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美国国家科学院院刊。1998年11月10日；95(23): 13829–13834.
数字对象标识：10.1073/pnas.95.23.13829
预防性维修识别码：PMC24912型
PMID：9811886

诱导型一氧化氮合酶缺乏小鼠肝再生受损

鲁德拉·M·雷,* Fung Yee J.Lee先生,* 安东尼·罗森,* 石启阳,* 惠志林,* 艾曼·科特什,† Foo Y.Liew先生,‡ 卡洛斯·萨拉戈萨,* 查尔斯·洛文斯坦,*和安娜·梅·迪尔*§
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摘要

成人组织在受伤时能够再生的机制尚不清楚。肝再生的启动需要损伤相关细胞因子、肿瘤坏死因子（TNF）α和白细胞介素（IL）6，并涉及细胞因子调节转录因子（如NF-κβ和STAT3）的激活。在再生过程中，TNFα和IL-6促进肝细胞存活和增殖，因为抑制任一细胞因子的干预措施不仅阻碍肝细胞DNA合成，而且增加肝细胞死亡。这些观察结果表明，细胞因子在再生肝脏中诱导肝保护因子。鉴于一氧化氮可以阻止TNF介导的促凋亡蛋白酶caspase 3的激活，并保护肝细胞免受细胞因子介导的死亡，细胞因子诱导的一氧化氮合酶（iNOS）可能是再生肝脏中的一个重要肝保护因子。为了支持这一假设，我们报告了iNOS基因靶向破坏的转基因小鼠对部分肝切除的肝细胞增殖反应受到严重抑制。相反，尽管保留了TNFα、IL-6、NF-κβ和STAT3的诱导，但部分肝切除术后caspase 3活性增加、肝细胞死亡和肝衰竭。这些结果表明，在成功的组织再生过程中，损伤相关细胞因子会诱导一些因子，如iNOS及其产物NO，保护存活细胞免受细胞因子介导的死亡。

在成年脊椎动物中，再生能力仅限于少数组织，如肝脏。此外，在哺乳动物中，即使可以再生的组织在受伤时有时也不会再生。要在损伤组织中实现更大范围和更大程度的再生，需要深入了解细胞和分子机制，这些机制允许细胞在潜在的致命微环境中生存和增殖(1). 有趣的是，多能性损伤相关细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）α可以诱导肝细胞死亡或增殖，因此被认为影响肝损伤和肝再生(2). 识别调节细胞对TNFα反应的信号可能有助于开发在受损组织中创造再生环境的治疗方法。

当三分之二（部分）肝切除术（PH）切除大块肝脏时，TNFα的局部表达增加会触发包括白细胞介素（IL）6在内的其他细胞因子的产生，并需要启动随后的肝细胞增殖(三,4). 在靶向破坏TNF受体1型（TNFR-1）基因的小鼠中，PH后肝再生和IL-6诱导明显受到抑制。此外，这些小鼠在肝细胞中表现出过多的脂质积聚，PH后死亡率增加(4). IL-6阴性小鼠产生TNFα并表达TNFRs(5)但对PH-like TNFR-1-null小鼠有反应(6). 有趣的是，注射重组TNFα(7)，但不是IL-6(4)刺激正常健康小鼠的肝细胞增殖。然而，IL-6预处理可使PH后肝再生正常化，并可预防TNFR-1-缺失患者的死亡率(4)和IL-6阴性小鼠(6). 综上所述，这些结果表明，IL-6可能有助于诱导因子，使肝细胞在暴露于TNFα后增殖，而不是死亡。

损伤相关细胞因子调节许多肝细胞基因的转录，包括诱导型一氧化氮合酶（iNOS），该酶催化精氨酸形成NO(8–13).体内小鼠iNOS基因的足迹分析表明，TNFα和IL-6都不足以单独激活iNOS转录，但当这两种细胞因子结合时，iNOS的转录与脂多糖（LPS）一样上调，脂多糖是一种有效的iNOS诱导剂(12,14). 越来越多的证据表明，在LPS处理的动物和培养的肝细胞中，NO可以预防TNF介导的肝细胞损伤(15–17). 因此，IL-6可能至少部分通过促进iNOS的诱导来保护再生肝脏中的肝细胞免受TNFα的影响。其他研究表明，iNOS mRNA在PH后的复制前阶段积聚在肝脏中(18–21). 在此期间，iNOS的诱导似乎优先发生在肝细胞中，因为NO的生成几乎只在这些细胞中发现，而不是在PH后1–16小时从大鼠肝脏分离的肝非实质细胞中(18,19). NO产生峰值、iNOS mRNA和蛋白质积累之间存在显著的时间相关性(18–21)以及IL-6的诱导，所有这些都发生在PH后3-8小时左右的肝脏中。然而，iNOS诱导肝细胞进入细胞周期的功能意义尚不清楚。

