细胞生物学杂志。2008年7月14日；182（1）：35-39。
报告
氨酰化调节层粘连蛋白A的功能，并在与家族性心肌病相关的层粘连蛋白质A突变体中丢失
肯塔基大学钱德勒医学中心分子和细胞生物化学系，肯塔基州列克星敦市，邮编40536
2007年12月20日收到；2008年6月6日接受。
- 补充资料
【补充材料索引】
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摘要
拉敏蛋白A突变可导致多种疾病，包括心肌病和早衰综合征。小泛素样修饰物（SUMO）多肽的共价连接调节许多蛋白质的功能。到目前为止，还没有发现在sumoylation共识序列和sumoylion改变序列中发生人类致病突变的例子。我们发现，层粘连蛋白A在赖氨酸201处被酰化，并且与家族性扩张型心肌病相关的两个层粘连蛋白质A突变体E203G和E203K表现出酰化降低。E203在sumoyalization共识ΨKXE中占据保守的+2位置。拉明A突变体E203G、E203K和K201R均表现出类似的异常亚细胞定位，并与细胞死亡增加有关。来自E203K层粘连蛋白A突变个体的成纤维细胞也表现出层粘连蛋白质A sumoylation降低和细胞死亡增加。这些结果表明，SUMO修饰对正常的层粘连蛋白A功能很重要，并暗示其参与E203G/E203K层粘连A心肌病中的sumoylation改变。
结果和讨论
首先，我们通过使用层粘连蛋白A抗体对HeLa细胞提取物进行免疫沉淀，然后使用针对SUMO-1或SUMO-2/SUMO-3的抗体进行Western免疫沉淀，以测试内源性层粘连蛋白质A的sumoylation（由于SUMO-2和-3的相似性，这两种SUMO蛋白很可能都被该抗体识别）。结果表明，层粘连蛋白A是SUMO修饰的，与SUMO-1相比，SUMO-2对其进行了优先修饰()。中的结果表明小鼠心脏提取物中的层粘连蛋白A也被酰化，与HeLa细胞提取物中存在的层粘着蛋白A一样，SUMO-2似乎是该蛋白的主要SUMO蛋白。
内源性层粘连蛋白A被酰化。（A） 使用抗层粘连蛋白A抗体对HeLa细胞提取物进行免疫沉淀，然后使用抗SUMO-2、SUMO-1或层粘连膜A抗体（与免疫沉淀不同）进行Western blot分析。（B） 使用抗-SUMO-2或-SUMO-1抗体对用于免疫沉淀的HeLa细胞裂解物进行Western blot分析。（C） 使用抗层粘连蛋白A抗体对从小鼠心脏制备的提取物进行免疫沉淀，然后使用抗SUMO-2、SUMO-1或层粘连蛋白质A抗体（不同于用于免疫沉淀的抗体）进行Western blot分析。
对层粘连蛋白A氨基酸序列的分析表明，在层粘连蛋白质A的杆状结构域中，与赖氨酸201周围的sumoylation共识序列ΨKXE（MKEE）相匹配(，顶部）。为了测试赖氨酸201是否发生层粘连蛋白A的sumoylation，用编码野生型层粘连肽A和层粘连素A的GFP融合构建物的哺乳动物表达质粒转染HeLa细胞，其中赖氨酸被改变为非肿瘤性精氨酸（K201R），以及编码HA标记SUMO-1或-2的表达构建物。转染细胞的提取物经过抗GFP抗体免疫沉淀，然后进行抗HA蛋白印迹。本实验的结果与内源性层粘连蛋白A的结果一致，表明野生型层粘连蛋白质A被SUMO-2共价修饰，但没有被SUMO-1有效地酰化(，底部）。结果还表明，K201R层粘连蛋白A突变蛋白未观察到SUMO-2的修饰，表明赖氨酸201是SUMO-2在该蛋白中的附着位点。
