美国国家科学院院刊。1997年5月13日；94（10）：5113–5118。
抗凋亡蛋白Bcl-2的通道形成
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沙龙·L·申德尔
*凋亡和细胞死亡研究项目，伯纳姆研究所，10901 N.Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037；和‡加利福尼亚大学圣地亚哥分校生物系，加利福尼亚州拉霍拉市吉尔曼大道9500号，邮编92093-0366
谢志华
*凋亡和细胞死亡研究项目，伯纳姆研究所，10901 N.Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037；和‡加利福尼亚大学圣地亚哥分校生物系，加利福尼亚州拉霍拉市吉尔曼大道9500号，邮编92093-0366
Myrta Oblatt Montal公司
*细胞凋亡和细胞死亡研究项目，伯纳姆研究所，10901 N.Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037；和‡加利福尼亚大学圣地亚哥分校生物系，加利福尼亚州拉霍拉市吉尔曼大道9500号，邮编92093-0366
松山喜吉
*凋亡和细胞死亡研究项目，伯纳姆研究所，10901 N.Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037；和‡加利福尼亚大学圣地亚哥分校生物系，加利福尼亚州拉霍拉市吉尔曼大道9500号，邮编92093-0366
毛里西奥·蒙塔尔
*凋亡和细胞死亡研究项目，伯纳姆研究所，10901 N.Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037；和‡加利福尼亚大学圣地亚哥分校生物系，加利福尼亚州拉霍拉市吉尔曼大道9500号，邮编92093-0366
约翰·C·里德
*凋亡和细胞死亡研究项目，伯纳姆研究所，10901 N.Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037；和‡加利福尼亚大学圣地亚哥分校生物系，加利福尼亚州拉霍拉市吉尔曼大道9500号，邮编92093-0366
*凋亡和细胞死亡研究项目，伯纳姆研究所，10901 N.Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037；和‡加利福尼亚大学圣地亚哥分校生物系，加利福尼亚州拉霍拉市吉尔曼大道9500号，邮编92093-0366
†S.L.S.、Z.X.和M.O.M.对这项工作做出了同等贡献。
Carlo M.Croce，宾夕法尼亚州费城托马斯·杰斐逊大学
1997年1月15日收到；1997年3月4日接受。
摘要
Bcl-2是凋亡调节蛋白大家族的原型成员，由细胞死亡的阻滞剂和促进剂组成。Bcl-2同源物Bcl-X的三维结构L（左）研究表明，Bcl-2与白喉毒素和细菌性大肠杆菌素的成孔域极为相似，这促使人们探索Bcl-2是否能够在脂膜中形成孔。以KCl负载的单层脂质囊泡的氯化物流出为检测手段，纯化的重组Bcl-2蛋白表现出与细菌毒素、白喉毒素和大肠杆菌素类似的成孔活性，即对低pH值和酸性脂质膜的依赖性。相反，Bcl-2突变体缺乏两个核心疏水性α-螺旋（螺旋5和6），被预测为膜插入和通道形成所需，仅产生非特异性效应。在可以检测到单个通道的平面脂质双层中，Bcl-2形成了离散的离子导电、阳离子选择性通道，而Bcl-2（Δh5，6）突变体没有。观察到的最常见电导（pH 7.4，0.5 M KCl中18±2 pS）与Bcl-2二聚体产生的四螺旋束结构一致。然而，也检测到较大的通道电导（41±2 pS和90±10 pS），发生率逐渐降低，这意味着在膜中逐步形成较大的Bcl-2低聚物。因此，这些发现提供了Bcl-2在脂质膜中形成通道的生物物理证据，表明这种抗凋亡蛋白具有新的功能。
Bcl-2是第一个确定的细胞和病毒凋亡调节蛋白大家族成员（参考文献综述）。1,2). 这些蛋白似乎阻断了凋亡和程序性细胞死亡共同途径中的远端步骤，其中一些起到抑制作用（Bcl-2，Bcl-XL（左）、Mcl-1、Ced-9、BHRF-1、E1b-19 kDa、A1、ASFV-5HL、Bcl-W和NR13）和其他作为启动子的基因S公司细胞死亡。在许多情况下，这些蛋白质可以在同二聚体和异二聚体的复杂网络中相互作用(1–5). Bcl-2及其某些同源物的异常表达与多种疾病状态有关，这些疾病状态的特征是细胞过度积聚或细胞不适当死亡，包括癌症、自身免疫、缺血性疾病（中风、心肌梗死）、HIV-相关免疫缺陷、，以及一些神经退行性疾病（参考文献综述）。6,7). 因此，了解这一蛋白质家族的生物化学作用机制很重要，因为它与其他已知蛋白质没有氨基酸序列同源性。
Bcl-2及其大多数同源物在羧基末端附近含有一段疏水残基，将其锚定在细胞膜中，主要是线粒体外膜、核膜和部分内质网(8,9). 这些膜的位置，以及Bcl-2可以调节钙的证据2+膜通量和蛋白质转运(10–14)，引发了推测，Bcl-2家族蛋白可能参与离子或蛋白质运输的某些方面(1). 最近，Bcl-X的三维结构L（左），一种Bcl-2的抗凋亡同源物，已被解决，显示出与白喉毒素（DT）和细菌结肠炎的孔形成域惊人的相似性(15).
