正常哺乳动物细胞在遇到环境压力时，通过控制其在细胞周期中进展的能力来维持基因组的完整性(1,2). 当这些控制紊乱时，结果是基因组不稳定，这是肿瘤形成的标志。肿瘤抑制蛋白p53通常在肿瘤中失活，是细胞周期进程的主要调节因子，以应对DNA损伤或DNA合成停滞(三–5). 这些应激产生的信号导致p53蛋白水平增加，并刺激其激活转录的能力，导致两种G细胞周期阻滞1(6–8)和G2/M（M）(9,10). p53的一个重要转录靶点是细胞周期素依赖性激酶抑制剂p21/waf1(11)有助于调节细胞周期对DNA损伤的反应(12–14). 在原代人成纤维细胞中，p53介导的细胞周期阻滞对DNA损伤的反应是不可逆的(15). 然而，p53的过度表达而没有DNA损伤会导致两种基因的可逆性阻滞1和G2/M（M）(16–18).
通过使用p53缺失的小鼠或人类细胞，或使用人类乳头状瘤病毒16的E6蛋白来灭活p53，结果表明细胞对CAD基因扩增变得宽容，从而N个-（膦酰基）-我-p53缺失时的天冬氨酸（PALA）抵抗(19–21). 相反，p53完整的细胞稳定地停滞，主要在G1在PALA中不形成耐药菌落(19,20). 这些观察结果表明，PALA诱导G细胞p53依赖性细胞周期阻滞1从而抑制基因扩增和遗传不稳定性(16). 在啮齿类动物细胞中，CAD基因扩增是观察到的PALA抗性的唯一机制，但人类细胞通过其他机制（包括但不限于CAD基因扩增）对PALA产生抗性(22).
在被PALA剥夺嘧啶核苷酸的正常人成纤维细胞中，野生型p53介导G1通过不涉及DNA断裂的机制逮捕(16). 鲍尔森等。(23)研究表明，在缺乏功能性p53通路的情况下，PALA治疗肿瘤细胞会导致DNA损伤，从而导致CAD基因扩增。此外，在一些细胞中，p53和相关G的诱导1PALA引起的阻滞是有缺陷的，但γ辐射引起的阻滞则是正常的(24)这表明，在这些不同的刺激下，p53激活有不同且可分离的途径。在本报告中，我们描述了几种细胞系对嘧啶核苷酸耗竭或辐射诱导的DNA损伤的反应。所有这些株系都具有功能性野生型p53，不允许基因扩增。然而，不是在G中累积1用PALA处理后，两个细胞系停滞在S期。我们认为，通过嘧啶饥饿激活p53可导致G细胞稳定且可逆的阻滞1也在S期，从而在细胞周期的多个点调节基因组稳定性。
材料和方法
细胞系和培养条件。
MDAH041危机后细胞系，由M.Tainsky善意提供(25)来自一名Li-Fraumen综合征患者的成纤维细胞。一个p53等位基因在密码子184处发生了移码突变，正常的p53等位点在在体外传播，传播(20). 正常人WI38成纤维细胞取自美国型培养物收集。TR9-7细胞在四环素调节启动子的控制下表达野生型p53，来源于MDAH041细胞(17). 包含新标记物在G418（600μg/ml）存在下生长。早期传代p53-null和p21-null小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）分别由L.Donehower和G.Hannon提供。正常人成纤维细胞（LF1）细胞及其p21-null衍生物（H07.2-1）是J.Sedivy的礼物(26). 低代原代大鼠胚胎成纤维细胞（REF）由Andrei Gudkov（芝加哥伊利诺伊大学）提供，REF52细胞如Franza所述等。(27). 所有细胞在10%CO中生长2补充10%胎牛血清。
PALA选择。
PALA（NSC224131）是一种多功能CAD酶天冬氨酸转氨酶活性的抑制剂，从马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症治疗部发展治疗计划药物合成与化学分院获得。使用PALA治疗细胞的方法如阿加瓦尔所述等。(28). 对于每个细胞系或菌株，ID50确定并选择2×105在10%（vol/vol）透析胎牛血清的情况下，使用3×ID的PALA对每个10-cm板上的细胞进行检测50(29). 每隔4-5天更换一次选择性培养基，直到观察到100-200个细胞的集落，通常需要3-4周。
西部和北部分析。
