传达，西雅图，华盛顿州，2008年5月12日。
作者贡献：D.W.L.、C.W.D.、D.L.S.、R.L.V.、P.S.N.、D.B.M.和M.T.设计的研究；P.S.M.、R.K.P.、E.M.K.、B.R.F.、S.K.W.、E.L.P.-A.、A.P.、J.N.、K.C.O.和A.A.进行了研究；N.U.、B.S.K.、D.L.S.和R.L.V.提供了新的试剂/分析工具；P.S.M.、R.K.P.、E.M.K.、B.R.F.、S.K.W.、R.G.和M.T.分析数据；P.S.M.、R.K.P.、E.M.K.、B.R.F.和M.T.撰写了论文。
‡P.S.M.、R.K.P.和E.M.K为这项工作做出了同等贡献。
§目前地址：Illumina，Inc.，9885 Towne Centre Drive，San Diego，CA 92121。
开发用于检测和监测常见上皮性恶性肿瘤的微创检测可以大大减轻全球癌症的健康负担(1). 虽然基于血液的生物标记物发现的传统策略（例如，使用蛋白质组技术）已经显示出了希望，但临床验证的癌症检测标记物的开发对于许多常见的人类癌症来说仍然是一个尚未解决的挑战(2). 迫切需要能够补充和改进当前癌症检测策略的新方法。
MicroRNAs（miRNAs）是一种小的（通常约为22 nt）调节RNA分子，其功能是调节特定mRNA靶的活性，并在广泛的生理和病理过程中发挥重要作用(三,4). 我们假设miRNAs可能是一类理想的基于血液的癌症检测生物标记物，因为：(我)miRNA在癌症中的表达经常失调(5,6), (ii（ii）)人类癌症中miRNAs的表达模式似乎具有组织特异性(7)，以及(三)miRNAs在福尔马林固定组织中具有异常高的稳定性(8–10). 第三点让我们推测，miRNAs在血浆和血清中也可能具有非凡的稳定性。我们在这里表明，miRNA事实上以非常稳定的形式存在于血浆和血清的临床样本中。此外，我们通过使用异种移植模型系统和前列腺癌患者的临床血清样本，为基于血液的miRNA癌症检测建立了证据。我们的研究结果为miRNAs作为一类新型血液肿瘤生物标记物的开发奠定了基础，并对循环miRNAss的稳定性机制和潜在的生物学功能提出了令人担忧的问题。
结果
人血浆内源性miRNAs的鉴定和分子克隆。
先前的报告表明，人类血浆中的RNA（通过离心去除细胞后残留的血液中的非细胞成分）主要是低分子量的(11). 通过使用放射性标记表征从血浆中分离出的总RNA的大小，我们直接证实了人类血浆中含有miRNAs大小范围内的小RNA（18-24nt）。5′的PAGE和磷光成像32P-标记的血浆RNA显示了大小在10到70 nt之间的RNA物种，包括大小≈22 nt的可辨别物种，这是大多数miRNAs的特征[支持信息（SI）图S1]. 检测到的信号对RNase处理敏感，但对DNase I处理不敏感，这证实了信号来源于RNA(图S1).
为了直接确定人类血浆中是否存在miRNA，我们从健康供体的人类血浆样品中分离出18-24-nt RNA部分（参见SI文本有关血液采集和血浆RNA分离的详细信息），并使用5′和3′RNA-RNA连接子连接，然后进行RT-PCR扩增，以生成小RNA cDNA文库(A类). 从该文库中测序的125个克隆中，有27个对应于尖峰大小标记寡核苷酸或连接体-连接体二聚体。其他98个序列中有91个（93%）与已知的miRNA相对应，直接证实了成熟的miRNA存在于人类血浆中，并表明我们方案克隆的绝大多数18-24-nt血浆RNA物种确实是miRNA(A类). 为了量化特定的miRNAs，我们使用了Taq公司人定量RT-PCR（qRT-PCR）分析(12)测量三个miRNAs(miR-15b基因,miR-16型、和miR-24)在三名健康人的血浆中。这三种miRNAs被选为代表中到低丰度血浆miRNA（基于上述测序结果），根据所检测的miRNA，它们在每个个体的血浆中都很容易检测到，浓度从8910拷贝/μl血浆到133970拷贝/μl血浆不等(B类).