Bcl-X公司L（左）、DT和大肠杆菌素A和E1均含有一对中心疏水性α-螺旋，呈发夹状结构排列，周围环绕5–8个两亲性α-螺。DT、大肠杆菌素A和大肠杆菌素E1的研究表明，孔隙形成过程有三个步骤：(我)以适合后续整合的方向与膜结合，这需要低pH值和带负电荷的脂质；(ii（ii）)两个疏水螺旋垂直穿过脂质双层平面，周围的两亲性螺旋向上折叠，类似于伞的开口；和(三)通过膜中两个或多个分子的二聚/齐聚形成通道，每个分子为通道提供一对螺旋，或者通过将额外的两亲螺旋整合到膜中形成单体通道(16–27). 虽然核心对螺旋大部分是疏水的，但它们确实含有一些亲水残基，这些残基可能朝向通道的水腔。此外，对合成两亲性肽的研究表明，形成水通道需要至少四个垂直插入膜的螺旋(28–30).
尽管Bcl-XL（左）在结构上与细菌毒素相似，但这并不一定意味着功能相似。例如，大肠杆菌素的通道形成域显示出与肌红蛋白和藻蓝蛋白类似的结构折叠，即珠蛋白折叠，但这三个蛋白家族履行完全不同的功能(31). 因此，预测Bcl-2与成孔蛋白的结构相似性促使我们探索Bcl-2是否能够在脂质膜中形成通道。
方法
质粒制备。
他的6-Bcl-2（ΔTM）产生质粒是通过释放生态里-Xho公司I编码人Bcl-2（1-218）的cDNA，然后从pEG202中获得终止密码子，并亚克隆到pET-21中(32). 为了他的6-用PfuI DNA聚合酶（Stratagene）两步突变法对pRc/巨细胞病毒中Bcl-2编码的cDNA Bcl-2（Δh5，6）（ΔTM）[Bcl-2(三,32)使用侧翼（前=5′-GCGAATTC自动液位计GCGCACGCTGGGAGAACA-3′，背面=5′-CGCCTCGAGAGAGAGTCA公司CTTCAGAGAGACACAGGAAATC-3′）（斜体中的启动/停止密码子）和内部诱变（正向=5′-CTGCACACCTGGATCAGGAAACGGA-3′和反向=5′-CCAGGTGCACCCCGCCTGAAGAGCTC-3′的引物。这个生态RI-和Xho公司将经I消化、凝胶纯化的PCR产物亚克隆到pSKII中，通过DNA测序确认其结构正确，然后转移到pET-21。
Bcl-2蛋白的纯化。
他的6-Bcl-2（ΔTM）和突变型His6-Bcl-2（Δh5，6）（ΔTM）蛋白由pET载体在大肠杆菌BL21（DE3）细胞。在37°C的Luria–Bertani培养基中用100μg/ml氨苄西林培养单个菌落。在OD进行诱导6000.8与1 mM异丙基β-d日-硫代半乳糖苷在37°C下放置6–8小时，然后通过离心法回收细胞。造粒细胞在使用前一直保存在−20°C的温度下。将来自2升培养物的细胞重新悬浮在50 ml裂解缓冲液中（50 mM Tris，pH 9.2/150 mM NaCl/5 mM EDTA/10 mM 2-巯基乙醇/1%Triton X-100/1 mM苯甲基磺酰基氟化物/0.5 mg/ml溶菌酶），并在室温下培养30 min，然后短暂超声以降低粘度。通过在JA14转子（Beckman）中以13000 rpm离心15分钟收集颗粒，用200 ml 20 mM Tris、pH 8.0/1%Triton X-100/150 mM NaCl/1 mM EDTA/5 mM 2-巯基乙醇清洗一次，用200 ml 20 mM Tris、pH 8.0/100 mM NaC1清洗一次。将含有大部分表达蛋白的洗涤颗粒溶解在20 ml 50 mM磷酸盐缓冲液（pH 6.5）6 M胍基·HCl（GdmHCl）中。