SUMO-2在赖氨酸201处对层粘连蛋白A进行酰化，E203G和E203K突变层粘连蛋白质表现出酰化降低。（A） 顶部显示了在层粘连蛋白A的杆状结构域中围绕赖氨酸201的sumoylation位点共识序列（ΨKXE）的匹配（MKEE）位置。底部，将转染GFP融合构建物的HeLa细胞提取物（野生型lamin A或K201R突变lamin A和HA标记的SUMO-1或-2质粒）用抗GFP抗体进行免疫沉淀，然后进行抗HA Western blot。使用抗GFP和抗HA抗体的裂解产物的蛋白质印迹显示GFP–层粘连蛋白A蛋白和HA–SUMO-1/HA–SUMO-2蛋白（并入主要的sumoylated蛋白中）的水平。（B） 顶部显示与家族性扩张型心肌病相关的层粘连蛋白A中E203G和E203K突变位于赖氨酸201周围的sumoylation位点共识序列（ΨKXE）的保守谷氨酸残基。在底部，用野生型层粘连蛋白A、E203G突变层粘连蛋白A或E203K突变层粘连蛋白A的GFP融合构建体转染的HeLa细胞的提取物以及HA标记的SUMO-2用抗GFP抗体进行免疫沉淀，然后进行抗HA蛋白质印迹。用抗GFP抗体通过Western blot测定细胞裂解液中转染GFP–laminA蛋白的水平。
已知sumoylation共识序列ΨKXE中第四位的谷氨酸残基对SUMO在该序列中添加到附近赖氨酸的效率很重要(罗德里格斯等人，2001年;Sampson等人，2001年)。与此相关的是，人类层粘连蛋白A基因的两种不同的疾病相关突变已被鉴定，它们将该蛋白的sumoylation共识序列中该位置（E203）的谷氨酸改变为不同的氨基酸(，顶部；Fatkin等人，1999年;Jakobs等人，2001年)。在其中一个突变体中，谷氨酸203被改变为甘氨酸（E203G），而在另一个突变剂中，它被改变为赖氨酸（E203K）。层粘连蛋白A的E203G和E203K突变均与家族性扩张型心肌病和传导系统疾病相关(Fatkin等人，1999年;Jakobs等人，2001年)但这些突变改变层粘连蛋白A功能的潜在分子机制尚不清楚。基于上一段中证明赖氨酸201处发生层粘连蛋白A的氨酰化的结果，以及先前表明谷氨酸在ΨKXE氨酰化共识序列的前一赖氨酸处对氨酰化起重要作用的结果(罗德里格斯等人，2001年;Sampson等人，2001年)我们假设E203G和E203K突变可能通过降低层粘连蛋白A的sumoylation介导其有害作用。为了测试这个假设的可行性，我们进行了一个转染免疫沉淀实验，类似于除此之外，这里将野生型GFP–laminA的sumoylation与含有E203G或E203K突变的GFP–LaminA结构体进行了比较。实验结果如所示（底部），表明E203G和E203K突变的层粘连蛋白A与野生型层粘连蛋白质相比，都表现出减少的氨酰化。
氨酰化在调节细胞中靶蛋白的功能特性中起着重要作用(海伊，2005;Bossis和Melchior，2006年;Kerscher等人，2006年)。野生型层粘连蛋白A在核外周表现出特征性的定位模式(Broers等人，2006年;Capell和Collins，2006年;Mattout等人，2006年;Parnaik和Manju，2006年)。我们假设赖氨酸201处的层粘连蛋白A的sumoylation可能对这种定位模式很重要。为了验证这一假设，用野生型或K201R层粘连蛋白A-GFP融合表达质粒转染HeLa细胞，然后用荧光显微镜检查。如所示，野生型lamin-A-GFP融合蛋白表现出典型的相对连续的核外周定位模式。然而，K201R层粘连蛋白A-GFP融合蛋白显示出改变的定位模式，突变蛋白似乎集中在病灶中。这些结果表明，层粘连蛋白A的酰化对该蛋白的正常亚细胞定位模式很重要。通过荧光显微镜对E203G或E203K突变层粘连蛋白A的GFP融合构建物的亚细胞定位分析表明，这两种突变蛋白的定位模式都发生了改变，类似于K201R突变层粘着蛋白A的定位模式，这些蛋白集中在病灶中，与核外周野生型层粘连蛋白A的连续出现形成对比()。我们观察到的E203G层粘连蛋白A的模式与之前的研究中观察到的模式相似(Lloyd等人，2002年)。据我们所知，E203K层粘连蛋白A的定位以前没有报道过。表S1显示了野生型和突变型GFP–层粘连蛋白A异常定位的细胞百分比（可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200712124/DC1).