我们假设再生肝细胞中iNOS的诱导可以保护它们免受内毒素血症和TNFα增加的致命影响，这也发生在PH后的复制前阶段(22,23). 因此，当iNOS的诱导被阻止时，PH可能会引起肝脏损伤，而不是再生。本研究通过比较iNOS基因靶向破坏转基因小鼠和野生型对照小鼠肝细胞增殖和死亡的几个标记来验证这一假设。还对TNFα、IL-6、NF-κβ和STAT3的再生诱导进行了评估，以确定这些细胞因子信号级联的关键成分是否在NO-缺乏动物中得以保留。

方法

小鼠PH实验。

实验开始时，所用的小鼠为MF-1、C129杂交小鼠，雄性鼠龄为8-10周（由格拉斯哥大学的F.Y.Liew和约翰·霍普金斯大学的C.Lowenstein提供）。根据Higgins和Anderson的方法，对iNOS-null小鼠和相同年龄和性别的MF-1、C129杂交对照小鼠进行PH试验(24). 所有实验都是按照美国国立卫生研究院和约翰霍普金斯大学关于实验动物人道使用的指导方针进行的。

肝脏再生评估。

BrdUrd标签。为了评估肝细胞DNA合成，在处死前2小时腹腔注射BrdUrd（10μg/g体重）。残肝在PH后0、24、36、48、72和96小时收获，固定、切片并用BrdUrd抗体染色。在10个不同的400×场/组织切片中计数阳性、深染的肝细胞核。在PH后的每个时间点，对至少4-6只不同iNOS缺乏和数量相近的野生型对照小鼠的组织切片进行评估。

肝细胞有丝分裂活性。

为了评估肝细胞复制，在每个时间点，从4–6只小鼠/组的10个不同的400×场中计算肝细胞的有丝分裂图。

肝块再生。

在PH时，对切除的肝脏进行称重，并使用此信息计算每只小鼠的初始肝脏重量，假设切除的肝脏=0.70×（总肝脏）。在PH后处死小鼠后，对残余肝脏进行称重。对于每只小鼠，剩余肝脏的重量除以该动物的初始肝脏重量，得出PH后重建的肝脏重量百分比。

肝细胞损伤评估。

肝细胞损伤的血清标志物。约翰·霍普金斯医院临床化学实验室在PH后的几个不同时间点对4-6只iNOS-null小鼠及其野生型同窝小鼠的样本进行了血清丙氨酸转氨酶活性和胆红素浓度的测定。

肝损伤的组织学评估。

为了进行形态学评估，对苏木精/伊红染色的肝脏切片进行检查，以确定肝脏损伤的证据。在至少五个不同的400×场/组织切片中统计坏死炎症灶的数量。在每个时间点评估四只不同小鼠/组的切片。在福尔马林固定的肝组织切片中进行TUNEL染色（末端脱氧核苷酸转移酶介导的UTP缺口末端标记），以评估Gavreili及其同事所描述的肝细胞凋亡的存在(25). 简言之，切片在二甲苯中脱蜡，通过分级系列的醇进行再水化，并在双蒸馏水中清洗。在用20 mg/ml蛋白酶K进行最佳消化后，在37°C的湿度室中用地高辛-11-dUTP（Boehringer-Mannheim）的缺口末端标记溶液培养切片60分钟。地高辛与荧光素结合的特异性抗血清（Boehringer-Mannheim）用于观察凋亡细胞核。阴性对照包括无酶或底物培养的连续切片。阳性对照在可商购的退化小鼠乳腺切片（Promega）中进行。由两名独立观察者在10个高功率场中计数荧光素标记的凋亡细胞核的数量，这些观察者在每组每个时间点（PH后24、36和48小时）从三只动物获得的载玻片中。