人血浆中miRNAs的鉴定。(A类)人血浆中miRNAs的克隆和测序。示意图描述了从人类血浆中制备小RNA库的过程。简言之，单个供体血浆总RNA≈250 ng的18-24-nt部分（个体006；描述于表S6)经PAGE分离。然后将纯化的miRNAs 3′和5′连接到单链寡核苷酸，该寡核苷酸包含用于反转录和PCR的通用引物序列。反转录和PCR生成一个小RNA cDNA分子库，将其连接到质粒载体（pCR4-TOPO）并转化为大肠杆菌共有125个单独菌落的插入物产生了高质量的序列。将序列与已知miRNA序列的参考数据库进行比较（miRBase Release v.10.1）(19)和GenBank。如图所示，73%的序列与已知的miRNAs相对应。第二个最丰富的物种是与合成RNA序列的匹配，这些合成RNA在凝胶分离步骤中作为放射性标记的18-nt和24-nt分子大小标记加入。当只考虑内源性RNA序列时，miRNAs占恢复序列的93%（98个中的91个）。读作“let-7f G15A”的miRNA表示与已知的let-7fmiRNA，核苷酸位置15处的G-to-a替换除外。(B类)正常人血浆中代表性miRNA的定量Taq公司手动qRT-PCR。该图显示了从三名健康人血浆中测得的三种代表性miRNAs的拷贝数。在每种情况下，数值代表实时PCR后两次重复逆转录反应的平均值。对于每个miRNA分析，使用化学合成的miRNA稀释系列生成标准曲线，该曲线允许对miRNA/μl血浆的分子进行绝对定量，如图所示（参见图S2对于标准曲线图）。通过在RNA分离过程中添加变性溶液后立即加入的合成标准化对照测量值，使数值中位数正常化（参见SI文本详细信息）。逆转录酶阴性对照中没有扩增，表明扩增来自RNA模板（与血浆RNA样品和阴性对照相对应的实时PCR图见图S3).
人血浆中内源性miRNAs的稳定性。
鉴于这是用作生物标记物的重要前提条件，我们接下来试图研究血浆中miRNAs的稳定性。在室温下培养血浆长达24小时(A上部)或进行多达八次的冻融循环( A下部)对miR-15b型,miR-16基因，或miR-24型测量单位：Taq公司Man-qRT-PCR。据报道，血浆中含有高水平的核糖核酸酶活性(13)，我们试图确定miRNAs的稳定性是否是其小尺寸或化学结构所固有的，或者是否是由额外的外部因素引起的。我们引入了与三种已知的miRNA相对应的合成miRNAs秀丽隐杆线虫微小RNA(摄氏度-39,摄氏度-54、和摄氏-238度)由于人类中没有同源序列而选择，在添加抑制核糖核酸酶活性的变性溶液之前或之后进入人类血浆。RNA提取和合成miRNAs的测量表明，与向血浆中添加变性溶液后的添加相比，直接添加到血浆中的合成miRNA快速降解（添加合成miRNA和随后添加变性溶液之间的时间<2 min）(B类). 这些结果证实了血浆中存在核糖核酸酶活性以及裸miRNA对降解的敏感性。内源性miRNAs水平（即。，miR-15b型,miR-16型、和miR-24型)在任何实验样品中都没有显著改变(B类)表明内源性血浆miRNAs以抵抗血浆RNase活性的形式存在。