在20 mM Tris●HCl、pH 7.5、2%（wt/vol）SDS、2 mM苯甲脒和0.2 mM苯甲烷磺酰基氟化物中通过裂解细胞分离总细胞蛋白。蛋白质浓度通过Bradford方法（Bio-Rad）测定。用SDS-10%PAGE分离蛋白质（25μg/lane），并将其电印在聚偏二氟乙烯膜上（Stratagene；参考文献。30). 转移后，用考马斯蓝（Sigma）对凝胶进行染色，以验证相等的负载。用针对p53的mAb DO-1（Santa Cruz Biotech）探测膜，并通过增强化学发光（Amersham）检测结合抗体。Northern分析：按照制造商的规定，使用Trizol试剂（GIBCO/BRL）提取总RNA。按照Sambrook的描述进行分析等。(31).
细胞周期分析。
使用Cycletest试剂盒（Becton Dickinson），通过碘化丙啶染色测定胰蛋白酶化细胞的DNA含量。使用FACScan仪器（Becton Dickinson）测定细胞周期分布，单元格匹配软件和HP340系列9000工作站（惠普）。通过脉冲处理将死细胞选通。
DNA合成测量。
为了氚标记，C11和MDAH041细胞生长在6孔板中，并用3×ID的PALA处理503天后，5μCi三将H标记的胸腺嘧啶核苷添加到每个孔中，并将细胞再培养2小时。在三氯乙酸清洗后，在60°C下向每个孔中添加0.5 ml 2 M高氯酸30 min。将所得溶液转移到闪烁体中三测定H掺入量。将残渣溶解在碱中进行蛋白质测定。对于BrdUrd掺入，用PALA（3×ID）处理盖玻片上生长的细胞50)并在含有10μM BrdUrd的培养基中再培养4小时。通过免疫染色（Amersham）测定BrdUrd与DNA的结合。
结果
野生型p53被修复的Li-Fraumeni细胞系具有正常成纤维细胞的许多特性。
此前，我们在p53-null MDAH041细胞系中建立了四环素调节野生型p53的表达(17). 克隆TR9-7在野生型p53过度表达（在缺乏四环素的情况下）时发生可逆性生长停滞，表明介导这种对p53反应的途径是完整的。我们现在通过在正常p53启动子的控制下引入野生型p53小基因，以不同的方式恢复了MDAH041细胞中p53的表达。一个克隆（C11）组成性地表达低水平的p53，用PALA治疗可以诱导和激活p53（图。)或阿霉素（数据未显示）。C11中p53的水平低于正常成纤维细胞株WI38，而TR9-7细胞加四环素的水平与WI38细胞相似（图。). 用p53反应元件调节荧光素酶表达的构建物瞬时转染C11细胞后(32,33)，经PALA、γ-辐射、紫外线辐射或阿霉素（数据未显示）处理后，荧光素酶被诱导5-10倍，表明p53转基因具有功能。在平行实验中，p53完整MDAH041细胞在治疗前后均不表达荧光素酶（数据未显示）。我们还分析了p53靶基因p21/waf1在C11、TR9-7、MDAH041和WI38细胞中的表达。PALA处理在TR9-7和WI38细胞中诱导p21 mRNA（图。B类). 相反，经PALA处理后，C11细胞中p21的诱导无效，与MDAH041细胞中的诱导相似。这些观察结果表明，C11细胞中的p53水平低于有效诱导p21所需的阈值。
PALA对p53和p21/waf1的诱导作用。(A类)用0.5mM PALA处理细胞4天，并通过使用DO-1抗体的Western分析检测p53，该抗体通过增强化学发光检测。(B类)p21 mRNA水平。总RNA在琼脂糖凝胶中通过电泳分离，并转移到尼龙膜上。用特异性人类cDNA探针检测p21 mRNA。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为负荷控制。
然而，TR9-7细胞加上四环素和C11细胞保留了正常人成纤维细胞株的许多其他p53依赖性反应，与其p53全MDAH041亲本形成对比。同样，具有野生型p53的大鼠细胞系REF52保留了REF细胞株的许多正常反应。例如，这些细胞系中没有一个在选择性浓度的PALA中表现出基因扩增（参考文献。29和34TR9-7（加四环素）和REF52细胞在G1/S边界对DNA损伤的反应（见下文），TR9-7和C11细胞在G时保持正常的p53依赖性阻滞2/M对DNA合成抑制的反应(5).