激活促凋亡蛋白酶，caspase 3。

体内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的特异底物U1-70kD（U-1核糖体蛋白的70-kDa片段）的裂解被用作半胱氨酸蛋白酶活性的标记。肝脏样品在含有10 mM Hepes/KOH、pH 7.4、2 mM EDTA、5 mM DTT、1%Nonide P-40和蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟、安替比林、亮氨酸蛋白酶和胃蛋白酶抑制素A的裂解缓冲液中均质。蛋白质浓度通过以BSA为标准的Bio-Rad分析（Amersham）测定(26). Western blot分析用于调查体内U1–70kD解理。每条车道装载100微克蛋白质匀浆。样品在含有0.087%双丙烯酰胺的10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。用识别U1-70kD及其标志性40-kDa凋亡片段的单特异性人血清免疫印迹法检测完整U1-70kD的裂解(27).

细胞因子评估。

细胞因子表达。使用商用ELISA（BioSource International，Camarillo，CA）测量TNFα和IL-6的血清浓度。在每个时间点评估4-6只不同小鼠/组的样品。以小鼠重组细胞因子为标准，每项试验均一式三份。此外，分别向iNOS缺乏小鼠和野生型小鼠腹腔注射3 ml巯基乙酸，4天后采集腹腔巨噬细胞。细胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培养过夜，然后大肠杆菌-将衍生脂多糖0111:B4（Sigma）（1 mg/ml）添加到一半培养物中。90分钟后，取出培养基并收获细胞。如前所述，从细胞颗粒中分离出总RNA(26)在变性条件下，在1%琼脂糖凝胶上通过电泳分离小份（20mg/lane）。通过毛细管印迹转移到尼龙膜上后，将印迹与cDNA探针杂交过夜，以获得小鼠TNFα（来自达拉斯德克萨斯西南大学的Bruce Beutler；参考文献。28)或小鼠IL-6（取自罗马蓬佩齐亚生物分子研究所Genaro Ciliberto）(29). 印迹在严格的条件下清洗，并暴露在带有增感屏的柯达胶片中。结果通过激光扫描密度测定（分子动力学）获得，并归一化为每个车道的18S波段。

细胞因子调节的转录因子。

根据Lavery和Schibler的方法，在PH后的不同时间点分离肝核蛋白(30)如前所述(26). 电泳迁移率变化分析用于评估NF-κβ和STAT3的DNA结合活性(31). 这个32NF-κ(26). STAT3分析使用了32包含顺式诱导元件结合位点的P标记的双链20 bp寡核苷酸。将1毫升市售的（Santa Cruz Biotechnology）NF-κβp50或p65或总STAT3或磷酸化STAT3的抗血清加入到一些反应混合物中，以通过超位移分析评估DNA复合物形成的特异性。每条车道装载8毫克核蛋白。如前所述，通过Western blot分析STAT3蛋白水平(26,31). 简言之，蛋白质在12%SDS/PAGE上分离并转移到Immobilon-P膜（Millipore）上。用商用特异性抗血清（Santa Cruz Biotechnology）对印迹进行检测，以检测总STAT3或磷酸化STAT3，并通过ECL检测系统（Amersham）对蛋白质进行可视化。通过扫描激光密度测定法（分子动力学）评估从3-4个独特实验中获得的斑点。

结果

8至10周龄雄性iNOS-null小鼠(32)和相同性别和年龄的野生型（MF1，C129杂交）小鼠进行PH(24). 使用具有相似遗传背景的小鼠来最大限度地减少对肝损伤或PH反应的潜在品系间差异。在PH之前，iNOS缺失小鼠的肝脏重量、组织学和血清转氨酶水平正常。在PH之后最初96小时内，iNOS缺失小鼠的死亡率仅略高（13±2%）与对照组相比（4±2%）。然而，在所有存活的iNOS-null小鼠中，肝再生均受到明显抑制，BrdUrd的肝细胞掺入减少即证明了这一点（图。​（图11 A类和B类)，有丝分裂（图。​（图11C)和肝块恢复（图。​（图11天). 此外，与PH后出现轻微（1级）门脉周围脂质积聚的对照小鼠相比，iNOS-null小鼠在PH后24–48小时内肝细胞出现严重（3–4级）全小叶微泡脂肪变性（图。​（图2）。2). 在苏木精/伊红染色的肝脏切片上，脂肪变性伴有肝损伤的组织学证据，表现为坏死灶、多形核细胞浸润和肝细胞凋亡（图。​（图3三 A类–C). TUNEL染色证实凋亡增加，这清楚地说明了异硫氰酸荧光素标记的肝细胞和非实质细胞中的核碎裂（图。​（图44A类). TUNEL染色切片上凋亡肝细胞数量增加的图示如图所示。​图44B类与对照组相比，iNOS-null小鼠24小时的凋亡显著增加。