人血浆中miRNA稳定性的表征。(A类)当血浆经受长时间室温孵育或多次冻融时，miRNA水平保持稳定。(上部)图表显示了在室温下培养指定时间的人血浆样品平行等分样品中测量的指示miRNAs的标准化Ct值。这项实验是用两个不同个体的血浆进行的。样本间原始Ct值的标准化基于对三种非人类合成miRNA的测量，这些miRNA在初始血浆变性后以已知摩尔量注入每个样本，用于RNA分离（详见SI文本). (下部)这些图表显示了在平行等分的人血浆样品中测量的指示miRNAs的标准化Ct值，这些样品经过了指示的冻融循环次数。使用与上述相同的方法对样本中的原始Ct值进行归一化。(B类)外源性添加的miRNA在血浆中迅速降解，而内源性miRNAs是稳定的。三个秀丽线虫化学合成miRNAs（因与人类miRNA序列不相似而选择）并直接添加到人类血浆中（来自个体003；如表S6)或在向血浆（称为“变性血浆”）中添加变性溶液（含RNase抑制剂）后添加。从两份血浆样品中分离出RNA，三份样品中每一份的丰度秀丽线虫miRNAs的测量方法为Taq公司人qRT-PCR(左侧)以及三种内源性血浆miRNAs(赖特). 星号表明摄氏度-39,摄氏度-54、和铈-miR-238直接添加到人血浆中，相对于添加到变性血浆中，为1.7×10−5, 9.1 × 10−6和1.1×10−5，因此太低，无法在绘图中准确显示。(C类)从同一个体采集的血清和血浆中miRNA的丰度高度相关。每个图描述了在同一次抽血时从给定个体采集的血清和血浆样本中测量的指示miRNAs的平均Ct值（两个技术复制品的平均值）。显示了三个不同个体的结果。两种样本类型的miRNA测量结果高度相关。合成结果显示秀丽线虫添加到每个血浆或血清样品中的miRNA（添加变性溶液后）表明，miRNA的实验回收率和后续qRT-PCR的稳健性不受采集的血浆或血清的影响。
血浆和血清中miRNA水平的比较。
鉴于在许多回顾性临床样本库中，血清的临床样本（全血凝固后残留的上清液）比血浆样本更丰富，我们试图通过测量血清与血浆中miRNA的测量值来确定血清中miRNA测量值是否存在实质性差异miR-15b型,miR-16型,miR-19b型、和miR-24型在同一次抽血时从特定个体采集的匹配血清或血浆样本中(C类). 从血浆或血清中获得的测量结果具有很强的相关性，表明血清和血浆样品都适合作为血源生物标记物研究miRNAs。
肿瘤衍生的miRNAs存在于血浆中。
在证明从健康人采集的血液中可以检测到循环中的miRNAs并保持稳定后，我们接下来试图确定肿瘤衍生的miRNA进入循环的水平是否足以作为癌症检测的生物标记物进行测量。我们选择研究一种小鼠前列腺癌异种移植模型系统，该系统涉及NOD/SCID免疫低下小鼠中22Rv1人前列腺癌细胞系的生长(14–17). 我们建立了一个由12只注射了Matrigel的22Rv1细胞异种移植小鼠和12只单独接种Matrige1的对照小鼠组成的队列(A类). 28天后（肿瘤确定后）收集血浆，分离RNA用于miRNA定量。由于缺乏对血浆或血清的内源性miRNA控制，我们引入了三种合成的秀丽线虫将变性溶液添加到血浆样品中后，将miRNAs（如前所述）用作标准化对照，以校正RNA回收中的技术差异（详见SI文本).