p53介导的对嘧啶核苷酸饥饿反应的S期阻滞。
正常人成纤维细胞在PALA中稳定停滞，并且在接触药物数周后能够恢复生长，而缺乏p53的细胞在数天内失去活力。此外，正常人成纤维细胞中检测不到PALA抵抗，p53完整细胞中PALA抵抗的频率约为10−5(19,20). 与WI38细胞一样，TR9-7细胞加上四环素和C11细胞均稳定停滞，与培养皿粘附，在PALA存在下4-6周内数量几乎保持不变（数据未显示）。这些细胞也不能产生PALA抗性菌落（表). 正如预期的那样，PALA迅速杀死MDAH041细胞，并在高频下产生耐药菌落（表). 因此，在MDAH041衍生的细胞系中，PALA耐药集落的形成依赖于p53。
表1
| 细胞系或菌株 | p53状态 | 身份证件50对于PALA，μM | 频率*3×ID的PALA抗性菌落50 |
|---|
| MDAH041型 | 无效的 | 75 | 5 × 10−4 |
| C11号机组 | 重量 | 60 | <8 × 10−7 |
| TR9–7 | 重量 | 40 | <4 × 10−7 |
| WI38型 | 重量 | 20 | <10−8 |
| 参考52 | 重量 | 10 | <10−8 |
| 裁判 | 重量 | 10 | <10−8 |
| 最大有效载荷 | 重量 | 17 | <10−7 |
| p53-全部MEF | 无效的 | 17 | 4.7 × 10−4 |
| p21/waf1-空MEF | 重量 | 17 | <4 × 10−6 |
为了比较它们的细胞周期反应，用3×ID处理指数生长的细胞5024、48或96小时，并分析DNA含量。大多数WI38细胞和TR9-7细胞加四环素累积在G1（2 N DNA含量）和G2/M（4N DNA含量），96小时后S期仅为7%或11%（图。A类). 相反，用PALA处理96小时的C11细胞的S期细胞数要高得多（52%）（图。A类). 大约三分之一经PALA处理的C11细胞的DNA含量为2N，这可能是因为它们的G1检查点控制仅部分有效。类似的分析显示几乎没有G1REF52细胞阻滞；PALA治疗96小时后，几乎所有（94%）都在S期积累（图。B类和参考。34). REF细胞应变的响应（图。B类)与正常人WI38成纤维细胞相似（图。A类). 为了分析阻滞在S期的细胞是否产生DNA，C11和MDAH041细胞用PALA处理3天，用BrdUrd脉冲标记4小时或[三H] 胸腺嘧啶核苷作用2小时。PALA处理的C11细胞显示出明显减少的BrdUrd染色（图。A类)胸腺嘧啶核苷的摄取量减少了3倍（图。B类)与未经处理的细胞相比。这些观察结果表明，停滞在S期的细胞合成的DNA很少。在PALA处理的REF52细胞中也进行了类似的观察(34). 相反，PALA处理的MDAH041细胞继续合成DNA（图。)这表明，当PALA在缺乏p53的情况下使其脱氧核苷酸库失衡时，这些细胞确实会进入S期，并在次优条件下继续生成新的DNA，这可能会导致DNA损伤。
人类细胞周期分布(A类)和老鼠(B类)单元格。PALA治疗后（3×ID50)或γ射线照射（5Gy），用碘化丙啶染色后进行细胞分选。G中细胞的百分比1、S和G2/显示M。(C)细胞周期分布与PALA治疗时间的关系。