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iNOS-null小鼠的肝脏再生受到抑制。(A类)通过计算10个不同区域中阳性肝细胞的数量，确定每只小鼠的BrdUrd标记肝细胞的平均数量。在每个时间点评估4-6只不同小鼠/组的样品。结果显示了每个时间点4-6只小鼠/组平均值的平均值±SE，并以对照小鼠BrdUrd标记峰值的百分比表示。(B类)对照组和iNOS缺乏小鼠在两种不同放大倍数下的代表性显微照片[×400(低e（电子）第页)和×1000(上部)]. 深染细胞核表明BrdUrd标记的肝细胞。(C)肝细胞有丝分裂以有丝分裂小体/100个肝细胞的数量表示，结果显示为各组的平均值±SE。(天)肝脏重量被用作肝脏再生的另一个测量指标。结果显示，每个时间点4-6只不同小鼠/组的数据平均值±SE。

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iNOS缺乏小鼠在PH后肝细胞中出现过多的脂质积聚。iNOS缺失小鼠肝脏苏木精/伊红染色切片的典型显微照片(A类)和对照小鼠(B类)PH后48小时(A.1款和B.1节)肝腺泡的3区（中央周围区域）。(A.2款和B.2节)中部区域（2区）。(答3和B.3节)肝腺泡的1区（门周区）。注意，在对照小鼠肝脏的门周和腺泡中部区域很容易识别有丝分裂图（箭头），但在iNOS缺陷的肝脏中检查类似的区域时不明显。（放大倍数=×400。）

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PH导致肝损伤灶。iNOS缺乏小鼠的肝损伤可能在苏木精/伊红染色切片上表现为(A类)局部坏死区伴有出血和多形核细胞浸润(B类)弥漫性脂肪变性伴炎性细胞浸润，或(C)肝细胞凋亡的明显形态学特征，伴有染色质边缘化和/或浓缩。（放大倍数：A类和C, ×400;B类, ×1,000).

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PH导致iNOS缺乏小鼠肝细胞凋亡。(A类)PH后24小时，iNOS缺乏小鼠的TUNEL染色肝脏切片的代表性×400显微照片。凋亡细胞由亮绿色荧光（FITC+）指示。(B类)iNOS缺乏小鼠PH后肝细胞凋亡活性增加。显示了在24、36和48小时从对照组和iNOS缺乏小鼠肝组织切片中获得的凋亡活性的图形表示。TUNEL阳性染色的肝细胞百分比以及染色质边缘化和/或浓缩和核碎裂的典型特征如图所示x个轴。

肝细胞死亡的程度和主要类型随时间变化显著。在PH后24小时，iNOS-null小鼠的肝细胞凋亡数量仅大于对照组。此时TUNEL染色显示肝细胞和肝非实质细胞的凋亡增加。到PH后36小时，iNOS-null小鼠和对照小鼠的细胞凋亡都很罕见。然而，从PH后36到48小时，iNOS缺失动物的肝细胞出现坏死的小病灶，而对照组则不明显。坏死区域通常与局部出血有关。炎性细胞的肝脏浸润稀疏，往往与坏死肝细胞的孤立小病灶共存。与肝损伤的组织学证据一致，iNOS-null小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶活性升高，并表现出肝衰竭特征，包括高胆红素血症（表​（表1），1)其严重程度足以导致存活小鼠出现明显的黄疸（数据未显示）。

表1

iNOS缺乏小鼠和对照小鼠血清中丙氨酸转氨酶和胆红素水平

PH后的时间血清胆红素
血清ALT
控制iNOS-空控制iNOS-空
0小时0.2  ±  0.050.25  ±  0.0433  ±  830  ±  5
24小时1.2  ±  0.34.4  ±  1.1*987  ±  67714  ±  105
36小时1.8  ±  0.64.9  ±  1.2*854  ±  2211,752  ±  352*
48小时0.9  ±  0.46.4  ±  2.1*360  ±  76589  ±  82*
72小时0.6  ±  0.318.5  ±  4.9*121  ±  42477  ±  79*
96小时0.5  ±  0.117.2  ±  6.2*54  ±  21402  ±  63*