SUMO位点K201R突变的层粘连蛋白A和心肌病相关的E203G和E203K突变的层黏连蛋白A表现出类似的异常定位模式。（A和B）将野生型、K201R、E203G和E203K层粘连蛋白A GFP融合表达质粒转染HeLa细胞（A）或小鼠胚胎心肌细胞（B），并通过共焦荧光显微镜检查GFP–层粘连蛋白质A的亚细胞定位。通过HOECHST 33342染色观察DNA。棒材，5μm。（C） 将野生型、K201R、E203G或E203K层粘连蛋白A-GFP融合表达质粒转染到HeLa细胞中，然后通过台盼蓝试验对其进行分析以测量细胞死亡。数据显示为平均值±SEM。（*，P<0.0001；**，P<00002；***，P<0.0001[针对层粘连蛋白A突变体与野生型]），每个数据集来自三个数据集。
为了确认心肌病相关E203G和E203K层粘连蛋白A突变体在更生理相关的细胞类型中定位改变的影响，我们重复了在小鼠胚胎心肌细胞中。结果如所示表明K201R、E203G和E203K层粘连蛋白A突变体在心肌细胞中均表现出异常的定位模式（与野生型层粘连蛋白质A相比），与在HeLa细胞中观察到的定位模式相似。野生型和突变型GFP–层粘连蛋白A异常定位的细胞百分比如表S1所示。
鉴于K201R、E203G和E203K层粘连蛋白A突变体蛋白的sumoylation缺陷和异常定位模式，我们假设这些层粘连A突变体蛋白质的表达可能导致细胞活力降低。结果如所示这表明情况似乎是这样的，因为所有这三种突变的层粘连蛋白A都与细胞死亡增加有关。
在最后一组实验中，我们检测了从一名E203K层粘连蛋白a突变杂合患者身上获得的皮肤成纤维细胞，如前所述，该突变与心肌病相关(Jakobs等人，2001年)。从这些细胞中对层粘连蛋白A进行免疫沉淀，然后进行SUMO-2蛋白印迹，结果表明，与正常个体的细胞相比，该个体细胞中层粘连肽A的sumoylation水平降低了()。该个体是E203K层粘连蛋白A突变的杂合子，因此我们预计层粘连蛋白A的sumoyalization减少但没有消除。此外，层粘连蛋白A的免疫荧光分析表明，与正常成纤维细胞相比，E203K成纤维细胞更多的细胞表现出异常层粘连蛋白质A定位和核形态()。表现出层粘连蛋白A定位/核形态异常的正常和E203K成纤维细胞的百分比如表S1所示。与对照成纤维细胞相比，E203K成纤维细胞的细胞死亡也增加().
