转录因子的序列分析和调节蛋白水解是原核生物和真核生物基因表达控制的一个主题。两个特征明确的例子是原核转录因子σK（K）(1)和哺乳动物固醇调节元件结合蛋白（SREBP）(2). σK（K）在革兰氏阳性菌产孢过程中对基因表达的调节起着核心作用，枯草芽孢杆菌孢子发生在双室孢子囊中，由一个称为母细胞的大细胞和一个称之为前孢子的小细胞组成。这两个细胞最初并排，但在发育后期，前孢子被母细胞完全吞噬，从而在细胞内形成一个细胞(1). σK（K）在吞噬后产生，并负责指导母细胞中的基因表达。然而，它的活性通过细胞间信号转导途径与前孢子中的转录联系在一起，从而确保一个细胞室中的基因表达与另一个细胞室内的基因表达相协调(三,4). 该途径在一种被称为pro-σ的非活性膜相关前体蛋白的转化水平上运作K（K），转录因子的成熟和活性形式(三——5). pro-σ的激活K（K）涉及20个残基长度的N末端延伸的蛋白水解去除，导致成熟σ的释放K（K）进入母细胞细胞质(三,4,6). 富含疏水残基的N末端前结构域是膜结合所必需的(5). Pro-σK（K）该过程由推测的信号蛋白SpoIVB触发，该蛋白在晚期出现的前孢子转录因子σ的控制下在前孢子中产生并可能由前孢子分泌G公司(7). 导致前σ蛋白水解激活的信号转导途径K（K）是延迟成熟σ出现的计时装置K（K）在母细胞中放置约1小时(三).
另一方面，SREBP是一种真核转录因子，参与胆固醇合成和摄取相关基因的激活(2). SREBP包含一个N端转录激活结构域和一个C端调控结构域，由两个跨膜螺旋分离(8,9). 当固醇水平较高时，全长SREBP被隔离在内质网和核膜的膜上，N端和C端结构域面对细胞液(10,11). 当甾醇耗尽时，SREBP通过两步蛋白水解裂解过程激活(12). 在第一步中，SREBP在其管腔环路的Site-1处以甾醇依赖性方式被裂解。然而，N末端转录激活域仍然通过第一个跨膜螺旋与膜相连。在第二步中，转录激活域通过位于SREBP第一跨膜段内的Site-2处的裂解从膜中释放(12,13). 可溶性转录因子结构域随后转移到细胞核，并激活导致细胞甾醇库增加的基因表达(2). 因此，控制σ的途径K（K）和SREBP类似的是，这两种转录因子都来源于膜栓系前体，并通过调节蛋白水解被激活。
这里我们关注的是负责转化pro-σ的酶K（K）至σK（K），完整的膜蛋白，SpoIVFB。SpoIVFB在吞噬过程中在母细胞中产生，并且仅位于前孢子周围的母细胞膜中(14,15). 三条证据表明SpoIVFB是促σK（K）加工酶。首先，处理pro-σ需要SpoIVFBK（K）和σK（K）-在孢子形成过程中定向基因转录，并且没有发现在加工途径中作用于SpoIVFB下游的其他孢子形成蛋白(1). 第二，孢子形成和σ中对SpoIVFB的要求K（K）-使用前σ基因的突变形式可以绕过定向转录K（K）从中删除了前氨基酸编码序列(三). 这表明SpoIVFB除了在加工过程中起作用外，在孢子形成中没有其他作用。第三，设计用于产生前σ的细胞K（K）在生长过程中，一种改良的SpoIVFB能够将前蛋白转化为成熟σK（K）(16). 这表明SpoIVFB是加工所需的唯一孢子特异性蛋白质。
作为进一步研究SpoIVFB特性的一部分，我们发现它是一个新发现的假定金属蛋白酶家族的成员。该家族的所有成员都包含典型金属蛋白酶基序HEXH和该家族特有的第二个保守基序。预计这两个基序将形成蛋白酶的催化中心。与其他金属蛋白酶不同，这两个基序重叠了疏水区域，这些疏水区域被预测为单独的跨膜结构域，将催化中心定位在膜附近或膜内。有趣的是，这个假定的膜包埋金属蛋白酶新家族的唯一另一个特征成员是Site-2蛋白酶（S2P），它是在Site-2进行SREBP膜内裂解所必需的(17). 预计SpoIVFB和S2P都会裂解膜相关底物，这与催化中心的异常位置以及这是蛋白酶家族的解释一致。我们分析了SpoIVFB中许多保守残基中氨基酸替换对前σ的影响K（K）加工，σK（K）活化和产孢效率。我们的分子遗传学分析，以及劳森的分析等。(17)和泽伦斯基等。(18)，支持SpoIVFB和S2P是一个新认可的金属蛋白酶家族的创始成员的解释。我们的发现加强了SpoIVFB是亲σ的观点K（K）加工酶，并表明控制原核转录因子σ激活的类似途径K（K）和哺乳动物调节蛋白SREBP使用具有同源特征的加工酶。
材料和方法
一般方法。
枯草芽孢杆菌使用的菌株为PY79（野生型）(24)，BSL51(spoIVFΔ∷猫) (25)和RL13（SPβgerE-lacZ公司) (26).大肠杆菌所用菌株为DH5α和CJ236。的常规增长枯草芽孢杆菌和大肠杆菌如所述(16). β-半乳糖苷酶活性在孢子形成过程中通过再悬浮测定(27,28). 在DS培养基中，通过耗竭诱导36小时培养物产孢，测定其产孢效率(27).