在PH后的几个不同时间点从iNOS缺乏小鼠和对照小鼠中获得血清(n个=每个时间点4只或更多小鼠/组）。*，P（P）在同一时间点，iNOS缺乏组与对照组相比<0.01。丙氨酸氨基转移酶。 

虽然iNOS-null小鼠中出现的肝脂肪变性和肝细胞增殖减少与TNFR-1-null中报告的类似特征相似(4)IL-6为空(6)PH后，iNOS小鼠TNFα和IL-6的再生诱导未受到损害。事实上，在评估的每个PH后时间点，这些细胞因子的血清浓度都是对照组小鼠的2-5倍。与这一发现一致，经脂多糖刺激后，健康iNOS-null小鼠培养的腹腔巨噬细胞表达的TNFα和IL-6 mRNA比对照组多（图。​（图5<zct；F5）。5<zct；F5）。因此，没有证据表明iNOS-null小鼠缺乏肝再生所需的任何一种细胞因子。此外，细胞因子调节转录因子（NF-κβ和STAT3）的PH后诱导在iNOS-null动物的肝脏中正常发生。如图所示。​图6，6，STAT3的DNA结合活性（图。​（图66A类)以及STAT3蛋白的肝内诱导（图。​（图66B类)iNOS-null小鼠在PH后的所有评估时间点与对照动物相当。在所有评估的时间点，iNOS-null小鼠和对照组中NF-κβ的DNA结合活性也相似（数据未显示）。这些结果表明，TNFα和IL-6的直接下游信号通路不受iNOS缺乏的影响，并且对PH的诱导反应正常。

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iNOS-null小鼠的巨噬细胞TNFα和IL-6的生成没有减少。TNFα典型Northern印迹的放射自显影(顶部)和IL-6(中部)如图所示。(底部)同一溴化乙锭染色印迹上的18S RNA带。

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与对照组相比，在PH后3小时，iNOS-null小鼠中STAT3的诱导正常。(A类)STAT3 DNA结合活性通过电泳迁移率测定法（EMSA）和超迁移测定法在PH后不同时间点测定。最大STAT3结合活性发生在PH之后3小时。该代表性EMSA描述了对照组和iNOS-null动物在基线（时间0）和PH后3小时的STAT3绑定活性。通道1 a-c包含来自添加了免疫前血清（a）、STAT3总抗体（b）或磷酸化STAT3抗体（c）的对照动物的时间0提取物。通道2 a-c含有PH后3小时对照组的提取物，其顺序类似；通道3 a-c和通道4 a-c分别含有iNOS-null动物在PH后0和3小时的提取物。(B类)通过Western blot分析，在PH后基线（时间0）、30分钟和3小时，测定对照组和iNOS-null组小鼠的总STAT3蛋白和磷酸化STAT3蛋白质水平。通道1和通道2代表在每个时间点用于实验的两个单独的动物。

随后的工作旨在确定iNOS-null小鼠PH后肝损伤的潜在机制。因为一些研究小组已经报道NO抑制了肿瘤坏死因子依赖的半胱氨酸蛋白酶3的激活(15–17,33,34)已知该蛋白酶是TNF引发的细胞死亡的近端介质(17,35)在PH后的几个时间点，比较iNOS-null小鼠和对照组的caspase 3活性。图。​图77证明在PH后，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3底物Ul-70kD被裂解，在iNOS-null小鼠的肝脏中生成标志性的凋亡40-kDa片段。在PH后的对照肝脏中没有观察到这种蛋白水解。因为TNFα(22,23)和NO生成(18–21)PH后再生肝中正常增加，后一发现表明iNOS生成的NO的功能之一是阻止TNFα激活再生肝细胞中的caspase 3。虽然还没有被证实，但在iNOS缺乏小鼠中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性在PH后升高的发现支持了这一解释。