在血浆中可以检测到肿瘤衍生的miRNAs。(A类)22Rv1人前列腺癌异种移植实验方案。(B类)健康对照小鼠的血浆中存在MiRNAs，其水平在荷瘤小鼠中没有非特异性改变。血浆水平miR-15b基因,miR-16型、和miR-24在12只健康对照小鼠和12只异种移植小鼠中进行了测定。这些miRNAs的成熟序列在小鼠和人类之间完全保守。通过使用在与实验样品相同的平板上运行的合成靶miRNA的已知输入量的稀释系列，将Ct值转换为拷贝数/μl血浆的绝对值（稀释曲线提供于图S2). 所示值已通过使用以下测量值进行标准化秀丽线虫变性后加入血浆中的合成miRNA对照品用于RNA分离（标准化方法的详细信息见SI文本). (C类)在异种移植小鼠的血浆中检测到肿瘤衍生的miRNAs，可以区分移植小鼠和对照小鼠。血浆水平miR-629型*和miR-660型（在22Rv1细胞中表达的两个人类miRNA，没有已知的小鼠同源物）在所有对照和异种移植小鼠中进行了测量。Ct值被转换为每μl血浆的绝对拷贝数，并按照以下描述进行标准化B类（请参见表5)阈值。鉴于小鼠中不存在同源的miRNAs，因此在对照组的少数小鼠中检测到低水平的信号，特别是在miR-660型检测，可能代表非特异性背景扩增。正如预期的那样，在对照（非肿瘤）小鼠组中，qRT-PCR用于miR-629型*或miR-660型在大多数动物的血浆中没有检测到任何明显的信号。因此，尽管对对照组12只小鼠的整个组的血浆样本进行了研究，但这些点并未显示在图表上。
我们首先试图确定内源性（小鼠）miRNA存在于小鼠血浆中，并确定癌症的存在是否会导致血浆miRNA的普遍增加，无论是肿瘤还是宿主衍生的。miR-15b型,miR-16型、和miR-24型（在人类和小鼠之间的成熟序列中完全保守）在健康对照小鼠中都很容易检测到(B类)并且在异种移植小鼠中没有显著不同的表达水平，这表明肿瘤的存在不会导致血浆miRNAs的普遍增加。
接下来，我们首先利用微流控芯片对22Rv1细胞中365个已知miRNA的表达进行分析，以确定候选的肿瘤衍生miRNA，并在血浆中进行检测Taq公司人低密度miRNA qRT-PCR阵列（应用生物系统）。我们发现了两个miRNAs，miR-629型*和miR-660型，那个(我)如低周期阈值（Ct）值和(ii（ii）)没有已知的小鼠同源物，因此在这种情况下有望成为肿瘤特异性标志物(表S1). 接下来，我们分析了来自对照组和异种移植小鼠的血浆样本中的miR-629基因*和miR-660型通过Taq公司手动qRT-PCR。的级别miR-629基因*和miR-660型在对照组小鼠中通常检测不到，但很容易检测到（10到1780拷贝/μl血浆miR-629型*和5189–90783拷贝/微升miR-660型)在所有异种移植小鼠中(C类). 两者的级别miR-629型*和miR-660型能够以100%的灵敏度和100%的特异性独立区分异种移植小鼠和对照小鼠。这些数据证明了肿瘤衍生的miRNAs到达血液循环的原理，血浆中的测量可以作为癌症检测的手段。
为了了解在不同异种移植小鼠中观察到的miRNA丰度大幅度变化的基础，我们比较了小鼠血浆中miRNA的水平miR-629型*和miR-660型每只小鼠有肿瘤肿块。这些miRNAs的水平与肿瘤质量中度相关(图S4并查看表S7)表明动物间miRNA丰度的变化至少部分反映了肿瘤负担的差异。
血浆中肿瘤衍生的miRNA与细胞无关。
我们试图通过测试循环肿瘤细胞内存在的miRNA的假设，进一步探讨肿瘤衍生miRNA对血浆核糖核酸酶活性的保护机制，这些细胞可能在初次离心血浆分离过程中逃逸出颗粒。我们采取了两种方法来解决这个假设。在第一个实验中，我们通过0.22μm过滤器过滤异种移植或对照组产生的混合血浆，然后从滤液和滤液上保留的物质（称为滞留物）中提取RNA。测量miR-629型*和miR-660型每个样本的qRT-PCR结果表明，几乎所有来源于肿瘤的miRNAs都通过了0.22-μm过滤器(图S5A类). 正如预期的那样，在对照组的所有样本中基本上检测不到肿瘤衍生的miRNA。在第二个独立实验中，我们对异种移植和对照组的血浆池进行了两次离心（一次2000×克首先用离心法收集血浆，然后用12000×克，这将使任何大细胞碎片形成颗粒）。我们检测了起始材料、每次离心获得的颗粒材料以及12000×克离心。如所示图S5B类，几乎所有肿瘤衍生的miRNA都存在于12000×克旋转。总之，这些数据表明，肿瘤衍生的miRNA与完整细胞或大细胞片段无关。这些结果并不排除循环肿瘤细胞或其碎片可能在血液采集或血浆处理过程中被溶解的可能性。然而，即使是这样，我们的结果显示，可能释放的miRNA最终以稳定、受保护的形式存在，其大小远小于典型上皮细胞的大小。