应变构造。
淀粉E含有野生型或孢子IVFB将突变线性化并转化为PY79，以选择大观霉素抗性（SpR（右）). Sp染色体DNAR（右）淀粉酶阴性（艾米−)转化子用于转化BSL51。通过使用前噬菌体SPβ（SPβ）的融合衍生物对每个菌株进行专门的转导gerE-lacZ公司) (26). 有关SpoIVFB突变菌株的完整列表，请参阅http://mcb.harvard.edu/losick.
免疫印迹分析。
在通过再悬浮开始产孢后的指定时间，收集1.0-ml样品。通过将细胞颗粒重新悬浮在50μl裂解缓冲液中（20 mM Tris，pH7.5/10 mM EDTA/1 mg/ml溶菌酶/10μg/ml DNaseI/100μg/ml RNaseA/1 mM PMSF/10μg/ml leupeptin/10μg/kl胃蛋白酶抑制素），并在37°C下培养10分钟，然后添加50μl SDS样品缓冲液，制备全细胞提取物。基于OD的等效提取物量（15–20μl）600在12%的聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS/PAGE分离，在Immobilon-P膜（Millipore）上电印迹，并在5%的PBS 0.5%吐温-20脱脂牛奶中封闭。用抗σ探针探测堵塞的膜K（K）如前所述，多克隆抗血清亲和力纯化的抗SpoIVFB抗体或抗SpoIVFA多克隆抗体(14,16).
结果
SpoIVFB是推测金属蛋白酶家族的成员。
为了进一步研究SpoIVFB的性质，我们试图识别保守的基序，以指导我们确定其功能。我们搜索了阻碍10.1数据库(19)并鉴定了金属蛋白酶的特征序列HEXH。30个不同的金属蛋白酶家族中有15个含有HEXH基序(31). 这两种组氨酸是金属结合所必需的，谷氨酸被认为是通过激活一个用于裂解肽键的水分子来充当催化残留物。
有趣的是，与其他具有特征的金属蛋白酶家族不同，SpoIVFB中的HEXH基序位于一个大的疏水片段内，该片段被预测为跨膜结构域(15). 鉴于SpoIVFB在处理膜相关pro-σK（K）.基因测验爆炸搜索(20)使用完整的SpoIVFB序列表明，此配置不是SpoIVFB.独有的。我们鉴定了一个类似于SpoIVFB的蛋白质家族，它们都具有与假定跨膜结构域相邻或重叠的HEXH基序。所有家族成员都被预测为多面体膜蛋白（参见材料和方法和http://mcb.harvard.edu/losick)在HEXH基序下游不同距离处含有第二个保守基序（图。). 我们将第二个保守的基序命名为NPDG基序，因为这四个残基在所有家族成员中几乎是不变的。与HEXH基序一样，NPDG基序与一段疏水残基相邻或重叠，这些疏水残基被预测为一个单独的跨膜结构域。为了识别这个家族的所有成员，我们构建了一个隐马尔可夫模型(21)并用它来搜索GenPept公司数据库（请参见材料和方法). 这个家族的成员来自生命的三个分支，但绝大多数是细菌。在完全测序的酿酒酵母在完整测序的秀丽隐杆线虫在我们进行分析时，我们还不知道这一新颖的家庭是由刘易斯和托马斯确定的(32)使用类似的数据库搜索程序。这些研究人员还发现了位于HEXH和NPDG基序之间的另一个保守序列。第三个基序包含一个保守的甘氨酸和几个疏水残基(32).