在JA20转子（Beckman）中以17000 rpm的转速离心15分钟，收集清澈的上清液，并在4°C下旋转培养12–16小时，加入15 ml镍-海藻糖（Qiagen），用50 mM磷酸盐缓冲液（pH 6.5）4 M GdmHCl清洗。将树脂装入直径3.2 cm的柱中，并用50 mM磷酸盐缓冲液（pH 6.5）、4 M GdmHCl、20 mM咪唑以6.4 ml/min的速度洗涤，直到A类280达到0.01。然后用0.2 M乙酸、4 M GdmHCl洗脱固定化蛋白，在4°C下用20 mM乙酸透析12–16小时，并在−80°C、pH 3.3、10–15 mg/ml下储存。纯化蛋白通过SDS/PAGE（15%凝胶）表征，然后进行考马斯染色。浓度由A类280Bcl-2和Bcl-2（Δh5，6）分别使用ɛ=1.5和0.71 mg/ml。
脂质体制备和Cl−流出量测量。
在10 mM二甲基戊二酸/100 mM KCl/2 mM Ca（NO三)2，pH 5.0，根据Peterson和Cramer的方法(24). 将脂质体在10 mM二甲基戊二酸/100 mM硝酸胆碱/2 mM Ca（NO）中稀释200倍至最终浓度0.05 mg/ml三)2，用NaOH滴定至给定pH值。在添加Bcl-2之前，将缬霉素（15 nM）添加到囊泡悬浮液中，以产生内部负电位。将Bcl-2或Bcl-2（Δ5，6）添加至最终浓度（200–600 ng/ml），足以释放至少50%的封装KCl，其余部分通过添加Triton X-100（0.1%）释放。总金额K+或Cl−将释放的KCl与通过连续添加10mM KCl产生的校准曲线进行比较。Bcl-2诱导的K+或Cl−-流出量用K或+或Cl−-耦合到双结参考电极（Orion）的选择电极（Orio，Boston）(24).
平面双层制备和单通道记录。
如前所述，使用4:1二苯酰磷脂酰乙醇胺：二苯酰卵磷脂酰胆碱（Avanti生化公司，Alabaster，AL），通过两个单层的并置，在贴片吸管的尖端形成脂质双层(33,34). 将纯化的蛋白质添加到水亚相（0.5 M KCl，1 mM CaCl2双层形成后，调节至pH 5.4或用5 mM Hepes缓冲至pH 7.4）。24±2°C下单通道电流的采集和分析如下所述(20,21,30,33). 所示的信道记录代表了在规定的实验条件下最常观察到的电导。根据高斯拟合电流直方图和沟道开口（τo个)和闭合（τc（c）)根据概率密度函数的指数拟合计算寿命(33)使用来自持续记录片段的数据t吨>45秒和n个≥500个事件（平均值±SEM）。带τ的开口o个≤0.3ms时忽略。报告的数据包括对8000多个单通道开口的统计分析。
结果
为了探索Bcl-2在细胞膜中形成通道的可能性，我们生产了具有N末端His的Bcl-2蛋白6-标记在细菌中，并且没有其C末端膜锚定尾（ΔTM）。去除TM结构域是生产可溶性重组蛋白的必要条件。Bcl-2（ΔTM）蛋白在哺乳动物细胞中具有抗凋亡活性(35). 经Ni-亲和层析纯化后（图。A类)，他的6-在DT和大肠杆菌素测定孔形成所需的典型条件下，使用负载KCl的大单层脂质体测试Bcl-2（ΔTM）蛋白的孔形成(24,27,36). 氯−大多数实验都测量了流出量，但使用K也获得了类似的结果+选择电极（未显示）。该方法检测到的宏观通道活性要求大部分蛋白质分子参与通道形成，因此排除了具有异常构象的变性分子的罕见亚群负责离子流出的可能性。
