首次提出普遍且高度保守的Clp蛋白家族可能是分子伴侣，因为它们具有已知伴侣的若干特征(1). 许多伴侣蛋白是热应激过程中参与非天然蛋白重折叠和不可逆变性蛋白降解的热休克蛋白。类似地，许多Clp蛋白是由热休克诱导的，其中一些是双组分ATP依赖性蛋白酶的调节成分。最近，大肠杆菌ClpA和ClpX以及酵母Hsp104已被证明能够重新激活和分解蛋白质，从而定义了Hsp60和Hsp70伴侣的功能(2–5).
酵母Hsp104已被证明具有伴侣作用体内(2). Hsp104中缺陷的突变细胞失去了溶解热休克形成的蛋白聚集体的能力，并且无法重新激活热失活的荧光素酶(2). Hsp104也参与热失活后mRNA剪接的再激活(6)以及改变酵母朊蛋白的构象体内(7).
大肠杆菌ClpA首次被鉴定为ClpAP蛋白酶（蛋白酶Ti）的调节成分(8,9). ClpP是肽酶成分，与Clp家族无关。ClpA有两个ATP结合位点，是一种ATP酶。在MgATP存在下形成6倍对称的低聚物(10). ClpAP蛋白酶复合体包含一个ClpP的十四碳单体，一端或两端有一个Clp a六聚体，形成与真核26S蛋白酶体惊人相似的结构(10).
我们实验室的研究表明，ClpA独立于ClpP，在激活质粒P1起始蛋白RepA、，体外(三). 伴侣分子刺激RepA的特异DNA结合活性约100倍，但本身不是RepA-DNA复合物的一部分(11). 凝胶过滤(12)和速度沉淀实验（未发表的工作）表明，活化是将无活性的RepA二聚体转化为活性单体。其他伴侣，包括ClpB、ClpX、Hsp104和GroEL/GroES，不会激活RepA(三).
ClpA是伴侣的其他证据是ClpA保护RepA免受热失活和防止萤火虫萤光素酶不可逆热失活的能力体外(三). ClpA还针对RepA体外存在ATP时ClpP降解(三). ClpA直接用于降解，而不仅仅用于生成RepA单体，因为由DnaJ/DnaK/GrpE激活的RepA不会被不含ClpA的ClpP降解。
ClpX在噬菌体Mu DNA复制和转座中作为分子伴侣的作用(5,13,14). 它调节依赖ATP的拆卸体外MuA四聚体和Mu DNA的稳定络合物，释放出MuA单体(5). 在另一个体外反应，ClpX阻止和逆转噬菌体λO蛋白的热诱导聚集(4). ClpX是ClpP的替代调节剂，形成ClpXP蛋白酶(15,16)两个ClpXP底物是MuA(5)和λO蛋白(15,16).