新发现的推定金属蛋白酶家族一些成员中保守基序的氨基酸序列比较。如果50%的家庭成员在该位置含有相同的残留物，则分配一个黑框。如果50%的家庭成员在该位置有类似的残留物，则分配一个灰色框。类似的残基为I、L、V和M；F、 Y和W；D和E；N和Q；S和T；A和G；以及R和K氨基酸位置。显示了基因名称和起源物种(左侧). 我们的网站上可以找到包含整个4600万家庭成员的路线(http://mcb.harvard.edu/losick).
这种新发现的假定金属蛋白酶家族中唯一具有特征的另一个成员是哺乳动物S2P（图。). S2P和SpoIVFB参与了惊人相似的调节过程：固醇应答转录因子SREBP的蛋白水解激活需要S2P。编码S2P的基因突变阻断了SREBP在Site-2的膜内裂解，表明S2P是Site-2的加工酶(17). 这一假定金属蛋白酶家族的鉴定增加了控制前σ蛋白水解激活的途径的可能性K（K）SREBP可能基于具有同源特征的加工酶。
Pro-σ需要SpoIVFB中的HEXXH主题K（K）处理。
确定pro-σ是否需要HEXXH基序K（K）加工过程中，我们分析了保守残基中氨基酸取代对pro-σ的影响K（K）处理体内氨基酸替代突变体是通过对spoIVFB公司基因（包含在双顺反子的拷贝中孢子试管婴儿操纵子）。突变操纵子在非必需的位置被引入染色体淀粉E在含有内源性缺失的菌株中进行基因座和分析spoIVF公司操纵子。SpoIVFB突变株和匹配的对照株（含有spoIVF公司操作子位于淀粉E和spoIVF公司缺失突变）诱导成孢子，并加工pro-σK（K）通过免疫印迹分析进行评估。在控制应变中，成熟σK（K）可在孢子形成开始后3小时检测到，并在接下来的2小时内继续累积（数据未显示）。在孢子形成开始后5小时对加工过程进行检查，预计一些突变体在加工过程中会部分受损，并且可能没有积累成熟σ的可检测水平K（K）在早期。到第5小时，pro-σ>80%K（K）已转换为成熟σK（K）在含有野生型的控制菌株中spoIVFB公司，而在spoIVF公司空突变体（图。A类). 用丙氨酸（E44A）或谷氨酰胺（E44Q）替换SpoIVFB中HEXH基序中保守的谷氨酸残基，完全阻断pro-σK（K）处理（图。A类). 然而，pro-σK（K）用天冬氨酸（E44D）取代Glu-44对加工过程没有影响（图。A类). 在三种金属蛋白酶中(33——35)在HEXH基序中，谷氨酸转变为天冬氨酸，蛋白酶活性被取消。有趣的是，当相应的氨基酸替代物（E172D）引入S2P时，如SpoIVFB，SREBP的激活（以及可能的Site-2处理）几乎不受影响(17).
Pro-σK（K）处理SpoIVFB突变体。(A类)产孢细胞全细胞提取物的免疫印迹。所有分析的菌株都含有spoIVF公司在其正常位置(spoIVFΔ)和一份spoIVF公司在淀粉E包含任一野生型的基因座spoIVFB公司（WT）或指定的spoIVFB公司点突变。(上部)使用识别前σ和前σ的抗体分析第5小时产孢细胞的提取物K（K）和σK（K）. (下部)通过使用识别SpoIVFB的C末端（一个不包含两个基序的区域）的抗体来分析来自第3小时产孢细胞的提取物。分析结果如免疫印迹图所示。SpoIVFB中两个保守基序的氨基酸序列以黑色显示。显示氨基酸位置。闭合点和开放点分别表示几乎不变和高度保守的氨基酸。氨基酸替代完全消除前σK（K）处理是在黑匣子中进行的。降低处理效率的突变是黑色的，被一个盒子包围着，而那些对处理没有明显影响的突变则是黑色的。(B类)四个点突变株的免疫印迹，在A类.本实验中使用的提取物（来自第3小时产孢细胞）比A类用抗SpoIVFB抗体进行免疫印迹分析(上部)并过度暴露以检测低水平的SpoIVFB突变蛋白。免疫印迹用识别SpoIVFA的抗体重新进行，以控制负载(下部). 星号（*）表示再生印迹上残留SpoIVFB信号的位置。
