投资眼科视觉科学。作者手稿；PMC 2009年1月1日提供。
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Leber先天性黑蒙蛋白AIPL1作为伴侣杂合物的一部分发挥作用
来自英国伦敦大学学院伦敦眼科学院分子和细胞神经科学部
通讯作者：Jacqueline van der Spuy，伦敦大学学院眼科研究所分子和细胞神经科学部，英国伦敦EC1V 9EL；库。卡。库@是的。j. 摘要
目的
AIPL1号机组突变导致严重的遗传性失明Leber先天性黑蒙（LCA）。AIPL1与与伴侣Hsp90相互作用的四肽重复序列（TPR）耳蜗的相似性以及AIPL1以伴侣样方式抑制NUB1片段聚集的能力表明，AIPL1可能作为伴侣异源复合体的一部分，促进视网膜蛋白成熟。本研究揭示了AIPL1与分子伴侣的相互作用，并对其功能进行了表征。
方法
使用酵母双杂交系统鉴定AIPL1相互作用蛋白，并研究AIPL1致病性突变和序列要求对所鉴定相互作用的影响。通过一组全面的生化分析验证了相互作用，并评估了AIPL1结合伙伴与AIPL1合作抑制NUB1片段聚集的能力。
结果
AIPL1与分子伴侣Hsp90和Hsp70相互作用。AIPL1的TPR结构域内的突变或伴侣TPR受体位点的移除均消除了相互作用。重要的是，导致LCA的AIPL1突变也损害了这些相互作用，这表明AIPL1在感光细胞中的基本功能可能涉及与Hsp90和Hsp70的相互作用。对这些伴侣在AIPL1伴侣活性中的作用的研究表明，AIPL1与Hsp70合作，但与Hsp90没有合作，以抑制NUB1内含物的形成。
结论
这些发现表明，AIPL1可能在视网膜特异性伴侣杂合物中与Hsp70和Hsp90协同作用，因此这些分子伴侣可能促进AIPL1在光感受器中的特殊作用。
AIPL1基因编码突变导致Leber先天性黑色素沉着症（LCA），这是最严重的遗传性视网膜营养不良症，发病年龄最早。1体外和体内研究的结合已经开始揭示AIPL1在视网膜中的潜在作用。酵母双杂交分析首次鉴定了AIPL1与蛋白酶体相关蛋白NUB1的相互作用。2NUB1和一个较长的剪接变异体NUB1L针对未结合和蛋白结合的小泛素样蛋白Nedd8和FAT10进行蛋白酶体降解。三-6AIPL1可以调节NUB1从细胞核向细胞质的亚细胞分布。7NUB1的N端和C端片段分别形成小的核周包涵体和大的核内包涵体，其形成受到AIPL1的伴侣样抑制。7随后，AIPL1被证明与具有异戊二烯基序的蛋白质相互作用并增强蛋白质法尼基化。8AIPL1表达减少或取消的LCA小鼠模型显示cGMP磷酸二酯酶（PDE）水平在转录后降低。9,10然而，AIPL1突变导致疾病发病的分子机制尚未完全阐明。
AIPL1是一种四肽重复序列（TPR）蛋白，与人类XAP2（ARA9或小鼠AIP）具有49%的氨基酸同源性。1,11-13XAP2参与Hsp90介导的芳香烃受体（AhR）靶向核移位和反式激活。12-14除AhR外，许多信号转导蛋白，包括类固醇激素和原癌蛋白激酶的核受体，都需要Hsp70和Hsp90分子伴侣及其相关辅酶的协同活性来折叠和构象激活。Hsp90相关的多组分复合物包括耳蜗酮（XAP2、PP5和大的免疫亲和素CyP40、FKBP51和FKBP52），它们通过TPR域竞争性地识别高度保守的Hsp90 C末端MEEVD TPR受体结构基序。15-21
TPR是一个简并的34-氨基酸基序。22许多耳蜗TPR结构域的晶体结构表明，TPR结构区的整体结构是保守的。23-27cochaperone Hop TPR结构域的高分辨率晶体结构，与Hsp70的C端七肽（TIEEVD）和Hsp90的C端五肽（MEEVD）复合，预测TPR结构域中的氨基酸与结合肽保守EEVD序列中最终天冬氨酸残基的主链羧酸紧密静电相互作用，形成双羧酸钳。24一个类似的静电相互作用网络被证明可以介导FKBP52 TPR结构域与Hsp90 C末端五肽的相互作用。27AIPL1中TPR结构域的保守性，以及AIPL1与XAP2的相似性，导致了AIPL1可能作为一个参与Hsp90介导的信号转导的TPR cochaperone发挥作用。1,28,29然而，AIPL1与Hsp70/Hsp90依赖性蛋白质折叠机制的关联，或AIPL1和任一蛋白质的直接相互作用尚待证明。
在这里，我们报告了使用基于细胞质的酵母双杂交系统（CytolTrapXR；Stratagene，La Jolla，CA），然后进行蛋白质结合分析，以识别和确认AIPL1的新的相互作用伙伴。本研究首次描述了AIPL1与Hsp90和Hsp70的特异性关联。我们还试图通过评估这些蛋白在抑制NUB1片段内含物中的行为来展示这些蛋白在细胞中的作用。总之，我们的数据表明，AIPL1可能利用Hsp70和Hsp90伴侣机制的成分来实现其重要的光感受器特异性功能。
材料和方法
质粒