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PH诱导iNOS-null小鼠中组成性表达的70-kDa肝蛋白的蛋白水解裂解。为了研究肝细胞凋亡活性，体内用识别U1-70kD的单特异性人血清免疫印迹法检测U1-70k D的裂解。特征性40-kDa肽表明完整蛋白的凋亡裂解。显示的结果代表了PH后24或36小时在四只不同小鼠/组中发现的结果。在该印迹中，每个通道包含PH后36小时来自不同小鼠的样本。

讨论

转基因iNOS缺陷小鼠和具有类似遗传背景的对照小鼠对肝切除的再生反应的比较提供了证据，表明再生需要诱导保护增殖细胞免受死亡的因子。这一发现可能具有普遍相关性，并可能有助于解释为什么一些组织在受伤后可以再生，而大多数其他组织无法替换死细胞并通过疤痕愈合。当结合大量近期证据进行解释时，本研究结果尤其具有启发性，即肝脏受损后，肝细胞需要损伤相关细胞因子才能重新进入细胞周期。在PH前用中和性抗TNF抗体治疗的小鼠和靶向破坏TNFR-1基因的肝切除小鼠的研究表明，TNFα在PH后复制前期早期激活生长调节激酶级联和几个生长相关的早期基因中起着关键作用(三,4). 显然，TNFR-1和TNFR-2都参与了福斯托团队的响应和工作(4)提示，尽管TNFR-1的激活对肝细胞增殖至关重要，但在这种情况下，TNFR-2启动的信号传导存在一些冗余(53). 例如，这两种受体都能够介导NF-κβ的激活(36).

除了在肝细胞中启动生长相关信号外，TNFα在PH后IL-6的诱导中起主要作用(三,4). 然而，克雷斯曼及其同事的研究(6)证明TNFα不足以促进肝脏再生，因为缺乏IL-6的转基因小鼠的再生受到抑制。有趣的是，PH导致TNFR-1-和IL-6阴性小鼠的肝脂肪变性增加和高死亡率(4,6). 先前对这些转基因动物的研究均未报告PH是否增加肝细胞凋亡。然而，这两份文件均表明，补充IL-6可恢复肝细胞增殖反应，并完全防止PH相关死亡率。

最近，Brenner和他的同事(37)据报道，I-κβ的过度表达抑制了NF-κβ的活化，并导致PH后肝细胞大量凋亡(37). 由于NF-κβ的再生激活在TNFR-1阴性小鼠中减弱，因此前者可能导致TNFR-1阳性小鼠肝损伤和PH后死亡率增加。然而，很难解释为什么补充IL-6可以保护这些动物，因为目前还不知道IL-6可以激活NF-κβ。同样，IL-6阴性小鼠在PH后不会降低NF-κ(4)IL-6阴性小鼠表达TNF和TNFRs。然而，与TNFR-1缺失小鼠类似，IL-6缺失小鼠在PH后发生肝损伤和死亡(6). 这些矛盾的观察结果可能与本研究中产生的证据相一致，这些证据表明细胞因子诱导基因，iNOS系统，以实现对PH的正常再生响应。

体内iNOS基因的足迹分析表明，TNFα和IL-6都不能作为单一因子诱导iNOS转录。然而，这两种细胞因子的组合与脂多糖一样上调iNOS转录(14). 这些观察结果与以下证据一致：诱导iNOS基因转录需要NF-κβ（TNF-激活因子）和IRF-1（IL-6诱导的STAT3依赖因子）(11–14,38). PH后复制前阶段肝脏iNOS表达和活性正常增加(18–21). 然而，在PH后，直到IL-6诱导的转录因子STAT3和IRF-1增加时，iNOS mRNA才会增加(20,21). 以前的研究使用我-NAME是一种非特异性NOS抑制剂，表明NO参与再生反应，因为抑制NOS导致PH后肝细胞增殖减少(39). 本研究表明，当受损肝脏中iNOS的诱导被阻止时，肝细胞会发生坏死和凋亡，而不是增殖，从而说明NO对肝再生的重要性。尽管启动肝切除增殖反应所必需的两种细胞因子（TNF和IL-6）丰富，尽管在早期肝再生过程中保留了导致NF-κβ和STAT3活化的细胞因子启动信号，但iNOS缺乏动物仍会出现这些负面结果。