Bcl-2在含有酸性脂质体的脂质体中形成依赖于pH的孔隙。(A类)他的6-Bcl-2（ΔTM）蛋白(左边)和变种人His6-Bcl-2（Δh5，6）（ΔTM）蛋白(正确的)用Ni-亲和层析纯化。His的考马斯染色SDS/PAGE凝胶6-Bcl-2（ΔTM）和他的6-显示Bcl-2（Δh5，6）（ΔTM）蛋白，表明完整重组蛋白的纯度>95%（分子质量标记以千道尔顿为单位）。(B类)将Bcl-2和大肠杆菌素E1蛋白质与Cl进行对比−pH 4.0条件下，含KCl的70%DOPC/30%DOPG脂质体流出。他的6-Bcl-2（ΔTM）(b条)或大肠杆菌素E1(一)已在添加t吨0在戊二酸二甲酯缓冲液中，分别为≈350ng/ml和50ng/ml。箭头表示添加0.1%的Triton X-100以释放残留的Cl−从小泡中。(C类)Bcl-2介导的（300 ng/ml）Cl−比较了不同pH值（包括pH 4.0）下的流出量(一), 4.5 (b条), 5.0 (c（c）), 5.5 (d日)、和6.0(e（电子）). (D类)野生型(一,b条)和突变型(c（c）,d日)评估Bcl-2蛋白诱导Cl的能力−酸性70%DOPC/30%DOPG流出(一,c（c）)和中性100%DOPC(b条,d日)小泡。箭头表示添加0.1%Triton X-100以诱导释放残余Cl−(E类)野生型His6-Bcl-2（ΔTM）(一,b条)和变种人His6-Bcl-2（Δh5，6）（ΔTM）(c（c）,d日)比较70%DOPC/30%DOPG脂质体中的蛋白质（300 ng/ml）。氯−在pH 4.0下测量流出量(一,c（c）)和5.5(b条,d日).
当添加到由70%中性（DOPC）和30%酸性（DOPG）脂质组成的KCl负载脂质体中时，Bcl-2以pH依赖的方式形成孔隙（图。B类). Cl的释放−根据Bcl-2与Triton X-100添加前后脂质体的光散射研究，Bcl-2（ΔTM）蛋白添加后并非由于脂质体溶解。对大肠杆菌素E1和Bcl-2的成孔活性的比较表明，只需要约5到10倍的Bcl-2蛋白就可以产生等效的Cl−pH 4.0时的流出（图。B类)表明Bcl-2作为一种成孔分子非常活跃。
逐渐减少Cl−外排是由等摩尔量的Bcl-2在较高pH值下诱导的，这是在这些体积离子外排分析中大肠杆菌素E1等细菌毒素的典型行为(24,27,36). 图。C类显示了pH值在4.0至6.0范围内Bcl-2介导的孔隙形成分析，表明Cl显著降低−与pH 4.0相比，在pH 4.5和5.0时的流出以及在pH 5.5和6.0时检测不到的孔活性。免疫印迹分析表明，在pH 4.0时，>95%的Bcl-2（ΔTM）为脂质体相关，而在pH 6.0时，<5%，这与低pH质子酸盐会使Bcl-2中的某些残基发生质子酸盐作用的想法一致，从而克服了阴离子脂质的静电排斥作用，并增强了Bcl-2插入膜的能力（未显示）。
脂质体中Bcl-2介导的孔隙形成需要酸性脂质。图。D类显示了Cl的比较−Bcl-2在由70%DOPC/30%DOPG和100%DOPC组成的脂质体（pH 4.0）中诱导的流出，表明Bcl-2蛋白在中性脂质小泡上没有成孔活性。Bcl-2在用中性DOPC和15%（wt/wt）阴离子线粒体脂质心磷脂制备的脂质体中也能有效地形成孔隙（与DOPG只有一个负电荷相比，它带有两个负电荷）（未显示）。Bcl-2未能在中性脂质中形成毛孔，这进一步证明了该蛋白不会非特异性溶解小泡。在这方面，Bcl-2定位的内部生物膜含有酸性脂类，这意味着用合成脂类获得的这些观察结果与生理相关。综上所述，这些结果表明，Bcl-2可以以pH和酸性脂质依赖的方式形成离子传导孔，类似于其结构相似的细菌毒素(19,24,27).