pGEX-2T-AIPL1、pCMV-Tag3C-AIPL1、pEGFP-C1-NUB1-N和pEGFP-C2-NUB1-C已经在前面进行了描述。7,30pCMV5-70是荷兰格罗宁根大学Harm H.Kampinga赠送的一份礼物。将全长人AIPL1 cDNA克隆到pSos（Stratagene）中以产生pSos-AIPL1。在pSos-AIPL1、pMyr-Hsp90中设计突变α（204-733）和pMyr-Hsp70（262-650）。所有质粒构建均通过测序确认（Big Dye Terminator；PerkinElmer Life Sciences，Wellesley，MA）。
抗体
兔多克隆抗血清抗AIPL1（Ab-hAIPL1）和抗NUB1（Ab-hNUB1）已经在前面描述过。7,30单克隆抗-c-myc公司克隆9E10（小鼠腹水）和单克隆抗Hsc70/Hsp70克隆BRM-22（小鼠腹液）购自西格玛（密苏里州圣路易斯）。小鼠抗Hsp70单克隆抗体（SPA810）、兔抗Hsc70多克隆抗体（PA816）和兔抗Hsp90多克隆抗体。小鼠抗Sos抗体购自BD Biosciences（加利福尼亚州帕洛阿尔托）。辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔或山羊抗鼠二级抗体购自皮尔斯生物技术公司（伊利诺伊州罗克福德）。
酵母双杂交筛
双杂交系统（CytolTrapXR；Stratagene）经改良后使用。31将与pMyr载体（Stratagene）中的肉豆蔻酰化序列融合的牛视网膜cDNA文库与诱饵质粒pSos-AIPL1共转化到酵母中酿酒酵母温度敏感突变株cdc25Hα.使用醋酸锂法转化酵母，32让其在24°C下恢复39小时，然后转移到37°C。在含有半乳糖（gal）但缺乏亮氨酸（−L）和尿嘧啶（−U）的合成培养基上，在37°C的限制温度下生长的酵母菌落被视为假定阳性，并进行了进一步测试。pSos-AIPL1质粒的阳性菌落被治愈，如果它们在37°C下仍能在gal（−U）平板上生长，则从筛选中排除。选择后，分离pMyr-cDNA质粒，测序，并用pSos-AIPL1重新转换成cdc25Hα确认互动。使用双杂交系统（CytoTrap；Stratagene）提供的各种pSo和pMyr结构作为阳性和阴性相互作用的对照。Cdc25H号α用pSos-AIPL1、pMyr-Hsp90转化α在合成培养基中培养pMyr-Hsp70（262-650）或其突变体，并根据制造商的说明，通过SDS-PAGE分离等量的酵母细胞提取物，然后分别用抗Sos、抗Hsp90和抗Hsp70抗体进行Western印迹，验证蛋白质表达。使用BCA蛋白质检测试剂盒（Pierce）测定蛋白质浓度。
细胞培养
SK-N-SH神经母细胞瘤细胞和COS7肾成纤维细胞样细胞在添加了10%胎牛血清和青霉素/链霉素（10000 U/mL；10000μg/mL）。Y79人视网膜母细胞瘤细胞在RPMI 1640和添加20%胎牛血清和50μg/mL庆大霉素（西格玛）。
尺寸-排除色谱法
将Y79视网膜母细胞瘤细胞重新悬浮在冰镇PBS和蛋白酶抑制剂混合物（PIC）中，与哺乳动物细胞和组织提取物（Sigma）一起使用，使用破坏者（德国海德堡HGM精密工程公司）在冰上进行机械破坏，并在13000离心克和4°C持续30分钟。细胞裂解物通过0.2过滤-μm过滤器（Nalgene，Rochester，NY），并应用于凝胶过滤柱（Superdex 200；GE Healthcare Life Sciences），在PBS中平衡。根据制造商的说明，使用试剂（蛋白质分析染料试剂浓缩物；加利福尼亚州Hercules Bio-Rad实验室）测定Y79裂解物的蛋白质浓度。在PBS中均质成人视网膜，并按照Y79裂解物的描述制备尺寸排除色谱（SEC）。所有样本都得到了知情同意，获得了机构审查委员会的批准，并遵循了《赫尔辛基宣言》的原则。通过PBS中的等速洗脱（1 mL/min）收集SEC组分，并通过SDS-PAGE解析每个组分的等分。使用增强化学发光的Western blot分析检测内源性NUB1、AIPL1、Hsp70、Hsc70和Hsp90（英国圣吉尔斯Chalfont GE Healthcare UK Ltd.）。使用已知分子量的标准蛋白质（Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ）获得校准曲线。标准为甲状腺球蛋白（M第页，669 kDa），脱铁蛋白（M第页，443 kDa），β-淀粉酶（M第页，200 kDa），白蛋白（M第页，150 kDa）和碳酸酐酶（M第页，66 kDa）。蓝色右旋糖酐（M第页，2000 kDa）用于确定柱排除体积。在预先校准的凝胶过滤柱（Superdex 200；GE Healthcare Life Sciences）上解析人类视网膜匀浆和Y79细胞裂解物。
亲和力下拉分析