因此，Clp蛋白家族已成为一类新的依赖ATP的分子伴侣，能够防止蛋白质聚集、折叠和重塑，并参与降解。在本报告中，我们利用RepA的ClpA活化研究了ClpA伴侣活性的机制。我们分离了反应中的几个中间配合物，发现用于激活RepA的ClpA-RepA配合物是在时间、温度和核苷酸依赖的反应中形成的。我们发现，一轮RepA绑定到ClpA并从ClpA释放就足以激活RepA。
材料和方法
蛋白质和DNA。
P1代表A(17)和ClpA(18)按所述进行纯化。总之，ClpA和RepA均以亚单位摩尔数表示。携带P1复制起点（100μg）的质粒DNA通过在37°C的200μl哈哈I缓冲器包含125个单位的哈哈甲基化酶（新英格兰生物实验室）和0.5 mCi（80 Ci/mmol；1 Ci=37 GBq）S公司-腺苷-我-[甲基-三H] 蛋氨酸（杜邦/NEN）。通过苯酚萃取和Sepharose 6B柱层析纯化DNA。
在体内RepA蛋白的标记。
隔夜培养大肠杆菌携带pLRepA的MZ1，在λP的控制下编码RepA的质粒L（左）启动子在30°C的M63最小培养基中生长，补充2%葡萄糖、0.05%B1、1%酪氨酸酶和50μg/ml氨苄西林。然后将细胞稀释成1升含有相同补充剂的M63培养基，培养至OD6000.8，通过离心收集，重新悬浮在含有除酪氨酸钠和氨苄西林外的所有补充剂的1升M63培养基中，并在30°C培养1小时。通过将温度升高到42°C培养30分钟来诱导RepA表达。细胞被标记为5 mCi的Tran35S标签或1 mCi我-[14C] 亮氨酸（均来自ICN）在42°C下持续5分钟。立即采集细胞，并纯化RepA。纯化物的特定活性35S-和14C-标记的RepA分别为2 Ci/mmol和0.3 Ci/mmol。未标记和标记的RepA都被DnaK/DnaJ/GrpE或ClpA激活到类似程度。
RepA活化反应。
用于RepA活化的反应混合物（20μl）包含缓冲液A（20 mM Tris●HCl，pH 7.5/100 mM KCl/0.01 mM EDTA/5 mM DTT/10 mM MgCl2)、1 mM ATP、100μg/ml BSA、300 ng ClpA和RepA，如图所示。蛋白质在20 mM Tris●HCl中稀释，pH 7.5/100 mM KCl/0.01 mM EDTA/5 mM DTT/0.01%Triton X-100（vol/vol）。在23°C下15分钟后，将混合物冷却至0°C。一微克小牛胸腺DNA和20-40 fmol三添加含有P1来源的H标记质粒DNA。在0°C下5分钟后，通过硝化纤维过滤器过滤混合物，并测量残留放射性，表明RepA结合。
结果
RepA与ClpA的绑定和释放的一个循环激活RepA。
我们将反应分为几个步骤，并确定核苷酸在每个步骤中的作用，以了解ClpA伴侣活性的机制。先前的研究表明ClpA都能组装成六聚体(10)与非活性RepA二聚体相互作用形成稳定的ClpA-RepA复合物(三)在需要ATP但不需要ATP水解的反应中。我们使用此信息来确定重新折叠RepA是否需要一轮或多轮RepA到ClpA的绑定和释放。首先，多余的ClpA与RepA和腺苷5′孵育-O（运行）-（3-硫代三磷酸）（ATP[γ-S]），一种不易水解的ATP类似物，在23°C下形成ClpA-RepA复合物。然后通过添加10倍摩尔过量的酪蛋白捕获游离ClpA，酪蛋白与ClpA具有高亲和力(18). 接下来，我们知道ATP与与ClpA结合的ATP[γ-S]交换的半衰期很快（不到一分钟，未发表的观察结果），我们添加了ATP并测量了RepA的活化。我们发现，尽管存在酪蛋白陷阱，但ClpA仍能有效激活RepA（图。). RepA活化水平与标准RepA活化条件下达到的水平相似，或者在ATP[γ-S]和ATP交换期间酪蛋白被忽略（图。). 作为对照，在第一次反应中ATP[γ-S]的缺失或酪蛋白的添加，无论是没有ATP[γ-S]还是有ATP[γ-S]，都阻断了RepA的激活（图。). 同样，当第二次孵育缺乏ATP时，RepA没有被激活，因为激活需要ATP（图。) (三). 这些实验表明，ClpA与RepA的结合需要核苷酸结合，但RepA的激活和释放需要ATP水解。由于已知活动RepA不含ClpA，因此这些实验证明ClpA绑定和释放的单个循环会激活RepA。