基于血清中前列腺癌表达的miRNA的测量的人类前列腺癌的检测。
接下来，我们试图将这种方法扩展到人类癌症检测中。我们推断理想的标记应该是(我)由中或高水平的癌细胞表达(ii（ii）)健康人血浆中含量很低或检测不到。我们通过以下方法建立了前列腺癌可能的基于血液的miRNA生物标记物候选名单(我)根据已发表的miRNA表达谱数据汇编人类前列腺癌标本中表达的miRNA列表(7,18)和(ii（ii）)在我们的miRNA克隆实验中筛选出健康供体或衍生血浆中检测到的miRNA(A类)或在微流体中检测到Taq公司正常健康人血浆的Man-qRT-PCR阵列分析（详情见SI文本并查看表S8). 这一过程产生了六位主要候选人的名单(miR-100型,miR-125b型,miR-141型,miR-143型,miR-205型,和miR-296)以便进一步调查。
我们选择了25名转移性前列腺癌患者和25名年龄匹配的健康男性对照患者的血清样本作为病例对照队列，对这些候选者进行分析。为了有效筛选多个miRNA生物标记物候选物，我们首先分别从病例组和对照组的个体中提取了两组血清等分样本。我们从两个池中分离出RNA，并通过Taq公司Man-qRT-PCR分析。该筛查结果表明，与健康对照组血清池相比，6个候选miRNA生物标记物中有5个在前列腺癌血清池中的表达有所增加，尽管程度不同(表S2). 对于其中一个候选人(miR-205型)，无法得出结论，因为两个池中的miRNA水平均低于检测限（根据使用合成物稀释系列的标准曲线确定miR-205型RNA寡核苷酸）。在所有候选人中，miR-141型与对照组相比，前列腺癌组差异表达最大（46倍过表达(表S2). 因此，我们将研究重点放在miR-141型通过测量该miRNA在包括病例组和对照组的所有个体血清样品中的丰度。与合并样本的分析结果一致miR-141型总的来说，与对照组相比，癌症病例的发病率要高得多(A类). 通过Wilcoxon双样本检验对两组进行比较，得出W=63P（P）= 1.47 × 10−7，证实了miR-141型两组之间的级别。此外miR-141型能够以60%的灵敏度和100%的特异性检测出癌症患者(A类). 使用接收器工作特性图表示数据(B类)反映了两组之间的强烈分离，曲线下面积（AUC）为0.907。的比较miR-141型前列腺癌患者中前列腺特异性抗原（PSA）值的水平显示Pearson和Spearman（秩）相关系数分别为+0.85和+0.62，表明miR-141型PSA水平中度相关(表S3). 非生物标记候选miRNAs的血清水平miR-16型,miR-19b型、和miR-24型案例和控制之间没有显著差异，支持以下概念miR-141型在前列腺癌中特异性升高，而不是反映出癌症患者血清miRNA水平的非特异性普遍升高(C类). 综上所述，研究结果扩展到了人类癌症，即循环miRNAs可以作为癌症检测的标记物。
通过肿瘤相关miRNA miR-141的血清水平检测人类前列腺癌。(A类)血清水平miR-141型区分晚期前列腺癌患者和健康对照组。前列腺癌表达的miRNA的血清水平miR-141型在25名健康对照男性和25名转移性前列腺癌患者中进行了测量（受试者的临床数据见表S3). 通过使用与实验样品同时（在同一平板上）运行的合成靶miRNA的已知输入量的稀释系列，将Ct值转换为每μl血清的绝对拷贝数（稀释曲线见图S2). 所示值已通过使用以下测量值进行标准化秀丽隐杆线虫变性后加入血浆中的合成miRNA对照品用于RNA分离（标准化方法详情见SI文本). 虚线表示100%的特异性阈值。(B类)接收机工作特性（ROC）图。中显示的数据A类用于绘制所示的ROC图。(C类)前列腺癌患者和对照组的血清非肿瘤相关miRNAs水平无显著差异。血清水平miR-16型,miR-24型、和miR-19b型由于血清中不存在癌相关物质，因此被检测为阴性对照。miRNAs的绝对定量和数据归一化如以下所述：A类.