PALA处理细胞的DNA合成。(A类)PALA处理的MDAH041和C11细胞的BrdUrd标记。在盖玻片上生长的细胞用PALA（3×ID50)3天，脉冲标记4小时。用抗BrdUrd抗体染色后，拍摄细胞照片（×57）。(B类) [三H] PALA处理的C11和MDAH041细胞的胸苷标记。用PALA（3×ID）处理细胞50)3天，脉冲标记2小时三H归一化为每个孔中的蛋白质总量。
PALA诱导的S相制动是可逆的，具有保护性。
为了研究S期生长停滞的可逆性，用3×ID处理C11细胞、TR9-7细胞加四环素和REF52细胞50PALA培养4或15天，然后在正常培养基中重新培养，以分析菌落形成。与p53缺失的MDAH041细胞相比，所有野生型p53的细胞株在PALA暴露下存活下来（表). 所有带有p53的人类细胞系的存活率均优于任何一种大鼠细胞。为了评估细胞周期阻滞是否能保护PALA治疗后的突变DNA损伤，我们检测了单拷贝X连锁次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）基因的状态，其失活可通过6-硫鸟嘌呤（6TG）选择。用选择性浓度的PALA（3×ID）处理细胞50)或非选择性浓度（1×ID50). 在后一种情况下，REF52细胞可以进行CAD基因扩增，这可能是由于DNA从高度不平衡的脱氧核苷三磷酸池复制时造成的损伤(34). 当细胞未经处理或用3×ID的PALA处理时，未观察到6TG耐药集落50而6TG耐药菌落出现频率约为10−5当REF52细胞以1×ID的PALA处理时50（表). 正常时，p53-null或p21-null MEF用3×ID的PALA治疗50连续4天，然后用6TG进行选择，用p53全MEF观察到抗性菌落（频率≈3×10−5)但不包括p21-null或正常MEF（表). 这些结果表明，当细胞在PALA存在下可以保护性停搏时，HPRT位点没有突变，并且当暴露于PALA不会导致保护性停药时，HPRT突变确实发生频率很高。
表2
| 细胞系或菌株 | PALA处理后形成集落的细胞百分比
|
|---|
| 4天 | 15天 |
|---|
| MDAH041型 | <1 | <1 |
| C11号机组 | 82 | 63 |
| TR9-7型 | 86 | 70 |
| WI38型 | 62 | 43 |
| 裁判 | 20 | 第 |
| 参考52 | 19 | 第 |
| 最大有效载荷 | 28 | 第 |
| p53缺失MEF | <1 | 第 |
| p21/waf1缺失MEF | 27 | 第 |
表3
| 治疗 | 6-硫鸟嘌呤耐药菌落的频率
|
|---|
| 参考52 | 最大有效载荷 | p53-全部MEF | p21/waf1-空MEF |
|---|
| 无 | <2 × 10−6 | <2 × 10−6 | <2 × 10−6 | <2 × 10−6 |
| PALA（3×内径50) | <2 × 10−6 | <2 × 10−6 | 1.2 × 10−5 | <2 × 10−6 |
| PALA（1×内径50) | 1.6 × 10−5 | 第 | 第 | 第 |
p53介导的S期阻滞和基因组稳定性与p21/waf1无关。