GST和GST-AIPL1的重组表达在指数生长期的250-mL培养体积中诱导大肠杆菌通过添加异丙基的JM109细胞β-D-硫代半乳糖苷（IPTG；Sigma）的最终浓度为1 mM大肠杆菌收集细胞并在PBS和PIC中的冰上通过温和超声进行裂解，以用于细菌细胞提取物（Sigma）。通过离心（14000）去除细胞碎片克4°C下30分钟），上清液通过0.45-μm过滤器（Nalgene），并将其添加到PBS中的1 mL 50%谷胱甘肽Sepharose 4B（GE Healthcare Bio-Sciences AB，Uppsala，Sweden）浆液中。如前所述，对GST和GST-AIPL1进行亲和纯化。33随后的亲和力下拉分析如前所述进行33经过以下修饰：纯化的GST和GST-AIPL1以0.2的最终浓度与谷胱甘肽Sepharose 4B偶联μ在4°C下过夜。第二天早上，用正十二烷基溶解COS7细胞β-D-麦芽糖苷（DM；Sigma）裂解缓冲液（1%DM；5 mM EDTA，pH值8；用于哺乳动物细胞和组织提取物的PIC；在1×PBS中），可溶性蛋白质的浓度用试剂（蛋白质分析染料试剂浓缩物；Bio-Rad实验室）测定。在添加谷胱甘肽Sepharose 4B偶联GST和GST-AIPL1之前，在4°C的条件下，将300微克COS7细胞提取物在谷胱甘苷Sepharose4B上预处理1小时。分别用抗Hsp70和抗Hsp90检测与GST-AIPL1相关的内源性Hsp70及Hsp90。
免疫沉淀
神经母细胞瘤细胞（5×105SK-N-SH）在六孔板（BD Biosciences）中每孔播种。20小时后，pCMV5-70（0.5μg） 在pCMV-Tag3C-AIPL1（0-1）缺乏和增加的情况下瞬时转染μg） ，并用适量的pCMV-Tag3C质粒保持等量（1.5μg） 每次转染时，使用试剂（Lipofectamine Plus；Invitrogen）检测总DNA。瞬时转染后24小时，用冰镇PBS冲洗SK-N-SH细胞两次，并在DM裂解缓冲液（300μL/well）在冰上放置15分钟。将裂解产物离心（13000克在4°C下放置30分钟），并去除上清液。Myc-AIPL1从SK-N-SH裂解物中免疫沉淀（250μ五十） 带反c-myc公司(2μL小鼠腹水）在4°C下过夜。蛋白质G Sepharose 4快速流动（GE Healthcare Bio-Sciences AB；50μ将在DM裂解缓冲液中平衡的L（50%浆液）添加到4°C下的裂解产物中3小时。免疫复合物在冰镇DM裂解缓冲液中洗涤五次，通过离心回收，并在样品缓冲液中洗脱（0.0625 M Tris-HCl，pH 6.8；2.5%SDS；5%2-巯基乙醇；10%甘油；0.25%溴酚蓝）。通过蛋白质印迹分析在输入和与抗AIPL1和抗Hsp70/Hsc70或抗Hsp70的免疫复合物中检测到Myc-AIPL1和Hsp70。如有必要，在增加离子强度或5 mM三磷酸腺苷（ATP）/Mg的情况下，检测SK-N-SH细胞中Hsp70与myc-AIPL1的联合免疫沉淀2+（西格玛）。
NUB1包裹体形成
神经母细胞瘤细胞（2×104SK-N-SH）在每口井的八个室载玻片中播种（Perminox；BD Biosciences）。20小时后，使用试剂（Lipofectamine Plus；Invitrogen）将50 ng pEGFP-C1-NUB1-N或pEGFP-C2-NUB1-C与pCMV-Tag3C-AIPL1、pCMV5-70或两者结合，瞬时转染细胞。pEGFP-C1-NUB1-N或pEGFP-C2-NUB1-C以1:2（50:100 ng）的比例与其他质粒共转染。通过添加空的pCMV-Tag3C，转染的DNA总量（250 ng）保持不变。瞬时转染24小时后，将细胞固定或用载体处理，5μ格尔德霉素（GA；Sigma），或50μM MG132（Biomol International，Exeter，UK）治疗4小时。如前所述，用GA或MG132处理后，细胞固定，并计数GFP-NUB1-N和GFP-NUB1-C包涵体形成。7未付费学生的t吨-测试用于确定统计显著性水平。用激光扫描共焦显微镜（LSM510；卡尔蔡司，德国Oberkochen）观察细胞。在MG132存在下，AIPL1增强Hsp70效应的百分比被计算为AIPL1和Hsp70抑制包裹体的百分比与Hsp70单独抑制包裹体百分比之间的差异。
结果
酵母双杂交分析鉴定AIPL1-结合蛋白
为了确定AIPL1的潜在结合伙伴，我们使用全长人类AIPL1（氨基酸1-384）作为诱饵，使用酵母双杂交系统（CytoTrapXR；Stratagene）筛选牛视网膜cDNA文库。该系统能够根据hSos融合到膜的补充和Ras温度敏感突变酵母菌株中随后的互补来鉴定细胞质中的蛋白质相互作用，从而允许细胞在限制温度下生长。传统的酵母双杂交系统基于转录因子的模块化组成，需要相互作用伙伴的核定位才能获得报告基因表达。由于每个系统中表达的融合蛋白的构象差异和稳定性、亚细胞靶向性以及对不同亚细胞定位的适应性，这些系统中的每个系统都可能识别新的相互作用伙伴。因为AIPL1主要定位于细胞和感光细胞的细胞质中，30本研究使用酵母双杂交系统（CytolTrapXR；Stratagene）鉴定细胞质中与AIPL1相互作用的新蛋白。