NO是一种反应性极强的分子，具有多效性(9,32,40,41). 因此，可以想象，它在肝脏再生过程中有许多作用。最近描述的NO的生长调节作用在这种情况下可能特别相关。例如，NO已被证明能激活血管内皮细胞中的细胞外信号调节激酶（Erks 1和Erks 2）(42). 它还能够抑制神经细胞中NF-κβ的激活(43). 因为我们的iNOS缺乏小鼠在PH后出现了大量肝损伤的证据，所以我们将重点放在了被认为可以解释NO如何防止细胞死亡的具体的有充分记录的机制上。

在包括肝细胞在内的一些细胞类型中，已知NO可以保护细胞免受TNF诱导的凋亡死亡(17,34,44). 在细胞凋亡过程中，前caspase 3被切割成一种生物活性蛋白酶，其中Cys-163是IL-1β转化酶类和半胱氨酸蛋白酶caspase亚家族中高度保守的氨基酸，是充分蛋白水解功能所必需的(45). 亚硝基化Cys-163已知NO，因此可以通过直接翻译后机制抑制caspase 3的活性(34). 在许多细胞中，NO也能促进cGMP的积累，并且用cGMP治疗可以抑制TNF-依赖性caspase 3活性的诱导，而用cGMP-依赖性激酶抑制剂治疗则可以消除NO的这种作用。因此，NO也可以通过cGMP依赖性机制阻止caspase 2的激活(17). 越来越多的证据表明caspase 3在TNF介导的肝细胞死亡中起着关键作用(46,47)，caspase 3似乎是再生肝脏中NO的合理靶点，肝细胞暴露于TNFα水平升高的环境中(22,23,48). 与这种可能性一致，我们发现，与正常再生反应期间可能表现出iNOS诱导的对照小鼠相比，靶向破坏iNOS基因的转基因小鼠的caspase 3活性增加。U1–7OkD是胱天蛋白酶3的底物(27)因此是该酶活性的良好标记。然而，该试验无法阐明iNOS缺乏导致PH后caspase 3活性升高的确切机制。这可能是Cys-163亚硝化作用降低或cGMP调控的caspase三活性抑制抑制所致。此外，由于我们没有具体比较iNOS-null小鼠和对照小鼠中可能受到NO缺乏影响的所有可想象的反应，因此不可能排除其他潜在细胞内效应的作用（例如抑制细胞外信号调节激酶激活）或NO缺乏的细胞外效应（例如，肝血流变化）。事实上，由于iNOS-null小鼠的肝细胞坏死和脂肪变性也增加，这表明NO在再生肝脏中有许多作用，因为脂肪变性和两种类型的细胞死亡可能由不同的机制介导。然而，毫无疑问，防止iNOS诱导对肝脏受损后的再生能力有着深远的影响。在缺乏iNOS的情况下，PH主要引起肝细胞死亡，而不是典型的肝细胞增殖活性增加。尽管如此，许多iNOS小鼠在这种损伤中幸存下来，并表现出一些肝脏再生的证据，尽管它被延迟和减弱了。后者表明，在这种情况下，其他保护机制至少可以部分补偿NO缺乏。其他候选的细胞因子诱导的保护因子包括bcl-x和Hsp-70，它们与iNOS mRNA的诱导时间和PH后活性增加的时间大致相同(49,50).

细胞因子诱导分子（如NO）“阻断”组织损伤过程中积累的细胞因子的作用的能力可能具有广泛的意义。在与人和人一样分化的生物体中，组织再生取决于截肢或受伤后的局部细胞外环境以及增殖活性细胞从分化状态重新进入细胞周期的能力。然而，无论物种或器官如何，受损组织的成功再生还需要暂时中止正常、成年、稳态机制，这些机制通过将细胞周期重新进入与细胞死亡耦合来限制肿瘤形成(51,52). 有证据表明，iNOS活性是部分肝切除后肝脏净生长的重要先决条件，这表明NO可能有助于通过终止促进细胞死亡的分子的激活，将损伤环境转化为有利于再生的环境。

缩写

iNOS系统诱导型一氧化氮合酶
酸碱度肝部分切除术
TNF公司肿瘤坏死因子
TNFR公司肿瘤坏死因子受体
伊利诺伊州白细胞介素
隧道末端脱氧核苷酸转移酶介导的UTP缺口末端标记
U1–70kD=U-1核糖体蛋白的70-kDa片段。

脚注

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院