婴儿暴露于环境金属铅（Pb）后老年猴的阿尔茨海默病（AD）样病理学：AD的发育起源和环境联系的证据

总RNA分离、cDNA合成和实时PCR。

根据TRIzol方法（Invitrogen，加利福尼亚州圣地亚哥）从各种对照和暴露猴皮层组织中分离出RNA。RNA被逆转录以获得cDNA，由SuperScript III逆转录酶（RT）催化。含有500 ng总RNA、1μl 10 m总RNA的RNA/引物混合物米dNTP混合物和1μl低聚dT在65°C下孵育5分钟。含有2μl 10×RT缓冲液（200 m米三氯化氢，pH 8.4，500 m米KCl），4μl，25 m米氯化镁₂，2微升，共0.1微升米DTT，并添加1μl RNaseOUT重组RNase抑制剂（40 U/μl）。然后加入1微升SuperScript III RT（200 U/μl），并在50°C下孵育50分钟。在85°C下终止反应5分钟。加入1微升RNase H，并在37°C下孵育反应20分钟。将得到的cDNA存储在−20°C下，并用于实时PCR步骤。用于APP、Sp1、β位点APP裂解酶1（BACE1）和GAPDH的引物对如下：Sp1，sense，5′-CAA GCC CAA ACA ATC ACC TT-3′，以及反义，5′-CAA TGG GTG TGA GAG TG-3′；BACE1，正，5′-TTT GTG GAG ATG GTG GAC AA-3′，反义，5′-CAG CAC CCA CTG CAA AGT TA-3′；APP，正，5′-GCT GGC TGA ACC CCA GAT-3′，反义，5′-CCC ACT TCC CAT TCT GGA CAT-3′；GAPDH，正，5′-TGA AGC AGG CGT CGG AGG G-3′，反义，5′-CGA AGG TGG AAG AGT GGG TG-3′。每个实时PCR混合物包含1μl cDNA，1μl引物混合物（最终浓度，200 n米)10.5μl无核水和12.5μl SYBR GREEN PCR Master Mix（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）。每个样品有三份。按照标准方案，在7500 Real-time PCR系统中使用各自的引物对上述所有基因进行实时PCR，即50°C持续2分钟，然后95°C持续10分钟，然后40个95°C循环15秒，60°C持续1分钟。用琼脂糖凝胶检查实时PCR产物，以确认没有形成非特异性产物。结果用7500系统软件进行分析，采用相对定量法，以GAPDH为内生对照。还使用了其他管家基因，如β-肌动蛋白。

Aβ1-40和Aβ1-42测定。

使用人类Aβ（1-40和1-42）检测试剂盒（日本群马免疫生物实验室）测量Aβ水平。这些试剂盒设计为含有两种高度特异性抗体的固相夹心ELISA试剂盒。根据以下描述的方法遵循分析条件Morishima-Kawashima等人（2000年），稍作修改。在Tris生理盐水（TS）中均匀化脑组织[50 m米Tris-HCl缓冲液，pH 7.4，150 m米氯化钠，1μg/ml TLCK(N个-α-第页-对甲苯基-我-赖氨酸氯甲基酮），1μg/ml抗蛋白酶，0.5 m米DIFP（氟磷酸二异丙酯），0.5 m米PMSF，0.1%蛋白酶抑制剂混合物]，10万×离心克在4°C下保持20分钟。将颗粒重新悬浮在4 vol TS中，并在70000×克在4°C下保持20分钟。将所得颗粒溶解在500μl的6米盐酸胍（50 m米Tris缓冲液，pH 7.6），室温培养30分钟，70000×离心克在4°C下保持20分钟。收集所得上清液，并用酶免疫分析（EIA）缓冲液（随试剂盒提供）稀释至12倍，以降低样品盐酸胍浓度，并将等分样品（100μl EIA缓冲液中含有200μg蛋白质）和分析标准物添加到96 well板中[预先涂有抗人aβ（35–40）（1A10）小鼠IgG单抗]并在4°C下培养过夜。使用EIA缓冲液对油井进行了七次清洗。然后，将100μl标记抗体添加到每个含有样品或标准品的微孔中，并在4°C下孵育1 h。用EIA缓冲液清洗微孔9次，然后添加100μl TMB缓冲液，并在室温下在黑暗中孵育30 min。加入100μl 1N H停止反应₂SO公司₄在450nm处进行比色吸收。根据每个平板上生成的标准曲线，计算测试样品中的Aβ水平。

免疫组织化学。

研究了APP、SP1和Aβ在对照组（Con）和发育期暴露于Pb（Pb-E）的23岁食蟹猴的石蜡包埋脑组织中的细胞分布。切片在1×PBS和3%过氧化氢中进行短暂清洗。清洗后，将切片在含有2%BSA和1%Triton X-100封闭溶液的PBS中培养30分钟，然后在存在APP（22C11；1:200；西格玛，密苏里州圣路易斯）、Aβ（6E10；1:50；西格马）或SP1（SC-59；1:100；圣克鲁斯生物技术，加利福尼亚州圣克鲁斯）的一级抗体的情况下在4°C下培养过夜。用PBS清洗切片，并与物种特异性生物素化二级抗体小鼠/兔子（1:200；Vector Laboratories，Burlingame，CA）一起培养30分钟。用链霉亲和素（Vector Laboratories）培养切片30分钟，用PBS短暂冲洗，用底物DAB（3–3′-二氨基苯扎定-四氯化氢）（Vector Laboratories）检测免疫反应性。盖玻片采用永久性安装介质（Vector Laboratories）进行安装。