该屏幕确认NUB1为AIPL1互动伙伴（数据未显示）。然而，具有C末端CAAX丙酰化基序的蛋白质8在酵母双杂交系统（CytolTrapXR；Stratagene）筛选中未检测到作为假定的相互作用物，原因尚不清楚，但这可能反映了诱饵的肉豆蔻酰化膜靶向性，而不是法尼基化的正常细胞位点。重要的是，在AIPL1和分子伴侣之间发现了一种新的相互作用。在约1×10的筛选条件下，在37℃的限制温度下选择酵母生长，鉴定出10个表达Hsp90的cDNA和1个表达Hps70的cDNA6聚居地。9个Hsp90 cDNA被鉴定为Hsp90的两个不同克隆α（对应于人类HSP90AA1）编码氨基酸残基204至733或426至733，并指定为Hsp90α（204-733）和Hsp90α（426-733）。一个克隆被鉴定为Hsp90β（对应于人类HSP90AB1），包括残基198至724（Hsp90β[198-724]），并且一个克隆被鉴定为Hsp70（对应于人HSPA8），包括残基262至650（Hsp70[226-650]）。
Hsp90α（204-733）和Hsp70（262-650）克隆用于定向双杂交相互作用。当与pSos-AIPL1共转化时，Hsp90和Hsp70都能在37℃的限制温度下生长，但当仅与pSos共转化时则无法生长(). Hsp90的生长与pMyr SB+pSos阳性对照的生长相当；然而，使用pSos-AIPL1的Hsp70生长速度慢于Hsp90或pMyr-SB().
体内AIPL1与Hsp90和Hsp70的相互作用。酵母（cdc25Hα)与pMyr-SB和pSos（阳性对照）共转化，以及与pMyr-Hsp70（262-650）或pMyr-Hsp90共转化的空pSos或pSos-AIPL1α（204-733），并在24°C或37°C的选择性培养基中生长。
评估了各种pSos-AIPL1突变体与Hsp90和Hsp70相互作用的能力(). 测试了与LCA发病机制相关的序列变化（H82Y、A197P、C239R、G262S、W278X、R302L）。1,34,35G262S和R302L能够与这两种分子伴侣相互作用，类似于野生型蛋白，而H82Y似乎与Hsp70的生长略有下降。相反，A197P、C239R和W278X在37°C时无法生长(). 每个AIPL1致病性突变hSos融合蛋白在等量的cdc25H中以相似的水平表达α酵母细胞提取物，但R302L和W278X除外，R302L的表达量高于野生型AIPL1和W278().
AIPL1致病性、TPR和域映射突变体与体内Hsp90或Hsp70的相互作用。(A类)酵母（cdc25Hα)与pMyr-SB和pSos（阳性对照）、空猎物载体pMyr和pSos-AIPL1（阴性对照）、pSos-AIPL1或pSos-AIPL1突变体与pMyr-Hsp70（262-650）或(B类)pMyr-Hsp90型α(204-733). 连续稀释（稀释系数1-20三)测试了它们在37°C或24°C下的生长能力。(C)用pSos-AIPL1、pSos-AIPL1突变体或单独pSos转化酵母，并通过Western blot分析评估蛋白质表达*与LCA发病机制相关的序列变化。
在特定功能域中设计了三个额外的序列变体。赖氨酸265突变为丙氨酸（K265A）。该残基在拓扑上等同于PP5（K97A）、小鼠AIP（K266A）、CyP40（K308A）、FKBP51（K352A）和FKBP52（K354A）。在每个蛋白质的TPR结构域的这个位置保守的赖氨酸残基是与Hsp90中的C末端MEEVD序列相互作用所必需的。36-39根据FKBP51（N404）和FKBP52（N406）截短突变体中观察到的Hsp90结合缺失，进一步设计了一个改变（E317X），将序列C末端移除到TPR域核心结构。25,39对AIPL1中的拓扑等效残基进行突变（E317X），以测试AIPL1 TPR核心域下游序列的要求。最后，人类AIPL1的C末端（残基329-384）在灵长类动物中不完全保守，但在非灵长类中不存在。40设计AIPL1突变体Q329X以评估该区域对伴侣相互作用的重要性。
AIPL1-TPR突变体K265A的表达水平相当于野生型AIPL1(). 然而，与野生型AIPL1相比，与Hsp90和Hsp70的相互作用减少(). 带有Hsp90和Hsp70的AIPL1 TPR突变体E317X的生长不受影响(). AIPL1灵长类特异性区域（Q329X）的去除严重降低了cdc25H中AIPL1的表达α因此，在限制性温度下无法支持生长，这表明人类AIPL1的灵长类特异性区域可能需要作为hSos融合蛋白的一部分稳定表达人AIPL1().