miR-141是几种常见人类癌症表达的上皮相关miRNA。
miR-141是一个进化上保守的miRNAs家族的成员，在人类中包括，miR-141型,miR-200a型,miR-200b型,miR-200c型、和miR-429型(19). 该家族斑马鱼同源物的表达就地杂交，被发现定位于各种上皮组织(20). 为了更深入地了解miR-141型，我们探索了Lu生成的大型miRNA表达谱数据集等。(7)他描述了多种人类癌症类型。与斑马鱼研究的结果一致miR-141型与非上皮性样本相比，与上皮性样本中的表达密切相关(图S6)，以及miR-141型在广泛的常见上皮癌中表达，包括乳腺癌、肺癌、结肠癌和前列腺癌。
为了明确miR-141在前列腺组织的上皮和间质间室之间的相对表达，比较两种细胞类型之间的表达以及与一种细胞类型内所有其他已知miRNAs的表达，我们从人前列腺上皮细胞和基质细胞的原代培养物中生成小RNA库，并对其进行大规模平行测序（详见SI文本). 我们发现了miR-141型（及其两名家庭成员，miR-200b型和miR-200c型)在前列腺上皮细胞数据集中很容易检测到，但在前列腺基质细胞中却明显缺失(表S4). 事实上在该分析中的所有miRNA中，miR-141型和miR-200b基因与前列腺基质细胞相比，前列腺上皮细胞中的两种过度表达(表S4). 综合来看，这些数据与以下观点一致miR-141型是一种上皮限制性miRNA，可以作为前列腺癌生物标记物在循环中检测到。
讨论
我们的结果表明，在血浆或血清中检测到的肿瘤衍生miRNAs可以作为检测常见人类癌症类型的循环生物标记物。
尽管循环mRNA分子作为潜在生物标记物的研究已有很长的历史(21)，基于血液的miRNA研究尚处于初级阶段。最近，Chim等。(22)报道了用qRT-PCR检测孕妇血浆中推测来源于胎盘的miRNAs，以及Lawrie等。(23)报告检测淋巴瘤患者血清中miRNAs的升高。除了确认早期报告外，我们的研究还得出了以下结论(我)通过从血浆小RNA文库中直接克隆和测序，更全面地了解血浆miRNA(ii（ii）)miRNA稳定性的独特结果为进一步研究这类分子作为血源性癌症生物标记物奠定了坚实基础(三)有证据表明，肿瘤衍生的miRNAs即使来源于上皮癌类型（与淋巴瘤等造血恶性肿瘤相比）也可以进入循环。最重要的是，我们对miR-141型在前列腺癌患者中，肿瘤表达的miRNA的血清水平能够以显著的特异性和敏感性区分癌症患者和健康对照组。
可用数据表明miR-141型在一系列常见人类癌症中以上皮细胞类型特异性的方式表达。鉴于此，我们推测，对于缺乏经临床验证的血液生物标记物的癌症类型（例如肺癌、乳腺癌等），它在检测癌症复发方面可能具有价值。我们还预计，miRNA qRT-PCR分析设计和分析优化的进展，以及替代miRNA定量策略的应用，将大大改进该方法，并且可能需要在较低肿瘤负担下检测癌症（即早期疾病）。很可能会发现其他针对特定癌症类型的基于血液的miRNA标记。本文的结果奠定了基础和理论基础，以推动未来对miRNAs作为多种常见人类癌症的循环癌症生物标记物的全球研究。