为了进一步探索Bcl-2的孔形成机制，构建了一个突变体，该突变体缺乏两个核心疏水螺旋（h5，6），根据与细菌毒素的结构相似性，预测这两个核心的疏水螺旋是渗透脂质双层和随后的通道形成所必需的(16,17,26). 这个突变体类似于Bcl-XS公司蛋白，一种促凋亡的Bcl-X亚型L（左）由选择性mRNA剪接产生(37). 像Bcl-XS公司，Bcl-2（Δh5，6）蛋白在具有C-末端TM结构域的哺乳动物细胞中表达时促进而不是抑制细胞死亡，在酵母双杂交分析中与Bcl-2结合，但不能同源二聚或与Bax结合（参考文献。三,38和数据未显示）。他的6-在细菌中产生Bcl-2（Δh5，6）（ΔTM）蛋白，并进行纯化（图。A类)与Bcl-2（ΔTM）进行平行比较，并添加到载KCl的脂质体中。不像他的6-Bcl-2（ΔTM）蛋白，突变型His6-Bcl-2（Δh5，6）（ΔTM）蛋白只产生非特异性Cl−流出。例如，尽管一些Cl−外排是由Bcl-2（Δh5，6）蛋白诱导的，这与膜的pH值和脂质组成无关（图。 D类和E类). 氯离子的这种混杂刺激−pH值升高和中性膜中的流出表明可能由洗涤剂引起的非特异性膜破裂。在这方面，Bcl-X的报告结构L（左）预测Bcl-2（Δh5，6）蛋白基本上完全是两亲性的，其余五个螺旋都有疏水和亲水的一面。因此，Bcl-2（Δh5，6）可能以类似于洗涤剂的方式与膜相互作用，导致非特异性膜破裂。
为了进一步表征Bcl-2的成孔活性，使用平面双层膜进行了实验(33). 这种敏感的技术监测单个通道的活动。该方法的灵敏度允许在中性pH下进行通道记录，在中性pH条件下，蛋白质与膜的结合和随后的整合是比较罕见的事件。当他的6-将Bcl-2（ΔTM）蛋白应用于中性pH、对称0.5 M KCl中的平面双层，观察到离散通道活性，具有随机开口和闭合。检测到的最常见通道的电导率为18±2 pS和41±2 pS.（图。 A类–如果)，其中较小的电导通道发生得更频繁。
Bcl-2在平面脂质双层中形成离散的通道。在添加1 mM CaCl的对称0.5 M KCl中，从预成型脂质双层中获得单通道记录2和10 mM Hepes，添加50μg/ml His后pH值为7.46-Bcl-2（ΔTM）蛋白。闭合（C）和开放（O）状态的电流由实线表示。虚线定义了用于区分状态之间转换的范围，并基于信噪比测量(33). 对于在+100 mV下获得的记录(A类–如果)，向上偏转表示通道开口，而向下偏转表示−100 mV时的通道开口(G公司–L（左）). 当前直方图和高斯拟合(C类,如果,我,L（左）)反映在−100 mV≤V≤100 mV范围内从持续几分钟的记录的连续段中获得的结果。(A类–C类)选择用于演示41±2 pS通道的记录，其中A类和B类是具有代表性的当前记录C类是数据高斯拟合的当前直方图，显示了打开（O）和关闭（C）信道状态的相对发生率。该记录来源于在不存在20pS通道的情况下发生的40pS通道活性的突发。通道关闭的概率(P（P）c（c）)≥0.9，在这些实验条件下。明渠寿命（τo个)对于γ=41 pS电导通道，由两个指数τ的和很好地拟合o1号机组=6.4±1毫秒，τ氧气=11.2±3 msec，关闭时间为τc1级= 0.6 ± 0.2, τ二氧化碳=17.7±3.0毫秒(n个= 3).D类–如果演示18±2 pS通道，其中D类显示了通道大部分关闭的记录（在所呈现的时间过程中有五个开口），E类通道在所示时间内大部分打开的示例（注意≈250毫秒后第二≈20 pS通道的瞬态打开），以及如果表示当前直方图。