为了进一步探讨AIPL1与Hsp90和Hsp70相互作用的TPR依赖性，C末端Hsp90 MEEVD（pMyr-Hsp90α（ΔMEEVD）和Hsp70-TIEEVD（pMyr-Hsp70（ΔTIEEVD））TPR受体基序被截断(). 在定向双杂交相互作用中，酵母与pSos-AIPL1和pMyr-Hsp90共转化生长α与Hsp90相比，（ΔMEEVD）或Hsp70（ΔTIEEVD）严重降低α（204-733）或Hsp70（262-650），即使Hsp90α（204-733）和Hsp70（262-650）的表达水平与cdc25H中野生型蛋白的表达水平相似α酵母细胞提取物(). 这些数据支持TPR介导的AIPL1与Hsp90和Hsp70的结合，并表明AIPL1的致病突变可以破坏这种相互作用。
AIPL1与Hsp90和Hsp70在伴侣C末端TPR受体位点截断上的相互作用。(A类)酵母与pSos-AIPL和pMyr-Hsp90共转化α（204-733），pMyr-Hsp90α（ΔMEEVD）、pMyr-Hsp70（262-650）或pMyr-Hsp70（ΔTIEEVD）。评估了酵母在限制温度37°C和允许温度24°C下的生长能力。(B类)通过Western blot分析评估伴侣野生型和C末端截断突变体的表达。
Y79视网膜母细胞瘤细胞裂解液中AIPL1伴侣异构体的组成
为了评估内源性AIPL1和分子伴侣的潜在杂合物，对Y79视网膜母细胞瘤细胞进行机械破坏，并通过尺寸排除色谱分离粗细胞部分。Y79细胞表达内源性AIPL1，并被描述为具有几种类似感光细胞的特性。41检测AIPL1、NUB1和分子伴侣Hsp90、Hsc70和Hsp70的分离。
Y79细胞提取物中的AIPL1在150至200 kDa的主要复合物中被回收(). 通过分离人视网膜匀浆证实了在这种大小的主要复合体中内源性AIPL1的洗脱(). 在Y79细胞提取物中检测到两个伴侣相关的分离峰(). 在第一个主峰中，内源性AIPL1与分子伴侣Hsp70（150-200 kDa；分数25-26；). 在第二个峰值中，分子伴侣Hsp90α/β分馏至约400至650 kDa的分子质量（分数18-21；). AIPL1结合蛋白NUB1与Hsp90共分离α/β（分数19-20）。长期暴露表明，在Hsp90中检测到AIPL1和Hsp70α/β高分子质量分数(). 因此，在主要Hsp90中检测到的所有成分都处于不同水平α/β分馏峰，包括NUB1、AIPL1和Hsc70/Hsp70。这些数据表明细胞内AIPL1伴侣杂合物成分的瞬时和动态关联。
Y79视网膜母细胞瘤细胞中AIPL1伴侣杂合物的组成。(A类)如图所示，将机械破坏的Y79细胞或均质人类视网膜的可溶性部分应用于预先校准的凝胶过滤柱。(B类)Y79可溶性细胞提取物通过SEC在预先校准的凝胶过滤柱上分离，通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blot分析检测内源性AIPL1、Hsp70、Hsc70、Hsp90和NUB1。分数和分子量标记（kDa）显示在每个面板上方。
AIPL1与分子伴侣的体外相互作用
体外生化分析用于验证AIPL1与分子伴侣的相互作用。GST-AIPL1的能力(; 考马斯）亲和捕获来自COS7细胞裂解物的Hsp90和Hsp70。Hsp90和Hsp70不被谷胱甘肽Sepharose或GST捕获(; 珠子、GST）。内源性Hsp90和Hsp70被纯化的GST-AIPL1亲和捕获(; GST-AIPL1），表明AIPL1可以与内源性Hsp90和Hsp70相关。此外，Hsp70与AIPL1以浓度依赖的方式共同免疫沉淀(). 从转染SK-N-SH细胞裂解液中免疫沉淀myc-AIPL1复合物-myc公司9E10抗体。在缺乏AIPL1的情况下，免疫复合物中未检测到Hsp70(). 随着myc-AIPL1数量的增加，Hsp70被特异性免疫沉淀(). Hsp70与AIPL1的相互作用因离子强度增加而中断，但不受ATP/Mg的影响2+表明野生型AIPL1未被认为是Hsp70伴侣功能的错误折叠底物()与AIPL1通过其TPR基序与Hsp70结合一致。
使用体外蛋白结合分析表征AIPL1伴侣相互作用。(A类)内源性Hsp90和Hsp70与GST-AIPL1的亲和力下拉。GST和GST-AIPL1在谷胱甘肽Sepharose 4B上亲和纯化(降低; 考马斯染色）。将COS7细胞裂解物应用于GST（GST）或GST-AIPL1（GST-AIP1）预结合到谷胱甘肽Sepharose 4B。用抗Hsp90或抗Hsp70检测GST-AIPL1拉下的内源性Hsp90和Hsp70(上面的; Western blot）。分子量标记以kDa为单位。(B类)Hsp70与myc-AIPL1的免疫共沉淀。Myc-AIPL1从转染SK-N-SH裂解物中免疫沉淀-myc公司9E10。Myc-AIPL1和Hsp70分别与抗AIPL1和抗Hsp70/Hsc70在输入和免疫复合物中检测到。(C)在增加离子强度或ATP/Mg的情况下，检测SK-N-SH细胞中Hsp70与myc-AIPL1的免疫共沉淀2+.