我们还研究了HEXH基序中假定的金属配位残基的取代作用。在SpoIVFB的HEXXH基序中，用丙氨酸（H43A）或苯丙氨酸（H 43F，H 47F）取代组氨酸，消除了前σK（K）处理（图。A类). 检测SpoIVFB水平，以确定对pro-σ的影响K（K）这一过程可以用突变蛋白水平的降低来解释。孢子形成开始后2小时可检测到孢子FB，并在第3小时左右达到最大水平（数据未显示）。通过免疫印迹分析在第3小时从用于分析前σK（K）处理。除H43F突变体（下文讨论）外，所有HEXH突变体的蛋白质水平与野生型SpoIVFB的水平相似（图。A类). 我们得出结论，HEXH基序对pro-σ很重要K（K）加工，与SpoIVFB是一种金属蛋白酶的观点一致。
NPDG主题对Pro-σ很重要K（K）处理。
然后我们分析了SpoIVFB中第二个保守基序对pro-σ的需求K（K）处理。NPDG基序中许多高度保守的残基产生了单一氨基酸变化（图。A类). 孢子形成开始5小时后，pro-σ的效率K（K）免疫印迹分析检测加工过程。几乎所有的NPDG基序突变体在处理pro-σ方面的效率都低于野生型对照菌株K（K）（图。A类). 只有D137的氨基酸替代突变体在加工过程中完全受损。在该氨基酸位置分析的所有替代物都完全阻断了前σK（K）处理（图。A类). 重要的是，当S2P中相应的天冬氨酸（D467）被天冬酰胺取代时，SREBP的激活（可能还有Site-2的裂解）也被完全消除(18). 含有HEXH的金属蛋白酶具有第三个残基，该残基与两个组氨酸一起作用，以配位活性位点金属离子(31,36). 第三种配位残基可以是组氨酸、谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸。通常，第三个配位残基出现在第二个保守基序的上下文中，这是个别家族所特有的(31,36). 我们对SpoIVFB和Zelenski的诱变研究等。(18)S2P与NPDG基序中的保守天冬氨酸一致，是第三种金属配体。
检测NPDG基序突变体中的蛋白质水平，以确定其对pro-σ的影响K（K）这种处理可以用SpoIVFB水平的降低来解释。除三个突变体外，所有突变体的蛋白质水平均与野生型SpoIVFB相当（图。A类). 在本试验中，N122A、N122D和P132A几乎检测不到SpoIVFB。过度暴露含有25%以上全细胞提取物的免疫印迹表明，所有三个突变体以及上述H43F突变体的突变型SpoIVFB蛋白水平较低但可检测到（图。B类). 作为负荷的对照，我们用抗SpoIVFA抗体重新复制免疫印迹。SpoIVFA水平与野生型相当（图。B类). N122A、N122D和P132A突变体的加工受损可能是其蛋白质水平降低的次要后果。然而，H43F蛋白可能在pro-σ中存在固有缺陷K（K）因为其他三个突变体（与H43F水平相当）能够处理pro-σK（K）尽管效率低下。我们得出结论，第二个保守基序对pro-σ很重要K（K）并且D137对于转换pro-σ至关重要K（K）至成熟σK（K）.
σ分析K（K）SpoIVFB突变体的活性。
作为pro-σ的独立度量K（K）处理，我们分析了σK（K）使用σ在SpoIVFB突变体中的活性K（K）-反应性启动子(性别平等)熔合到lacZ公司(26). 这项检测使我们能够在整个产孢过程中而不是在特定的时间点监测突变的影响。与免疫印迹分析一致，HEXH基序中谷氨酸残基向丙氨酸（E44A）或谷氨酰胺（E44Q）的变化完全消除了σK（K）活性，而σK（K）E44D突变体的活性与野生型相似（图。A类和数据未显示）。假定的金属配位离子[HEXH基序中保守的组氨酸（H43和H47）和NPDG基序中保守的天冬氨酸（D137）]中的所有氨基酸取代完全消除了σK（K）活动（图。B类和数据未显示）。有趣的是，所有NPDG突变体在pro-σ中部分受损K（K）加工具有高σK（K）活动（图。C类和数据未显示）。所有蛋白水平与野生型SpoIVFB相似的突变体（N122Q、N129A、G138A和G139A）表现出相似的动力学和σ激活程度K（K）（图。C类和数据未显示）。具有低SpoIVFB蛋白水平的三个突变体（N122A、N122D和P132A）在σK（K）活化约1小时，但与野生型相比达到了相似的β-半乳糖苷酶活性水平（图。C类和数据未显示）。我们得出结论，pro-σ中完全被阻断的突变体K（K）σ中的处理也完全受阻K（K）活动。