数据来源于纯≈20 pS通道活性的突发。选择用于直方图准备的记录区域偏向于高频通道打开的一段时间，即使对于这个≈20 pS的小通道，也要显示高信噪比。(G公司–我)在−100 mV（向下偏转）下记录的≈40 pS（用实线和侧面虚线标记）和≈20 pS（未标记）地震道的示例，显示出与+100 mV下记录相似的特性。本记录中显示的≈20 pS和≈40 pS通道活性的混合物比表1中显示的单电导通道活性更为典型的Bcl-2通道形成A类–如果为了便于说明。当前直方图(我)注意到≈20 pS（O）的开路状态的发生频率1)约40 pS（O2)通道，代表≈20 pS和≈40 pS通道占据闭合和开放状态的相对时间。(J型–L（左）)不太常见的90±10 pS通道。注意散布的≈20 pS和≈40 pS电导。（≈40 pS通道用实线表示以进行比较。）当前直方图(L（左）)表明≈20 pS（O1)，≈40 pS（O2)，且≈90 pS（O三)频道。≈90 pS通道出现次数太少，无法在图中直观地识别。提交的特定记录(J型,K)偏向于显示这种较大电导通道活动的示例。
Bcl-2形成的通道表现出欧姆行为（即电压依赖性），在+100 mV至−100 mV范围内传导的电流遵循线性电流-电压关系，没有整流迹象。图。 A类–如果和G公司–我将Bcl-2在+100 mV和−100 mV下传导的电流进行对比，表明通道开放状态的振幅和持续时间基本相同，但电流流向相反的方向。这种对称活动可能反映了双层中Bcl-2通道的随机方向。
除了初级≈20 pS和次级≈40 pS电导外，第三个离散通道电导（90±10 pS）的出现频率远低于较小的电导通道（图。 J型–L（左）). 所有三种通道活性（≈20 pS、≈40 pS和≈90 pS）都是独立的。特别是，仔细检查通道记录的小时数，排除了较大≈40 pS和≈90 pS电导通道仅代表同时在膜中打开的较小≈20 pS通道的两个或三个之和的可能性。
低pH值下的记录表明，酸性pH值促进Bcl-2通道插入平面双层。pH值为5.4时，膜电导趋向于从高电导向低电导转变，反映出更多的通道逐渐插入膜中。在pH值5.4时，可以清楚地分辨出20、40和≈90 pS的单通道电导（图。). 这些通道事件以突发形式出现，通道活动明显比pH 7.4时记录的更不均匀（图。). 在五=100 mV，26 pS的电导非常频繁且均匀（图。A类). 这个频道比40个pS事件要频繁得多。在五=−100 mV，10和20 pS通道是最常见的（图。B类). 80-90 pS电导也会发生，但很少发生，主要发生在低电导和高电导水平之间的转换期间。
pH5.4时脂质双层中的Bcl-2通道。在对称的0.5 M KCl，1 mM CaCl中，脂双层显示出单通道记录2加入50μg/ml His后将pH调节至5.46-Bcl-2（ΔTM）蛋白。(A类–C类)样本记录获取于五=100 mV，显示26 pS通道的出现。D类-如果与记录对应五=−100 mV，显示10 pS和20 pS的通道。其他条件如图所示。.