酪蛋白陷阱实验表明，ClpA结合和ATP依赖性释放的一个周期激活RepA。将4.3 pmol的ClpA和0.3 pmol的RepA在含有1 mM ATP[γ-S]的20μl缓冲液A中在23°C下培养20分钟，形成ClpA-RepA复合物。然后添加42.4 pmol酪蛋白，然后添加1 mM ATP。在23°C下额外15分钟后，通过添加1μg小牛胸腺DNA和20 fmol三H标记ori公司P1质粒DNA。在0°C下5分钟后，通过硝化纤维过滤器过滤混合物，并测量保留的放射性。在对照实验中，第一个反应中省略了ATP[γ-S]，第一个带有或不带有ATP[γ-S]的反应中添加了酪蛋白，或者第二个反应中忽略了ATP，如图所示。
我们进行了稀释实验以证实这些结果。如上所述，ClpA与RepA和ATP[γ-S]孵育。然后将反应混合物稀释50倍，以防止ClpA和RepA进一步组装或重组。最后，添加了ATP。我们发现，稀释和ATP交换后，RepA被完全激活，并且RepA激活的程度与在没有稀释的情况下用ATP进行反应时获得的程度相似（图。). 当整个反应在第二次培养的稀释条件下进行时，激活被阻止，这表明稀释将RepA的激活限制在一个循环内（图。). 当ClpA、RepA或ATP[γ-S]从第一个反应中省略，并在稀释后的第二次培养过程中重新添加时，未观察到激活（图。). 第二次反应中ATP的缺失也阻止了激活。当使用不可水解的ATP类似物腺苷酰亚胺二磷酸代替ATP[γ-S]进行实验时，获得了类似的结果（未显示结果）。因此，这些结果证实ClpA在核苷酸依赖性结合和ATP-水解物依赖性释放的一个循环中激活RepA。第一个反应中对RepA的要求表明，组装反应不仅涉及ClpA六聚反应，还涉及与RepA的结合。核苷酸结合可能会诱导伴侣发生变构变化，以允许底物结合，但需要ATP水解才能完成循环并释放活性RepA单体。
稀释实验表明，ClpA结合和ATP依赖性释放的一个循环激活RepA。通过在含有50μM ATP[γ-S]的15μl缓冲液A中培养6.0 pmol的ClpA和1.1 pmol的RepA，形成ClpA-RepA复合物。在23°C下20分钟后，用相同的缓冲液加100μg/ml BSA和100μM ATP将3μl稀释至160μl，并在23°C下培养10分钟。如图所示，测定活化RepA。在第2列中，在15μl中培养不含核苷酸的RepA和ClpA。然后在含有100μg/ml BSA和100μM ATP的缓冲液A中将3μl稀释至20μl，并如上所述进行培养。在柱3中，在160μl中与1.2 pmol ClpA和0.2 pmol RepA进行整个反应。在其他对照实验中，在指示的第一个反应中省略RepA、ClpA或ATP[γ-S]，并在第二个反应中重新添加。在最后一次控制中，第二次反应中省略了ATP。
未承诺的ClpA-RepA络合物的形成及其转化为承诺络合物。
稀释方案很容易将活化反应分为离散阶段。有趣的是，我们发现稀释实验的第一步（复合物的形成）相对较慢，在23°C下至少需要20到30分钟才能完成（图。A类). 此外，反应程度在0°C时比在23°C时小得多（图。A类). 这两个结果都令人惊讶，因为许多蛋白质-蛋白质相互作用发生得很快，并且相对独立于温度。
稀释实验的时间进程表明RepA-ClpA络合物在时间和温度依赖的反应中聚集。(A类)反应混合物与图中描述的反应混合物相同。在0°C下培养含有ClpA、RepA和ATP的[γ-S](▪) 或23°C（□），按照指示的时间，然后稀释50倍到含有ATP的缓冲液A中，如图所示。。在23°C下第二次培养10分钟后，测定活化的RepA，如图所示。在一组反应混合物中，在0°C下孵育20分钟后，混合物在稀释前在23°C下进一步孵育10分钟（▵）(B类)反应混合物与图中所述的反应混合物相同。。在23°C下首次培养20分钟后，稀释反应，并添加ATP，如图所示。第二个反应在0°C（•）或23°C（○）下培养，培养时间为所示时间。