σ分析K（K）-SpoIVFB突变株中定向β-半乳糖苷酶的合成。在开始产孢后的指定时间采集样品，并检测β-半乳糖苷酶活性。每个菌株都含有gerE-lacZ公司原噬菌体SPβ融合，缺失spoIVF公司正常位置的操纵子(spoIVFΔ)，以及spoIVF公司操作子位于淀粉E具有任意一种野生类型spoIVFB公司（WT）或spoIVFB公司点突变，如图所示。
SpoIVFB突变体的产孢效率。
最后，为了确定两个保守基序中氨基酸替换的表型结果，我们分析了这些突变对孢子形成的影响（参见http://mcb.harvard.edu/losick用于孢子形成效率的表）。与免疫印迹分析和β-半乳糖苷酶分析一致，HEXH基序突变体被阻断在前σK（K）加工和σK（K）在产孢过程中，活性也严重受损（效率为0.001%–0.5%）。E44D突变体的产孢效率与野生型SpoIVFB相同（产孢效率85%）。有趣的是，所有NPDG突变体在pro-σ中部分受损K（K）加工，包括突变体N122A、N122D和P132A，其具有非常低的SpoIVFB蛋白水平并加工前σK（K）低效、产孢以及野生型（效率为79%–100%）。重要的是，D137的氨基酸替代突变体在产孢过程中被严重阻断（效率为0.007%–0.03%）。根据这些发现和图。C类，我们推断成熟σK（K）过量，低水平的处理足以满足高水平的σK（K）-定向基因表达和高效孢子形成。
讨论
膜嵌入金属蛋白酶家族。
SpoIVFB是一个新发现的假定金属蛋白酶家族的成员，其催化囊位于膜附近或膜内。所有家族成员都包含典型的HEXH基序和该家族特有的第二个保守基序。我们将第二个基序命名为NPDG基序，因为这四个残基在家族成员中几乎是不变的。NPDG基序中的天冬氨酸可能与HEXH基序中两个组氨酸在活性部位参与金属配位。与任何其他金属蛋白酶家族不同，这两个基序都位于疏水区域附近或重叠，这些疏水区域被预测为单独的跨膜段。这个家族中仅有的两个特征成员是SpoIVFB和S2P。预计这两种蛋白质都会裂解膜相关底物，这与催化囊的异常位置以及这是蛋白酶家族的解释一致。本研究中对SpoIVFB的突变分析加强了这一解释，并强化了SpoIVFB-σ前体的观点K（K）加工酶。SpoIVFB的HEXH基序中的氨基酸替换（E44D除外；见下文）取消了前σ的加工K（K）在NPDG基序中，只有保守天冬氨酸的突变体在加工过程中被完全阻断，这一发现与D137是活性位点的一部分的想法一致。NPDG基序中其他保守残基的替换导致加工受损，这表明这些氨基酸对前σ的有效转化很重要K（K）至成熟σK（K）我们对SpoIVFB的突变分析与S2P的分析完全一致：当S2P的HEXH基序发生氨基酸替换时，SREBP处理被取消(17). 当NPDG基序中的天冬氨酸转变为天冬酰胺时，SREBP活性丧失(18). 总之，这些研究为S2P和SpoIVFB是金属蛋白酶新家族的创始成员的解释提供了有力支持。Yu和Kroos独立地注意到了SpoIVFB中的HEXXH和NPDG母题，并得出了类似的结论（Y.N.Yu和L.Kroos，个人交流）。
唯一可能与SpoIVFB是金属蛋白酶的解释不一致的结果是，观察到用谷氨酸替代HEXH基序（E44D）中的天冬氨酸对pro-σ没有影响K（K）处理。虽然天冬氨酸在活性部位与谷氨酸具有相同的水活化功能，但在分析这种替代物的其他三项研究中，蛋白酶活性丧失了(33——35). 观察到类似S2P突变体（E172D）保持了显著活性(17)以及分析HEXXH基序中Glu到Asp突变体的相对较少的研究，减轻了我们的担忧，即E44D突变体的活性与SpoIVFB是金属蛋白酶的观点相矛盾。