E203K层粘连蛋白A突变个体的成纤维细胞表现出层粘连蛋白质A的sumoylation降低，层粘连蛋白酶A定位/核形态改变，细胞死亡增加。（A） 使用抗层粘连蛋白A抗体对从正常个体和杂合个体的皮肤成纤维细胞制备的E203K层粘连抗体A突变提取物进行免疫沉淀，然后使用抗-SUMO-2抗体或抗层粘着蛋白A抗体（不同于用于免疫沉淀的抗体）进行Western blot分析。（B） 使用抗层粘连蛋白a抗体对正常个体和E203K层粘连a突变杂合个体的皮肤成纤维细胞进行免疫荧光分析。通过HOECHST 33342染色观察DNA。棒材，5μm。（C） 用台盼蓝法分析正常人和E203K层粘连蛋白a人的皮肤成纤维细胞，以测定细胞死亡。数据显示为平均值±SEM（E203K层粘连蛋白A突变细胞与野生型细胞相比P<0.0038），来自三个数据集。
本文的结果表明，层粘连蛋白A的赖氨酸201是SUMO-2蛋白共价修饰的靶点，这种sumoylation对层粘连蛋白质亚细胞定位的正常模式很重要。这些实验的结果还表明，在导致家族性扩张型心肌病的转染的突变型E203G和E203K层粘连蛋白A蛋白中以及在具有E203K突变的个体的成纤维细胞的层粘连蛋白A中，层粘连蛋白A sumoyalization减少。据我们所知，这些是人类致病突变的第一个例子，发生在sumoylation共识序列的关键残基中，导致突变蛋白的sumoylate降低。
结果还表明，突变体E203G和E203K层粘连蛋白A的亚细胞定位模式发生了改变，这与SUMO附着位点突变体K201R层粘连A的蛋白非常相似。这些结果表明，sumoylation在细胞层粘连蛋白a的正确定位中起作用。此外，与野生型层粘连蛋白A或正常皮肤成纤维细胞转染的细胞相比，转染E203G和E203K层粘连A蛋白的细胞以及E203K突变个体的皮肤成纤维纤维细胞分别表现出更高的细胞死亡水平。总之，这些结果表明，氨酰化对正常的层粘连蛋白A功能很重要，并支持氨酰化改变在与E203G/E203K层粘连A突变相关的家族性扩张型心肌病的潜在分子机制中的作用。
材料和方法
细胞培养和质粒
HeLa细胞在DME培养基（Mediatech，Inc.）中培养，在5%CO中添加10%FBS和100×抗生素-抗真菌（Invitrogen）2人皮肤成纤维细胞（由佛罗里达州迈阿密大学R.Hershberger提供）在添加2 mM谷氨酰胺的相同培养基中培养。根据制造商的方案，使用效应基因转染试剂（QIAGEN）转染HeLa细胞。转染48小时后进行免疫沉淀分析和荧光显微镜检查。GFP–lamin A质粒由pcDNA3.1-LMNA质粒构建（N.Zhong和W.T.Brown馈赠，纽约州斯塔顿岛发育障碍基础研究所）。用EcoRI和BamHI消化法切下层粘连蛋白A的编码区，并连接到pEGFP-C2载体（Clontech Laboratories，Inc.）。进行突变PCR以产生GFP–层粘连蛋白A K201R、E203G和E203K突变体。用于诱变的引物如下（仅列出顶部引物，底部引物为每个引物的反向互补）：K201R，5′-CTG CAG ACC ATG AGG GAG GAA CTG GAC-3′；E203G，5′-ACC ATG AAG GAG GGA CTG GAC TTC CAG-3′；和E203K，5′-ACC ATG AAG GAG AAA CTG GAC TTC CAG-3′。HA–SUMO-1和–SUMO-2使用pcDNA3–HA–SUMO-1和–HA–SUMO-2质粒表达（由德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南分校K.Orth提供）。
免疫沉淀分析
对于免疫沉淀实验，将转染HeLa细胞或人皮肤成纤维细胞的细胞颗粒重新悬浮在500μl RIPA缓冲液（150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 7.4、1%NP-40、0.2%SDS、0.25%脱氧胆酸钠和1 mM EDTA）中，并加入蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）、1 mM DTT和20 mMN个-乙基马来酰亚胺（添加新鲜）。通过超声波进行细胞裂解，然后将样品在冰上培养20分钟。在4°C下以10000 rpm离心10分钟后，将上清液转移到新鲜试管中，去除20μl全细胞裂解液以分析转染的GFP–层粘连蛋白A的水平。300μl 50%蛋白G–Sepharose浆液（GE Healthcare）用PBS洗涤三次，然后再悬浮在RIPA缓冲液中，制成50%浆液。