由于REF52和C11细胞即使失去G，也不会产生PALA抗性集落1检查点，因为已知p21/waf1调节G1/S转变，我们利用p21已被同源重组灭活的人类细胞株（H07.2-1；参考文献。26)和p21-null MEF。用50μM PALA（ID50=15μM）培养3天，并测定细胞周期分布。正常LF1细胞在G1G增长了5倍以上1/S比率（图。). 相反，p21-null H07.2-1细胞在S期积累，如G的变化所反映1/S比率从未处理细胞的2.8降至PALA处理细胞的1.2（图。). 在p21-null MEF中进行了类似的观察（数据未显示）。邓等。(13)还发现PALA处理的p21-null MEF中S期细胞数量增加，而PALA处理正常MEF中的S期细胞减少。
p21/waf1-null人类细胞的细胞周期分布。(A类)PALA治疗三天后（50μM，3×ID50)细胞经碘化丙啶染色后进行分选。G中细胞的百分比1、S和G2/显示M。(B类)G公司1/未经处理和PALA处理的正常和p21-null人类细胞的S比率。
为了评估p21/waf1的丢失是否影响细胞对PALA的耐药性，我们将2×106p53-空、p21-空或正常MEF至50μM PALA（3×ID50)持续4周。p53-null MEF中观察到菌落（频率≈1×10−5)但不适用于p21-null或正常MEF（表). 为了观察p21-null MEF是否受到DNA损伤的保护，用PALA处理这些细胞4天，然后用6TG选择这些细胞，以p53-null细胞作为对照。p53阴性细胞中观察到6TG耐药集落，而p21阴性细胞中未发现集落（表)表明HPRT基因未发生突变。
对PALA的保护性制动与γ辐射诱导的G无关1检查点。
放射指数生长细胞（5 Gy）导致G组WI38、TR9-7（加四环素）和REF52细胞阻滞1和G2/M 24小时后（图。 A类和B类). 相反，MDAH041细胞的类似处理导致G1种群，G中的细胞相应增加2/24小时后的M（图。A类). 令人惊讶的是，C11细胞和MDAH041细胞在本实验中表现相似，在G2/M在G中无累积迹象1因此，尽管非许可细胞系C11和REF52在用PALA处理时在S期表现出非常相似的积累，但它们对γ辐射的反应却截然不同。我们的结论是，核苷酸饥饿条件下细胞周期检查点功能的调节不同于γ射线照射诱导的调节。
讨论
p53在维持基因组稳定性中起着重要作用（参考文献综述）。1,2,35、和36)缺乏功能性p53的细胞很容易成为非整倍体并产生PALA抗性集落(19,20). 在正常人成纤维细胞中，未能获得PALA抗性与保护性G相关1核苷酸耗竭引起的逮捕(16)或γ辐射(15). p53失活导致G蛋白丢失1检查点和获得产生抗PALA菌落的能力。我们的新观察表明，除了G1检查点，p53介导的S期阻滞足以抑制PALA耐药性和PALA诱导的HPRT位点突变（图。).
p53—PALA诱导的嘧啶核苷酸饥饿的依赖性效应。
p53水平可能决定G是否发生逮捕1或S-相对PALA或γ辐射的响应。
表达野生型p53的C11细胞未能在G细胞中停滞1但在S期确实稳定可逆地停止。然而，来自与C11相同亲本细胞的TR9-7细胞表现出与WI38细胞非常相似的表型。TR9-7和WI38细胞表达相似水平的p53，而C11细胞表达较低水平，这表明可能需要阈值量的p53才能实现有效的G1PALA中的阻滞，低量的p53足以使PALA的S期阻滞。由于γ射线照射后C11细胞继续进入S期，而TR9-7和WI38细胞在G1，G1γ射线照射后的阻滞也可能取决于p53的表达水平。因此，不同的p53依赖性细胞周期检查点反应似乎在不同水平的p53中触发，这与之前的观察一致，即p53水平决定细胞是否因凋亡而停止或死亡(37).