GA对AIPL1伴侣活性的影响
为了研究这些伴侣对AIPL1功能的影响，在我们实验室之前建立的体外AIPL1分析中测试了伴侣抑制和过度表达的效果。7AIPL1能够以浓度依赖的方式抑制由GFP-NUB1-N和GFP-NUB1-C片段的聚集引起的内含物的形成。7为了探讨Hsp90在这一过程中的潜在参与，在无AIPL1和有AIPL1的情况下，用载体或Hsp90 ATP酶抑制剂GA处理表达这些聚集蛋白片段的细胞。GA治疗限制在4小时内，以尽量减少延长GA治疗后诱导的其他分子伴侣（如Hsp70）的混杂影响。42在没有AIPL1的情况下，用载体或GA处理4小时后，含有GFP-NUB1-N和GFP-NUB1-C内含物的转染细胞的百分比似乎增加，这表明随着时间的推移形成了更多内含物；然而，这并没有达到统计显著性(P（P）> 0.1). 如前所示，在AIPL1的存在下，GFP-NUB1-N和GFP-NUB1-C内含物的形成受到抑制(; AIPL1）。7用载体或GA治疗后，AIPL1存在时GFP-NUB1-N和GFP-NUB1-C内含物的百分比没有显著差异(P（P）> 0.1). 因此，AIPL1介导的GFP-NUB1-N和GFP-NUB1-C内含物的抑制似乎不受GA的影响，这表明Hsp90可能不参与这一过程。
Hsp90 ATP酶抑制剂GA对AIPL1伴侣活性的影响。GA对AIPL1介导的抑制(A类)GFP-NUB1-N夹杂物和(B类)GFP-NUB1-C夹杂物。在未接受治疗的情况下（未接受治疗，0小时），以及使用载体或5μM GA.误差条为±SD。未配对学生的t吨-测试用于确定统计显著性水平。
Hsp70与AIPL1协同抑制NUB1聚集
由于Hsp70参与蛋白质折叠和降解过程，并且NUB1片段可能是蛋白酶体降解的靶点，因此我们测试了AIPL1和Hsp70可以合作抑制NUB1片段聚集的假设。我们检测了在Hsp70存在下，AIPL1介导的抑制NUB1片段包涵体形成的作用，包括或不包括蛋白酶体抑制剂MG132().
Hsp70参与AIPL1伴侣活动。(A类)描述GFP-NUB1-N（CON）形成的免疫荧光共聚焦显微镜(上面的)或GFP-NUB1-C（CON）(降低)如图所示，在MG132缺失（−MG132）和存在（+MG132。比例尺，10μM.细胞计数描述了(B类)GFP-NUB1-N和(C)GFP-NUB1-C内含物单独存在（CON），或存在AIPL1、Hsp70或AIPL1+Hsp70时，不存在MG132。误差线为±SD(D类)AIPL1和AIPL1突变体增强Hsp70效应。误差线为±SD。
在没有MG132的情况下，GFP-NUB1-N形成多个小包涵体，修饰转染细胞的核周区域，而GFP-NUB1-C形成大的核内包涵体(; −MG132；CON），如前所述。7AIPL1和Hsp70分别能够降低GFP-NUB1-N和GFP-NUB1-C内含物的发生率；然而，Hsp70的效率低于AIPL1(; −MG132；热休克蛋白70；AIPL1）。通过AIPL1和Hsp70的组合，对GFP-NUB1-N和GFP-NUB1-C内含物的抑制已经达到最大，并且类似于单独的AIPL1抑制内含物形成的能力(; −MG132；AIPL1+Hsp70）。
在蛋白酶体抑制剂MG132存在下，几乎所有转染GFP-NUB1-N和GFP-NUB1-C的细胞中都观察到内含物(; +MG132；CON）。MG132存在时GFP-NUB1-N和GFP-NUB1-C内含物的急剧增加支持了之前的观察，即GFP-NUB-N和GFP-NUB1-C内含体与细胞中的泛素和Hsp70共定位，从而证明这些片段是蛋白酶体降解的靶点，并在聚集和降解失败时形成内含物。7在MG132存在下，AIPL1或Hsp70单独能够抑制GFP-NUB1-N和GFP-NUB1-C内含物的形成(; +MG132），比没有MG132的情况下要小。当AIPL1和Hsp70同时存在时，MG132对GFP-NUB1-N和GFP-NUB1-C内含物的抑制更大。在AIPL1和Hsp70存在的情况下，仅在约30%的细胞中观察到GFP-NUB1-N内含物(; +MG132；在23%的细胞中观察到AIPL1+Hsp70）和GFP-NUB1-C内含物(; +MG132；AIPL1+Hsp70）。因此，AIPL1和Hsp70共同抑制GFP-NUB1-N和GFP-NUB1-C的聚集比AIPL1或Hsp70单独抑制更有效，表明AIPL1与Hsp70协同抑制NUB1片段内含物的形成。