pH值为5.4时，Bcl-2通道具有阳离子选择性。从含有多个通道（≈4）的膜上获得了Bcl-2通道在对称0.5 M KCl和2倍KCl浓度梯度（移液管中0.5 M，槽中1 M）下的电流-电压关系。阳离子的转移数，由反转电位确定(五第页)在单一KCl浓度梯度下的测量值为0.94±0.05(n个= 3). 这表明在这些条件下，Bcl-2通道的阳离子选择性约为90%。为了确定电流是由阳离子传导的，在相同条件下使用缬霉素（一种钾选择性离子载体）校准信号，得到等效结果。
与野生型Bcl-2蛋白相反，当以等摩尔浓度施用时，Bcl-2（Δh5，6）突变体未能在脂质双层中形成离散通道（图。). 在膜电流中只观察到不规则的杂散波动，这些电导没有真正通道的典型方波外观（图。B类). 这种行为与Bcl-2（Δh5，6）蛋白以非特异性方式与膜相互作用的想法一致，这是表面活性剂和其他两亲分子的典型方式，但未能形成离散的通道。根据Bcl-2和Bcl-2（Δh5，6）突变体的单通道分析结果以及脂质体渗透性测定的结果，我们得出结论：6-Bcl-2（ΔTM）蛋白可以在膜中形成离散的通道，而缺乏两个核心疏水螺旋的Bcl-2突变体则不能。
Bcl-2（Δh5，6）突变体不能形成通道。含有His的脂质双层膜的膜电流6-Bcl-2（ΔTM）(A类)缺失螺旋5和6的缺失突变体(B类). 最终蛋白质浓度为50μg/ml。在100 mV的对称0.5 M KCl、1 mM CaCl中记录的电流2，5 mM Hepes，pH 7.4。注意，与野生型Bcl-2产生的方形事件相比，缺失突变体产生的膜电流出现了杂散、不稳定的波动。七个实验的数据代表。
讨论
在这里，我们提供了生物物理证据，证明抗凋亡蛋白Bcl-2在细胞膜中形成通道。中性pH值为18±2 pS时的初级通道电导与Bcl-2同型二聚体的孔形成一致，每个单体向通道贡献一对螺旋（可能是螺旋5和6），基于对合成的两亲性螺旋的研究，这些螺旋在膜中组装成四聚体四螺旋束，并形成约20 pS电导的通道(29,30). 有趣的是，据报道，大肠杆菌素E1也通过一种机制产生≈20 pS电导通道，这种机制被认为涉及大肠杆菌素E2插入细胞膜后产生四螺旋束（参考文献。17). 然而，对于绞痛蛋白E1，通道似乎是由单体产生的，来自单个绞痛蛋白E1分子的两个核心疏水螺旋插入膜中，然后是来自同一分子的两个额外的侧翼两亲螺旋。虽然需要进行更多的生物物理研究来区分单体和Bcl-2二聚体的通道形成，但我们支持基于Bcl-2及其同源物同二聚体和异二聚体声誉的二聚假设。第二常见的Bcl-2通道表现出41±2 pS的电导。使用在膜中形成五聚体螺旋束的合成肽测量了具有类似电导的通道(39)增加了这些较大的通道可能由Bcl-2三聚体或Bcl-2插入膜中的额外两亲螺旋产生的可能性(24). 此外，三种离散通道活性的存在具有逐渐增大的电导（≈20 pS、≈40 pS和≈90 pS），但发生频率逐渐降低，增加了Bcl-2蛋白分子在平面双层中逐步齐聚的可能性。
离子传导通道（如乙酰胆碱受体）的成孔基序似乎由α-螺旋束组成。这些α-螺旋通道在适当触发打开之前往往呈闭合构象，而大孔形成蛋白（如孔蛋白和溶血素）具有β-桶结构，并在与此处所用条件类似的条件下呈主要开放状态（参考文献。40). 发现Bcl-2通道大多处于闭合状态在体外在中性pH下，提出了一个问题，即是什么控制Bcl-2介导的通道的打开和关闭体内脂质囊泡中孔隙形成的pH依赖性和在酸性pH条件下平面双层通道插入的增加表明，pH可能起到通道调节剂的作用。在这方面，可能与Bcl-2的一个显著位置是线粒体外膜有关。免疫电镜和亚细胞分馏研究表明，Bcl-2在与线粒体内外膜相邻的接触部位特别丰富，那里存在大量质子梯度(8,41,42). 与Bcl-2类似，大肠杆菌素E1似乎进入敏感状态大肠杆菌在细菌的内外膜接触部位，它起到杀菌孔的作用(43). 然而，因为低pH值被认为只会促进大肠杆菌素E1的成孔片段与膜表面的结合在体外（通过质子化残留物和增加膜中酸性脂质的静电吸引力），而不是实际诱导孔隙形成(27,36)，通道形成体内通过具有其C末端膜锚定结构域的全长Bcl-2蛋白可以显著降低pH依赖性。