为了确定ClpA六聚体组装是否是缓慢且对温度敏感的步骤，我们在没有RepA的情况下培养ClpA和ATP[γ-S]20分钟，以允许六聚体化，然后在稀释前2分钟添加RepA。稀释后激活的RepA量仍然很低（数据未显示），表明缓慢的第一反应必须涉及RepA。
我们直接测量络合物，以进一步表征ClpA-RepA络合物形成反应。使用放射性标记的RepA和Microcon 100过滤分析，我们能够从ClpA-RepA复合物中分离出游离RepA，并量化与ClpA相关的RepA数量。使用此技术[14C] RepA（非活性二聚体和活性单体）保留在过滤器上（表). 根据SDS/PAGE测定（数据未显示），单独培养或与ATP[γ-S]一起培养的ClpA超过95%保留在过滤器上。当ClpA与[14C] 在0°C或23°C下，含有或不含有ATP[γ-S]的RepA，47%至98%的RepA保留在含有ClpA的过滤器上（表). 因此，与稀释实验第一步形成的复合物不同，这些复合物的组装与温度和核苷酸结合无关。
表1
| 复杂形成反应的添加 | RepA与ClpA复合体，Microcon 100过滤器上保留的RepA百分比
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|---|
无氯化钠
| 1 M氯化钠
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|---|
| 0摄氏度 | 23°C | 0摄氏度 | 23°C |
|---|
| RepA+ClpA+ATP[γ-S] | 75 | 98 | 5 | 85 |
| RepA+ClpA | 47 | 65 | 1 | 三 |
| 回购协议 | 10 | 10 | 8 | 7 |
| RepA+ClpA+ATP | 10 | 12* | 5 | 4* |
然后我们研究了ClpA-RepA络合物的稳定性。通过改变反应条件，可以将不太稳定的ClpA-RepA络合物与非常稳定的络合物区分开来。当我们用高浓度盐挑战络合物时，我们发现只有在23°C的ATP[γ-S]存在下形成的ClpA-RepA络合物在1 M NaCl中持续存在（表). 在23°C下，还与酰亚胺二磷酸腺苷形成了稳定的ClpA-RepA络合物（数据未显示）。相反，在0°C有或没有ATP[γ-S]和23°C没有ATP[γ-S]时形成的复合物通过NaCl处理解离。当通过将反应混合物稀释30倍来挑战复合物时，获得了类似的结果（数据未显示）。与稀释实验一致，在23°C下，对NaCl处理稳定的ClpA-RepA络合物在30分钟内缓慢形成（图。). 相反，不太稳定的复合物快速形成，在2分钟内完成，这是使用该技术可能的最早时间点（图。).
稳定的ClpA-RepA络合物组装缓慢，但不稳定的Clp A-RepA复合物快速形成。ClpA（76 pmol）和9 pmol[14C] 在含有100μg/ml BSA、0.02%Triton X-100（vol/vol）和100μM ATP[γ-S]的50μl缓冲液A中在23°C下共同培养RepA 0至30分钟。在最终体积为100μl的上述缓冲液中，将反应调节至1 M NaCl（•），或在不含NaCl的上述缓冲溶液中调节至100μl(▪). 反应在Microcon 100过滤装置中离心，滤液和滞留液中的放射性测定如表所示.在没有ClpA的情况下[14C] RepA保留在过滤器上，并已减去。
因此，在23°C有ATP[γ-S]存在时形成的络合物与在0°C有或无ATP[β-S]时形成的配合物或在23°C无ATP[γ-S]时生成的配合物有所区别(我)它们更稳定，并且(ii（ii）)他们已承诺†激活RepA。通过在23°C下与ATP进一步孵育[γ-S]（图。A类). 稀释和添加ATP后，稀释实验第二步的时间过程表明，活性RepA从承诺络合物中的释放相对较快，并在5分钟内完成（图。B类).