将细胞裂解物与150μl该浆液和5μg山羊IgG混合，并在4°C下孵育60分钟，从而预先清除细胞裂解物。在4°C下以4000rpm离心1分钟后，将上清液转移到新鲜试管中，并与5μg抗GFP抗体（Bethyl Laboratories，Inc.）或抗层粘连蛋白a抗体（BD Biosciences）混合。在4℃培养60 min后，添加150μl 50%蛋白G–Sepharose浆液，并在4℃下培养60 min。用RIPA缓冲液洗涤珠子四次，然后在50μl 4×SDS-PAGE加载缓冲液中煮沸。在短暂离心后，使用下一节中描述的抗体对上清液进行SDS-PAGE和Western blot。
蛋白质印迹分析和抗体
根据标准程序进行SDS-PAGE和Western blot。用于检测蛋白印迹的抗体和稀释液如下。山羊抗GFP抗体（Bethyl Laboratories，Inc.）以1:2000使用，小鼠抗HA抗体（肯塔基州列克星敦肯塔基大学D.Andres实验室赠送）以1:2000使用，山羊抗-SUMO-1抗体（Bethyl Laboratories，Inc.）以1:1000使用，兔抗-SUMO-2抗体（Abgent）以1:500使用，在1:500时使用兔抗层粘连蛋白A抗体（Abcam）。
荧光和免疫荧光显微镜
细胞接种在盖玻片上。在用野生型或点突变型GFP–laminA表达构建物转染后48小时，向培养基中分别添加HOECHST 33342和维拉帕米，直至最终浓度分别为5和50μg/ml。在37°C下孵育30分钟后，用PBS清洗两次盖玻片，然后在室温下在3.7%PFA中孵育20分钟。用PBS和蒸馏水清洗两次后，盖玻片放在kimwipe上，使其部分干燥，然后装在有15μl VectorShield斑点的玻片上（Vector Laboratories）。为了进行免疫染色，在用PBS清洗两次后，将盖玻片在37°C含有3%BSA的PBS中孵育1小时，然后在37°C下与兔抗层粘连蛋白A抗体（1:1000）孵育30分钟。用PBS冲洗盖玻片两次之后，在37℃下与荧光素抗兔IgG（1:200）孵养30分钟。在用PBS进行两次清洗和用蒸馏水进行短暂清洗后，将盖玻片安装在带有15μl VectorShield斑点的载玻片上。盖玻片上多余的液体是有害的，盖玻片的边缘用指甲油密封。然后使用具有Spotcam数字成像相机（Nikon）的共焦（TCS SP5；Leica）或荧光（Nikon）显微镜对荧光进行可视化。这些图片是使用Photoshop（Adobe）制作的。
台盼蓝细胞活性测定
通过在4°C下以1000 rpm离心10 min收集细胞，并用PBS清洗颗粒两次。然后将细胞颗粒重新悬浮在PBS中，浓度为～106细胞/ml。使用含有0.4%台盼蓝染色剂（Invitrogen）的溶液制备一对一稀释的悬浮液，然后将悬浮液装入血细胞仪的计数室。计算染色细胞的数量和细胞总数，并用染色细胞的百分比表示细胞死亡的百分比。每个实验分析三个数据集。
统计分析
使用Student’st吨测试。p值<0.05被认为具有统计学意义。
心肌细胞的制备
这些细胞由W.Lester和J.Satin（肯塔基大学，肯塔基州列克星敦）提供。本研究中使用的所有动物和动物程序均由肯塔基大学动物护理和使用委员会批准。E16小鼠（ICR近交系；Harlan）的心脏被剥离，不含结缔组织，心室与圆锥花序、静脉窦或心房分离。如前所述，对细胞进行酶分散和培养(Cribbs等人，2001年)。简言之，将10到40个胚胎切碎，并迅速转移到名义上的钙2+-含有0.5 mg/ml胶原酶（II型；沃辛顿）和1 mg/ml胰酶的游离消化缓冲液，两个15分钟周期。在由含有10%FBS的DME组成的培养基中，消化的组织产生了大量的单个自发搏动的细胞。
致谢
我们非常感谢Ray Hershberger博士为正常和E203K层粘连蛋白A个体提供皮肤成纤维细胞，Nanbert Zhong博士和W.Ted Brown博士为pcDNA3.1-LMNA质粒，Kim Orth博士为HA–SUMO-1和HA–SUMO-2表达质粒，Doug Andres博士为抗HA抗体，William Lester和Dr。Jon Satin对胚胎心肌细胞的馈赠。我们还感谢我们实验室的成员进行了富有见地的讨论。
这项研究得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）对K.D Sarge的GM64606资助。
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