在所有情况下，通过省略初级抗体培养，在每只动物的玻片上进行阴性对照。仅在二级抗体中培养组织后，无明显信号。

核蛋白提取。

根据以下描述的方法，从对照组和Pb暴露动物的额叶联合皮质组织中提取核蛋白Dignam等人（1983年），稍作修改。用1 ml PBS（pH 7.4）均质组织样品，并在2500×克在室温下保持10分钟。将获得的颗粒悬浮在5 vol缓冲液A（10 m）中米pH值为7.9，1.5 m时的HEPES米氯化镁₂，0.5米米DTT，0.5米米EDTA和0.2米米PMSF）并在6000×克在4°C下保持2分钟。将颗粒重新悬浮在3 vol缓冲液A中，并在6000×克在4°C下保持2分钟。然后将所得颗粒重新悬浮在5 vol缓冲液C（20 m）中米pH值为7.9，1.5 m时的HEPES米氯化镁₂，0.5米米DTT，0.5米米EDTA，420米米氯化钠，20%甘油，0.2米米PMSF、0.002 mg/ml抑肽酶和0.0005 mg/ml亮蛋白胨）并匀浆。最终悬浮液在12000×克将上清液转移到1.5 ml试管中，在乙醇干冰浴中快速冷冻，并在−80°C下储存(Basha等人，2005年).

原代小鼠皮层神经元细胞培养。

由于我们研究的动物年龄为23岁，并且我们没有早期的时间点来测量分子或表观遗传学变化的进展，我们使用细胞培养模型来解决一些机制问题。我们使用C57BL/6小鼠作为初级胎儿皮层神经元的来源，因为这种遗传背景菌株广泛用于各种转基因小鼠AD模型。使用C57BL/6小鼠（马萨诸塞州威明顿市查尔斯·里弗实验室）胎鼠进行初级皮层神经元培养。动物使用得到了罗德岛大学动物护理和使用委员会的批准（批准号AN00-01-007）和监督。切除同一母鼠第15天的幼鼠的大脑，并解剖其皮层。移除脑膜，并将皮层组织在37°C的5 ml含木瓜蛋白酶的HBSS（2 mg/ml）中培养15分钟。组织以125×克持续5分钟，将所得颗粒重新悬浮在HBSS中，并通过燃烧抛光的巴斯德吸管研磨细胞，使其分离，然后重复三次。离心后，细胞以6.5×10的恒定密度进行培养⁴/嗯，在24孔聚合物中-d日-赖氨酸预涂层板。电镀介质含有2%B27，0.5 m米[scap（风景）]我-谷氨酰胺和25μ米神经基础培养基（Invitrogen）中的谷氨酸，并在5%CO的湿化环境中保持在37°C₂培养4d后，用不含谷氨酸的新鲜培养基替换一半培养基，并保持培养。为了测定甲基转移酶活性，用0.1μ米更换培养基24小时后，去除铅，并将细胞老化7天，然后采集核提取物并进行甲基转移酶活性测定。

8-oxo-dG测定。

如前所述，通过HPLC测定8-oxo-dG水平(Bolin等人，2006年). 简单地说，样品组织在无核均质缓冲液中均质，然后用蛋白酶K消化以去除蛋白质。通过三次连续的有机提取、2体积的乙醇沉淀（相对于水溶液体积）沉淀DNA，并在−20°C下孵育过夜。通过核酸酶消化脱氧核苷成分，制备纯化的DNA用于HPLC分析。通过将DNA样品酶解产物中获得的8-oxo-dG和2′-dG的峰面积与这两种化合物的校准曲线进行比较，计算8-oxo-d G和2’-脱氧鸟苷（2′-dG）的量。样品中8-oxo-dG的水平是相对于2′-dG的含量来表示的[例如，8-oxo-d g/2′-dG（8-oxo-dG的femtomoles per nanomole of 2′-dG]。用于样品分析的HPLC方法如下：流动相由100 m组成米乙酸钠，pH 5.2，5%甲醇。使用582型溶剂输送模块（ESA，Chelmsford，MA）将流速保持在1 ml/min。使用粒径为3μm的YMC反相碱性HPLC柱（4.6×150 mm）分析DNA（YMC，北卡罗来纳州威明顿）。用5600A型库仑阵列检测器（ESA）和三个6210型四通道电化学池检测8-oxo-dG和2′-dG；8-oxo-dG的电位设置为175、200和250V，2′-dG的电位为785、850和890V。使用CoulArray for Windows32 Software（ESA）记录、存储和分析数据。数据以8-氧代-dG的毫摩尔/纳摩尔2′-dG表示。

DNA甲基转移酶分析。

在来自对照组和暴露于Pb的额叶相关皮质组织的核提取物中测定DNA甲基转移酶活性。按照上述方法提取核提取物，并按照以下方法测定DNA甲基转移酶活性Takiguchi等人（2003）将含有60μg蛋白质（甲基转移酶来源）的核提取物与50ng脱氧肌苷脱氧胞苷（poly[dI.dC].poly[dI.dC]）双链DNA模板（Sigma）作为底物孵育，1μ米 ^三H标记S公司-腺苷蛋氨酸（SAM）（79 Ci/mmol），100 m米Tris-HCl，pH 8.2，最终体积为30μl。反应通过在37°C下添加SAM启动1小时，并通过在冰上冷却终止。在DE81滤纸上发现15μl等分试样，并用pH值为7.0的磷酸钠缓冲液清洗两次，一次用70%乙醇清洗，另一次用100%乙醇清洗。干燥过滤器并在闪烁计数器中计数。