除pH值外，Bcl-2通道活性的另一个潜在调节器是蛋白质-蛋白质相互作用，涉及已报告与Bcl-2结合的各种同源和非同源蛋白质（参考文献中综述）。1,2). 因此，与BAG-1等蛋白的相互作用可以增强Bcl-2作为抗凋亡蛋白的功能，而与Bcl-X等拮抗蛋白质的相互作用可能促进气孔的形成S公司BAD可能会干扰孔隙的形成。
关于Bcl-2的关系，许多问题仍然没有答案在体外通道活性对其作为凋亡抑制因子的作用。例如，Bcl-2打算在细胞膜上运输什么？而大肠杆菌素形成非特异性离子通道，并被一些菌株用作机制大肠杆菌为了通过诱导靶细胞膜电位去极化来杀死竞争细菌，DT被认为形成了一条通道，参与蛋白质在溶酶体膜上的转运，也就是说，它为毒素的ADP核糖基化a亚单位进入胞浆提供了一条管道(20–22,44). 另一个问题是Bax等促凋亡蛋白如何对抗Bcl-2的细胞保护作用。它们只是通过与Bcl-2异二聚作用来阻断Bcl-2的成孔活性，还是会形成反作用毛孔？我们的初步数据表明，Bax在阴离子含脂脂质体中也以pH依赖的方式形成孔隙，并且不仅消除了Bcl-2的孔隙形成（未公布的数据）。因此，这意味着Bcl-2允许离子或蛋白质沿细胞保护的方向跨膜运输，而Bax则相反。因此，有趣的是，预测的穿过Bcl-2第五α-螺旋的膜包含两个酸性残基（谷氨酸），而Bax包含两个碱性残基（赖氨酸）。因此，这些蛋白质很可能具有不同的选择性(45). 谷氨酸残基的存在可能面对Bcl-2通道的腔，这也与观察到的Bcl-2对阳离子的选择性一致。
尽管推测性很强，但整合了文献中各种观察结果的一个可测试假设是，Bcl-2形成离子通道，直接或间接导致线粒体膜电位（Δψ）超极化。据报道，Bcl-2过表达细胞线粒体超极化的预测次要后果包括：(我)阳离子荧光染料如罗丹明123的线粒体摄取增加(46); (ii（ii）)强化钙2+线粒体摄取(13); 和(三)增加对刺激的抵抗力，诱导线粒体通透性转变和Δψ的耗散，同时释放基质储存的Ca2+氧自由基的生成和基质的膨胀导致线粒体外膜破裂，并释放到细胞色素等凋亡蛋白的胞浆中c（c）和AIF，后者反过来可以激活细胞死亡效应蛋白酶（caspases）(47–49).
Bcl-X的三维结构惊人的相似性L（左）以及大肠杆菌素A和E1，以及此处和其他地方提供的证据(50)显示Bcl-2和Bcl-XL（左）与这些细菌毒素相比，Bcl-2家族蛋白和细菌大肠杆菌素具有高度相似的成孔特性，这就增加了Bcl-2族蛋白和细菌性大肠杆菌素在进化中可能具有共同的祖先起源，或者可能代表了聚合进化的一个例子。当人们认为线粒体是由与真核细胞形成共生关系的细胞内细菌进化而来时，这一点尤其明显。因此，形成孔的大肠杆菌素及其相关的免疫蛋白与大肠杆菌素结合并阻止孔的形成，作为赋予耐药菌株细胞保护的手段(17,51)，可能为随后出现的Bcl-2蛋白家族提供了框架，其中许多蛋白定位于线粒体膜，并且（如大肠杆菌素）与细胞生命和死亡的调节密切相关。
致谢
我们感谢W.Cramer的宝贵建议和鼓励，感谢T.Potter的手稿准备，感谢CaP-CURE公司对该项目的慷慨支持，感谢美国国立卫生研究院（GM-49711 to M.M.）。
缩写
| 数据传输时间 | 白喉毒素 |
| DOPC公司 | 二油酰磷脂酰胆碱 |
| DOPG公司 | 二烯醇磷脂酰甘油 |
工具书类
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