承诺的ClpA-RepA络合物中ClpA到RepA的化学计量比。
我们通过培养越来越多的14在23°C条件下，在ATP存在下，用固定浓度的ClpA标记C-RepA[γ-S]。与ClpA结合的RepA的量通过测量14通过测量保留在Microcon 100过滤器上的C和免费RepA的数量14滤液中的C（图。). 结果推断出每个ClpA六聚体具有1.2个RepA二聚体的摩尔比。在一组使用未标记RepA的类似实验中，ClpA-RepA复合体中的游离RepA和RepA的量通过活化分析测定（图。). 这些实验的结果也推断为每ClpA六聚体约一个RepA二聚体的摩尔比，这表明在承诺络合物中RepA二聚体与ClpA六合体的结合接近等摩尔。
ClpA-RepA络合物中ClpA与RepA摩尔比的测定。含有缓冲液A、1 mM ATP[γ-S]、210 pmol ClpA和7至280 pmol[35S] 将RepA或未标记的RepA在23°C下培养10分钟。然后在Microcon 100过滤装置中离心反应。在与[35S] RepA，在保留液和滤液中恢复的放射性测量如表所示(•). 在使用未标记的RepA的实验中，如材料和方法(▪).
RepA活化反应的可逆性。
为了证明ClpA对RepA的活化只是二聚体向单体的转化，并不需要对RepA进行共价修饰，我们证明了反应的可逆性。首先，我们通过与ClpA和ATP孵育来激活RepA。通过Microcon 100过滤器离心反应混合物来分离活化RepA。滤液中含有活化的RepA，这取决于其结合能力ori公司无ClpA时0°C下的P1 DNA（图。A类)并且在与ClpA和ATP再次孵育后不再受到进一步刺激（图。B类). 然后通过Microcon 30过滤器离心将滤液浓缩约100倍。浓缩的物质在结合ori公司P1 DNA，因为单体化被逆转（图。A类). RepA没有被不可逆转地灭活，因为它通过与ClpA和ATP孵育再次被激活（图。B类). 这些结果表明，ClpA的活化是可逆的，不涉及RepA的共价修饰。
ClpA激活RepA的可逆性。RepA（50 pmol）和180 pmol ClpA在1.1 ml中与缓冲液A中的1 mM ATP在23°C下孵育15 min。反应混合物在Microcon 100过滤装置中以3200×克8分钟。然后通过在Microcon 30过滤装置中以14000×克持续8分钟。在A类通过测量浓度前后0°C下的DNA结合。在B类通过将它们与ClpA和ATP孵育，然后测量DNA结合材料和方法浓度前（•）和浓度后（○）。
讨论
图。总结了通过我们的结果确定反应中的几个中间产物暗示的ClpA蛋白重塑途径。首先，ClpA在ATP或不可水解的类似物存在下组装成六元环(10). ClpA六聚体与底物相互作用，在本例中为RepA二聚体，形成ClpA-RepA复合物。这些络合物在0°C时迅速形成。因为它们可以很容易地分解成原始组分，所以我们称之为非承诺络合物。缓慢的温度依赖反应将未结合的ClpA-RepA络合物转化为非常稳定的ClpA-RepA络合物，其中包含等摩尔量的ClpA六聚体和RepA二聚体。这种依赖时间和温度的反应的分子基础尚不清楚，但我们认为在这个缓慢的反应中，RepA二聚体与ClpA从松散的络合物转变为紧密的络合物。我们将这些配合物称为承诺配合物，因为它们是“承诺”或预定的，在ATP水解时释放活性RepA单体。在ATP水解时，ClpA可能发生构象变化，导致RepA二聚体的解离和RepA单体的释放。