我们的研究提出了关于血浆中miRNA稳定性机制和循环miRNA潜在生物学作用的有趣问题。
临床血浆样本中miRNAs的显著稳定性引发了有关miRNAs-保护其免受内源性RNase活性影响的机制的重要而有趣的问题。一个诱人的假设是，它们被包装在由细胞分泌的外显体中。外显子为50至90-nm(24)，据报道血浆中富含膜结合颗粒(25)最近（在细胞培养研究中）发现含有miRNAs(26). 我们对含有肿瘤衍生miRNAs的血浆进行过滤（通过0.22-μm过滤器）和差速离心的结果肯定与这个假设一致(图S5). 另一种解释包括通过与其他分子（如RNA-蛋白质复合物中的分子）的结合或miRNAs的修饰来保护它们，使其对RNase活性产生抗性。
许多循环miRNAs的高丰度也引发了人们对其作为细胞外信使介导短距离和长距离细胞-细胞通信的潜在生物学作用的质疑，这让人想起了在植物和秀丽线虫(27,28). 还需要更多的研究来探索这些令人兴奋的假设。
miRNAs作为血源性癌症生物标记物的优势和潜力。
全球miRNA表征的强大方法和简单、普遍适用的定量分析（如qRT-PCR）的可用性表明，miRNA生物标志物的发现-验证管道将比传统的蛋白质组生物标志物发现-验证管道更有效，在抗体生成和生物标记候选物验证的定量分析开发方面通常会遇到瓶颈(2). 此外，miRNAs的固有调节功能可能使肿瘤组织中表达的许多miRNAs影响肿瘤的生物学行为和临床表型。随着miRNA在肿瘤生物学中的功能作用被揭示，我们设想将鉴定出预测临床行为和/或治疗反应的基于血液的miRNA生物标志物。
材料和方法
临床样本。
根据机构审查委员会批准的方案，在知情同意的情况下，从健康献血者或癌症患者处获取人类血浆和血清样本。样本来自太平洋卵巢癌研究联合会、西雅图地区的当地健康捐赠者或华盛顿大学泌尿系。样本采集和处理的详细信息以及相关的临床数据见SI文本.
RNA分离。
使用改良的mirVana PARIS试剂盒（Ambion）从血浆或血清中分离RNA，详见SI文本.
小鼠异种移植实验。
通过皮下注射7.5×10在NOD/SCID小鼠中建立异种移植物5每只小鼠22Rv1细胞。注射后28天通过心脏穿刺收集小鼠血液。有关细胞培养、异种移植物建立、血浆采集和RNA分离的更多详细信息，请参阅SI文本.
qRT-PCR。
通过使用Taq公司修改后的人miRNA qRT-PCR分析，详见SI文本.
使用Spiked-In对血浆或血清实验qRT-PCR数据进行归一化秀丽线虫控制。
三个秀丽线虫选择miRNA是因为与人类miRNA缺乏序列同源性，并且在miRNA微阵列上没有与人类miRNA探针的经验杂交（数据未显示）。根据经验推导出待加标的摩尔浓度，以产生与中等丰度miRNAs（例如。，miR-16型)正常健康献血者血浆中的血液检测(表S9). 合成版本的秀丽线虫在向样品中添加等体积的2×变性溶液（以抑制RNase）后，将miRNAs添加到血浆或血清中。关于使用这些控制来规范独立RNA分离的qRT-PCR结果的全部细节，请参见SI文本.