接下来，我们想评估Hsp70与AIPL1突变体合作抑制GFP-NUB1-N和GFP-NUB1-C内含物的能力。为了确定AIPL1对Hsp70效应的增强作用，从AIPL1和Hsp70同时存在的包裹体抑制百分比中减去仅由Hsp70介导的包裹体的抑制百分比(). 数据显示，除W278X和E317X外，每个AIPL1突变体都能够增强Hsp70的作用，并与Hsp70协同抑制GFP-NUB1-N内含物(). W278X和E317X无法增强Hsp70介导的对GFP-NUB1-N内含物的抑制（Hsp70效应增强，0%），并且与Hsp70单独抑制内含物的能力没有差异。有趣的是，Q329X的效率明显较低(P（P）与野生型AIPL1相比，W278X和E317X C末端截断突变体没有表现出完全缺乏这种活性。相比之下，H82Y的效率明显更高(P（P）<0.05）。这些数据与之前关于AIPL1突变对GFP-NUB1聚集的影响的研究相关，这些研究表明H82Y过度活跃，C末端截断活性降低（Q329X）或无活性（W278X，E317X）。7,43
讨论
酵母双杂交分析显示全长人AIPL1与Hsp90和Hsp70相互作用，并且这些相互作用通过体外生化分析进行了验证。酵母双杂交分析表明，AIPL1与Hsp70的相互作用似乎弱于与Hsp90的相互作用，对AIPL1突变体的分析表明，在AIPL1和两种分子伴侣的相互作用中，存在相似的结构特征。
虽然AIPL1与Hsp90和Hsp70的相互作用是基于其与某些特征明确的Hsp90相互作用免疫亲和蛋白的同源性以及TPR结构域的存在，但之前的酵母双杂交研究并未确定AIPL1和这两个伴侣中的任何一个相互作用。2,8然而，与传统的酵母双杂交系统不同，这些（CytoTrap；Stratagene）相互作用发生在细胞质而不是细胞核中，消除了诱饵融合蛋白靶向细胞核的要求。筛选（CytoTrap；Stratagene）确定了特征良好的AIPL1相互作用子NUB1和新的相互作用子Hsp70和Hsp90，证实了系统（CytoStrap；Stratagene）的有用性用于确认先前检测到的相互作用和识别不适合常规核双杂交系统检测的新型相互作用体。
对AIPL1中LCA致病突变的分析表明，A197P、C239R和W278X破坏了与Hsp90和Hsp70的相互作用。AIPL1（W278X）发生错误折叠和聚集，并已证明形成SDS不溶性包裹体。7AIPL1致病性突变体A197P和C239R在酵母中的表达水平与野生型AIPL1相当，但未能与Hsp90和Hsp70相互作用。在哺乳动物细胞中，A197P和C239R在亚细胞分布和表达水平上与野生型AIPL1相似，但有限的胰蛋白酶蛋白水解表明A197P与C239R与天然AIPL1蛋白在结构上存在差异。7,8AIPL1 TPR结构域的结构模型预测，A197发生在TPR1中螺旋B的位置20，C239发生在TPR2中螺旋A的位置10().8这些残基在耳蜗酮的TPR基序中高度保守，表明这些残基可能对AIPL1与分子伴侣的TPR介导的相互作用很重要().
结合Hsp90或Hsp70的蛋白质的TPR结构域的比对。粗体的残留物是TPR共识的一部分，需要用于相邻TPR的包装α-螺旋线（螺旋线A和螺旋线B）。根据Hop TPR2A和TPR1分别与Hsp90 MEEVD和Hsp70 PTIEEVD的晶体结构，预测TPR残基将参与与EEVD基序形成紧密静电相互作用。24根据FKBP52与Hsp90 MEEVD的晶体结构，下划线的残基预计会通过紧密的静电相互作用形成肽结合囊。27赖氨酸残基，由星号，是AIPL1（K265A）中靶向的TPR残留物。带圆圈残基是之前与发病相关的TPR域中的AIPL1突变，并在我们的酵母双杂交筛选中测试了Hsp90结合，包括A197P、C239R、G262S和W278X。在我们的筛查中检测到的其他与发病机制相关的突变（H82Y和R302L）不在所描述的区域内。
AIPL1疾病相关氨基酸替换物H82Y、G262S和R302L能够与Hsp90和Hsp70相互作用，具有与野生型融合蛋白相似的表观亲和力，表明这些替换不会严重破坏AIPL1与分子伴侣的相互作用。H82Y和R302L氨基酸的变化在其发病状态方面存在争议。35,43AIPL1 H82Y突变最初被描述为LCA患者的杂合性改变，34R302L可能不是AIPL1的致病变体，而是一种罕见的良性变体，因为其他物种的该位置存在非保守残基。35因此，需要对患者/人群的DNA和蛋白质进行进一步分析，以确定这些序列变化的状态。
进一步分析揭示了AIPL1 TPR结构域在与分子伴侣相互作用中的重要性。AIPL1（K265A）与Hsp90和Hsp70的相互作用减弱。C末端Hsp90 MEEVD或Hsp70 TIEEVD TPR受体位点的去除也严重降低了与AIPL1的相互作用。预计与Hsp90和Hsp70的C末端TPR受体位点紧密静电相互作用的残基的身份在Hop、PP5、CyP40、FKBP51、FKBP 52和XAP2 TPR结构域中几乎完全保守。36-39我们的数据和AIPL1中这些残基的保存()表明AIPL1是真正的Hsp90和Hsp70 TPR复写纸。
AIPL1（E317X）与Hsp90和Hsp70的相互作用不受影响。相反，在拓扑等效残基处截短FKBP51和FKBP52大大减少了Hsp90与孕酮受体的结合和联系。39这些数据表明，AIPL1 TPR核心结构域的C末端序列对于AIPL1识别分子伴侣是不必要的。