G区REF52细胞阻滞1对辐射有反应，但对PALA治疗无反应，而C11细胞在G1对这两种刺激作出反应。与这些结果一致，陈等。(37)描述了p53和G在其中积累的细胞类型1PALA引起的阻滞是有缺陷的，但γ射线引起的阻滞则是正常的。p53可能会因这两种形式的应激而发生不同的修饰，例如，通过不同部位的磷酸化，导致p53下游不同成分的激活，从而产生不同的生物学结果。
当细胞缺乏核苷酸时，p53对DNA合成的p21/waf1非依赖性抑制可保护细胞免受DNA损伤。
虽然MDAH041和C11细胞在被PALA阻滞于S期时确实结合了胸腺嘧啶或BrdUrd，但在C11细胞中结合率要低得多。这一结果表明，p53抑制了PALA阻止的S期细胞中持续的DNA合成。PALA处理细胞的S期阻滞涉及p53依赖性抑制DNA合成，这可以防止DNA从高度不平衡的脱氧核苷三磷酸池合成时发生的断裂。在PALA中，REF52细胞缺乏G1和G2/M个检查点并最初穿过S相(34). 在下一个周期中，细胞开始在S内聚集并在那里停留很长时间。在S相抑制的REF52细胞中，就像在C11细胞中一样，DNA合成受到抑制，正如BrdUrd摄取减少所揭示的那样(34). 此外，当缺乏功能性p53的细胞试图繁殖时，大多数细胞会经历有丝分裂突变和细胞死亡(5). 然而，稀有细胞通过增加CAD活性来克服PALA的影响(22). 具有野生型p53的细胞在PALA中停滞的可逆性强烈表明，它是在没有DNA损伤的情况下发生的，因为只有一次双链断裂可能足以导致人类成纤维细胞的永久性生长停滞(15,38). 通过产生对6TG的抗性来测定的DNA损伤在S期阻滞细胞中也被抑制，再次表明p53抑制这些细胞中DNA损伤的产生。
p53在阻断DNA合成中的作用尚未见报道。我们和其他人已经表明，在没有应激的情况下，p53的过度表达不会阻碍S期的进展，而是会导致G期的停滞1或G2(17,18). 在前面探讨的条件下，p53可能没有被适当修改以实现其S期检查点功能。或者，只有当S期延长时，p53在S期进展中的作用才明显，如PALA的存在。无论p53用什么机制阻止S期进展，p21/waf1都不是必需的，因为缺乏p21表达的C11细胞和p21-null MEF都不会在G期停滞1PALA（参考。13和本研究），在S期积累稳定，不形成PALA抗性菌落（本研究）。棕色等。(26)最近发现，在正常人类细胞中通过同源重组删除p21/waf1基因并不会改变p53介导的基因组稳定性调节，我们发现相同的p21/waf1-null细胞在使用PALA治疗时确实会停滞在S期。总之，p53依赖性抑制PALA耐药细胞的发生可能发生在细胞周期中的两个点，其中一个点独立于p21/waf1。
p53依赖性保护反应对DNA合成抑制的生理重要性。
在几种不同的生理情况下，S期阻滞可能很重要。例如，当生长条件不利或细胞受到压力时，如果细胞试图复制DNA，DNA可能会受损。p53介导的DNA合成阻断可能阻止额外DNA损伤的产生和传播。停搏后，细胞可能修复受损的DNA或在进入下一个细胞周期之前发生凋亡。S相和G中的p53相关检查点2/M也可能有助于保护突变使G所需蛋白失活的细胞1逮捕，如Rb。细胞周期不同部分的多个检查点可能对实现p53维持基因组稳定性的全部能力很重要。在这方面，我们最近发现，在S期阻滞的细胞中，p53的保护功能还包括抑制其进入有丝分裂的能力。用羟基脲处理的p53-完整细胞继续尝试有丝分裂，而p53恢复的相同细胞则没有(5).