或者，ClpA可以在缓慢的第一反应过程中将RepA二聚体转化为单体，然后在ATP水解时释放单体。有必要将单个翻转实验与RepA基板中随时间变化的构象变化测量相结合，以决定这些替代方案。ClpA进行的RepA单体化反应可以通过增加活性单体的浓度来逆转，就像RepA通过尿素处理进行活化一样(12). 图。还显示了我们目前的RepA替代命运模型，即ClpAP蛋白酶降解RepA(三). 虽然该反应中的中间体仍有待表征，但我们已分离出需要ATP[γ-S]形成的ClpA、ClpP和RepA络合物（未发表的结果）。
ClpA伴侣活性的机制和ClpAP蛋白酶活性的模型。（讨论见正文。）
我们的结果表明，从承诺的ClpA-RepA络合物中释放的所有RepA都是活性单体形式。这一观察结果引发了一个有趣的问题，即ClpA在单轮结合和释放中完全重塑底物的能力是否是ClpA伴侣的一个特性。折叠过程可能是过程性的，以至于一旦底物被结合，它就会经历ATP依赖性蛋白质重塑的多个过程周期，但直到达到天然形式才被释放。该机制与已知的ClpAP蛋白酶的过程降解机制一致，其中已表明蛋白质底物在多个位置被裂解，而不会释放中间降解产物(20). 与其他依赖ATP的伴侣相比，通常没有观察到伴侣作用的过程机制。用DnaK/DnaJ/GrpE和荧光素酶进行了一个周期的实验，观察到只有大约30%的释放的荧光素酶被重新激活(21). 同样，对于许多GroEL/ES底物，在一轮底物结合和释放后产生的大多数多肽都是非天然形式的。这在罗丹妮丝身上已经看到了(22–24)，核酮糖二磷酸羧化酶(25)，二氢叶酸还原酶(26)和线粒体苹果酸脱氢酶(27). 然而，使用鸟氨酸转氨酶(28)，大部分分子在一轮释放后折叠。有人认为，通过结合和释放底物，GroEL/GroES可以动态地分割非天然多肽(22). 因此，随着每一轮结合和释放，一些多肽达到其天然形式。其他非天然形式有机会重新结合GroEL、结合其他伴侣、聚集或与蛋白水解酶组分相互作用。
我们不知道ClpA是否在一个结合和释放周期内重塑RepA以外的底物。RepA可能是一种非常独特的底物，因为它几乎总是被重塑成活性构象，很少出现非天然形式。很有意思的是，如果RepA在一个周期内被其他伴侣（即DnaJ/DnaK/GrpE）激活，或者如果其他底物在一个循环内被ClpA重塑。
ClpA和ClpX对其各自伴侣底物的特异性与ClpAP和ClpXP蛋白酶对其降解底物的特异性平行。也就是说，ClpA而不是ClpX激活RepA；并且，ClpAP而不是ClpXP会降低RepA(三). 类似地，ClpX分解MuA四聚体并分解λO蛋白，ClpXP降解λO和MuA(4,5,15,16). 这些观察结果表明，ClpA和ClpX可以通过释放天然蛋白质或将非天然蛋白质提供给蛋白水解组分ClpP来直接决定其各自蛋白质底物的命运。很可能，ClpA/ClpX和ClpAP/ClpXP的相对浓度以及重塑或降解底物的相对动力学参数对于确定底物的命运也至关重要。
总之，我们已经通过将反应分解为阶段来探讨了ClpA伴侣蛋白活性在蛋白质重塑中的机制。我们发现ClpA与RepA形成不稳定的络合物，并以时间、温度和核苷酸依赖的方式转化为稳定络合物。稳定的配合物会在ATP水解时释放活性RepA。了解ClpA重塑的机制应该为ClpAP蛋白酶底物呈现的早期步骤以及ClpA伴侣功能和ClpAP酶功能的耦合机制提供重要线索。