去除AIPL1灵长类特异性区域会严重降低酵母中Q329X的表达，这表明人类AIPL1的灵长类特异性区域可能是在我们的酵母双杂交筛选中稳定表达所必需的。有趣的是，缺少最后56个氨基酸的人类AIPL1以前曾用于GAL4酵母双杂交筛选，并且能够与该筛选中确定的假定相互作用物相互作用。8这种差异可能是由于GAL4和CytoTrap（Stratagene）酵母双杂交系统之间的实验差异造成的，包括每个系统中表达的融合蛋白及其亚细胞靶向性和稳定性的差异。支持56-氨基酸多聚脯氨酸丰富区域在灵长类视觉中重要性的证据包括突变A336Δ2和P351Δ12分别导致LCA和常染色体显性圆锥型营养不良或青少年视网膜色素变性。1,35
许多其他TPR耳蜗已被证明与Hsp90和Hsp70相互作用。Hsp90相互作用的TPR同系物XAP2和CyP40已被证明与Hsc70相互作用。44,45与Hsc70的C-末端羧酸盐的相互作用需要保持引导CyP40与Hsp90相互作用的相同静电相互作用网络，尽管CyP40与AIPL1类似，显示出与Hsp90的结合优先于Hsc70。44
AIPL1与分子伴侣的相互作用使我们评估这些相互作用是否在AIPL1介导的NUB1功能调节中发挥作用。Hsp70与AIPL1共同作用于NUB1片段聚集对蛋白酶体抑制的伴侣样抑制。据报道，FKBP52和XAP2也具有类似伴侣的活性，其中每一种都能抑制罗丹宁和柠檬酸合成酶的热聚集。45-47Hsc70在这种伴侣样活性中似乎与XAP2合作，因为XAP2和Hsc70联合抑制柠檬酸合成酶的聚集比单独抑制Hsc70更有效。45我们的数据表明，NUB1片段是蛋白酶体降解的底物，野生型AIPL1能够与Hsp70合作，以增强这些错误折叠片段的Hsp70介导的蛋白酶体靶向性。我们之前证明，AIPL1介导的NUB1核转位调控和NUB1内含物抑制需要AIPL1的C末端区域。7在这里，我们扩展了这些发现，并表明AIPL1的C末端区域介导的功能性NUB1调制同样需要与Hsp70结合才能发挥作用。虽然AIPL1 TPR突变A197P、C239R和K265A以及Hsp70-TIEEVD基序的缺失降低了AIPL1与Hsp70之间TPR介导的相互作用，但AIPL1 C末端截断影响了AIPL与Hsp70-在抑制NUB1内含物中的协同作用。这些数据表明，AIPL1和Hsp70的独特伴侣活性协同抑制依赖于AIPL1 C末端区域的NUB1内含物，并且这与TPR介导的AIPL1与Hsp70相互作用无关。GA对Hsp90 ATP酶活性的抑制并不影响AIPL1对NUB1片段聚集的抑制。基于GA处理将Hsp90客户蛋白的平衡从Hsp90介导的蛋白质折叠转变为Hsp70介导的降解的模型，48我们的数据表明，NUB1片段是Hsp70介导的蛋白质降解的底物，但不是AIPL1-Hsp90蛋白折叠伴侣机制的真正客户蛋白。虽然Hsp70介导的蛋白酶体降解通常以错误折叠的蛋白质为目标，但Hsp90 foldosome以客户蛋白的特定子集为目标，包括信号转导核受体和特定信号激酶，其身份依赖于Hsp90相关的辅酶。因此，我们建议，尽管该模型并不排除NUB1作为AIPL1-Hsp90折叠机器的客户，但一种光感受器特异性AIPL1-Hsp90客户蛋白尚未确定。
总之，尽管本研究中确定的相互作用的生理相关性需要在体内进一步表征，但我们的数据表明，AIPL1在光感受器中的特殊作用可能受到分子伴侣Hsp90和Hsp70的调节，并且这种关联可能在LCA的发病机制中很重要。还需要进一步的实验来研究AIPL1是否直接作为体内光感受器特异性Hsp70-Hsp90杂合物的一部分发挥作用，该杂合物可以伴随几个蛋白质直接调节其折叠、稳定性、组装成多蛋白复合物或降解。例如，AIPL1部分或完全缺失的LCA小鼠模型显示PDE全酶水平在转录后降低，PDE全酶是视觉光转导的重要组成部分。AIPL1可能伴随PDE亚基的生物合成或组装，或保护其免受蛋白酶体降解。9,10,28AIPL1可能通过与分子伴侣Hsp70和Hsp90的相互作用来调节PDE。现在，重要的是要确定这种情况是否属实，并确定AIPL1与光感受器中这些分子伴侣的关联，并剖析这些蛋白在LCA发病机制中的潜在参与。
致谢
作者感谢Tatyana Novoselova和Alison Hardcastle在CytoTrapXR酵母双杂交筛选和H.H.Kampinga提供质粒pCMV5-70方面的实际帮助和建议。他们还感谢Action Medical Research和Wellcome Trust提供的资金支持。
由威康信托项目拨款GR077929MA和行动医学研究拨款SP4014支持。
脚注
披露：J.伊达尔戈-德金塔纳，无；R.J.埃文斯，无；M.E.契特姆，无；J.范德斯普，无
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