如果NPDG基序中的天冬氨酸与HEXH基序中组氨酸的金属配位有关，则这两个保守基序应相邻于膜的同一面。SpoIVFB的膜拓扑结构最近在大肠杆菌通过使用福阿和lacZ公司融合(37). 这两个保守的基序被预测与围绕前孢子的母细胞膜重叠（图。A类). 这两个保守基序的方向与HEXH和NPDG基序彼此接近的想法一致，如果两者都参与金属离子配位，这是必需的。此外，假定的催化中心将靠近膜表面，pro-σK（K）处理被认为是发生的（图。A类). 如果这个模型是正确的，则推测SpoIVFB中的催化中心必须被SpoIVFB或相关蛋白中的其他膜段屏蔽在脂质双层内。拓展绿色与切割的拓扑研究(37)，我们进一步假设σ的前域K（K）插入母细胞膜，将其裂解部位定位在SpoIVFB的催化囊中（图。A类). 为了支持这一假设，生化和细胞学研究表明，前σ的氨基末端延伸K（K）是膜结合所必需的(5). 此外，前结构域是非常疏水的，这种疏水性是前-σ前序列的保守特征K（K）其他内孔形成细菌的同源物（D.Z.R.和R.L.，未发表的观察结果）。
SpoIVFB、S2P及其基板的拓扑模型。膜示意图以灰色显示。Pro-σK（K）和SREBP为红色。SpoIVFB和S2P为黄色，其保守基序为蓝色（两个基序中的不变残基如所示B类). 显示N和C端子。(A类)建议插入pro-σ的pro域K（K）进入膜中。Pro-σK（K）显示为SpoIVFB。SpoIVFB的膜拓扑基于Green and Cutting的工作(37). pro-σ的N端pro域K（K）根据预测的二级结构绘制为螺旋(40). 母细胞细胞质位于膜的下方，母细胞和前孢子膜之间的空间（膜间空间）位于其上方(B类)SpoIVFB和S2P催化中心的拟定方向。SpoIVFB和S2P的相关膜段显示为相对于膜的母细胞或细胞质表面以及膜间隙（IM）或腔。剪刀表示pro-σ中的解理位点K（K）和SREBP。为了适应转录因子的相反方向，两种加工酶中的催化中心相对于成熟转录因子释放到的腔室显示为相反的方向（见正文）。
第二个产孢σ因子，pro-σE类也受膜隔离和蛋白水解的调节(1). 与pro-σ的情况一样K（K），pro-σ的膜结合E类由其N-末端前结构域赋予(38,39). 然而，有趣的是，pro-σ的假定加工酶E类SpoIIGA不属于金属蛋白酶家族。
SpoIVFB和S2P的催化中心可能处于相反的方向。
如果我们的假设（上文）是pro-σ的氨基末端延伸K（K）插入膜是正确的，那么pro-σ的方向K（K）相对于切割后两种转录因子将被释放到其中的隔室，膜中的SREBP必须与SREBP相反（图。B类). 在pro-σ的情况下K（K），转录因子结构域位于前蛋白的C末端(6)而在SREBP的情况下，转录因子域位于蛋白质的N末端部分(9). 如果这两种蛋白质及其裂解位点方向相反，那么S2P和SpoIVFB的催化中心也可能相对方向相反。
SpoIVFB的拓扑分析强烈表明，HEXH基序位于或靠近跨膜段C末端膜的母细胞表面（图。B类) (37). 在S2P的情况下，含有HEXXH基序的40-残基疏水片段的拓扑结构无法确定(18). 然而，有人认为，含有NPDG基序的疏水片段浸入膜中，而没有真正穿过它(18). 该任务将NPDG基序放置在膜内，并靠近开关的N端回到内腔（图。B类). 为了适应S2P上的拓扑数据，考虑到这两种蛋白酶底物的相反方向，我们建议这个40-残基疏水片段包含两个跨膜结构域，HEXH基序位于第二个跨膜片段的N末端附近（图。B类). 该拓扑结构将催化中心定位在与SpoIVFB中的相反方向（图。B类). 因此，两种加工酶的催化囊相对于其各自底物的裂解位点位于相同的方向。
S2P中HEXH基序的拟定方向具有吸引力，还有三个原因。首先，它将S2P中的HEXXH基序完全放在膜内，这一期望与SREBP的预测裂解位点位于跨膜螺旋内，因此位于膜内的想法一致(12,13). 其次，HEXXH基序与S2P中的NPDG基序指向相同的方向，就像SpoIVFB中的情况一样。第三，它允许NPDG基序中的保守天冬氨酸与HEXH基序非常接近，这与其预测的金属配位作用一致。S2P和SpoIVFB之间的功能相似性的确认和验证有待于使用纯化成分用膜包埋蛋白酶进行生化重建。
