美国国家科学院院刊。1999年12月7日；96(25): 14559–14564.
改变状态：磷酸化CagA参与诱导宿主细胞生长变化幽门螺杆菌
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E.D.西格尔
*微生物与免疫学系，†消化疾病中心，以及§斯坦福大学医学院，斯坦福大学，加利福尼亚州斯坦福94305
J.Cha先生
*微生物与免疫学系，†消化疾病中心，以及§斯坦福大学医学院，斯坦福大学，加利福尼亚州斯坦福94305
J.罗
*微生物与免疫学系，†消化疾病中心，以及§斯坦福大学医学院，斯坦福大学，加利福尼亚州斯坦福94305
S.Falkow公司
*微生物与免疫学系，†消化疾病中心，以及§斯坦福大学医学院，斯坦福大学，加利福尼亚州斯坦福94305
L.S.汤普金斯
*微生物与免疫学系，†消化疾病中心，以及§斯坦福大学医学院，斯坦福大学，加利福尼亚州斯坦福94305
*微生物与免疫学系，†消化疾病中心，以及§斯坦福大学医学院，斯坦福大学，加利福尼亚州斯坦福94305
S.Falkow撰稿
摘要
幽门螺杆菌存在于世界一半人口中，是一种非常成功的病原体。它可以在人体胃中存活数十年，对宿主几乎没有明显影响。然而，它也是胃炎、溃疡、胃癌等多种胃病的病因，世界卫生组织已将其列为1类致癌物。我们之前已经证明145-kDa蛋白的磷酸化和信号转导通路的激活与幽门螺杆菌胃细胞。这里我们将145-kDa蛋白鉴定为幽门螺杆菌CagA蛋白。我们还表明，CagA对在宿主胃细胞中诱导类似于肝细胞生长因子（HGF）诱导的生长因子样表型（蜂鸟）是必要的。此外，我们还鉴定了在附着后由幽门螺杆菌，我们称之为SFA（相关应力纤维）。SFA独立于CagA，由I型和II型生产幽门螺杆菌.
H、 ；；三幽门螺杆菌导致人类胃炎和十二指肠溃疡，并被认为是胃癌和粘膜相关淋巴组织淋巴瘤发生的前兆。世界卫生组织对幽门螺杆菌作为1型致癌物(1). 机制幽门螺杆菌导致这些疾病的状态基本上仍不清楚。几种细菌毒力因子，包括尿素酶、液泡细胞毒素（VacA）和致病岛（PAI）(2)已确定。CagI PAI的存在与毒性I型菌株有关，而缺乏PAI的菌株毒性较小，被归类为II型(2). 我们之前对I型病毒的调查幽门螺杆菌与人胃上皮细胞的相互作用表明，附着诱导微绒毛消失、附着部位的杯状/基座形成、细胞骨架重排和Il-8的产生(三,4). 此外，至少有两条信号转导途径被激活，导致细菌粘附位点附近蛋白质的酪氨酸磷酸化(4). 主要磷酸化蛋白为145kDa；值得注意的是，I型菌株而非II型菌株介导了这种磷酸化事件，将其与发病机制联系起来。
提供的分子质量幽门螺杆菌是否有能力使一个好的（正常的）细胞变成坏的（恶性的）是未知的。从有关细胞转化的大量可用数据和有关幽门螺杆菌和细胞微生物学，可以预测幽门螺杆菌能够改变宿主细胞的信号转导途径，导致细胞特性改变。研究表明，CagA是一种由I型产生的高抗原性蛋白幽门螺杆菌和PAI中编码的，在Il-8的诱导中不起作用，而其他PAI编码的基因对细胞因子的诱导至关重要。在这里，我们将145-kDa磷酸化蛋白鉴定为CagA，并描述其在幽门螺杆菌发病机制。我们还鉴定了由幽门螺杆菌人类胃上皮细胞，其中一个与I型相关幽门螺杆菌和CagA蛋白，另一个由I型和II型表达幽门螺杆菌.
材料和方法
细菌菌株和细胞系。
幽门螺杆菌菌株87A300来自加利福尼亚州伯克利卫生服务部。它是一种人类临床分离物（I型），产生VacA、尿素酶、CagA和相邻的cag1 PAI。该菌株按照描述生长(三).幽门螺杆菌菌株G27（I型）及其突变体（包括VacA敲除）和菌株G50（II型）由Antonio Covacci（意大利西耶纳免疫生物学研究所）提供，参考文献中对其进行了描述。4CagA和CagA/VacA双敲除突变体幽门螺杆菌G27由N.Salama在我们的实验室（斯坦福大学，加利福尼亚州斯坦福）生产。AGS细胞（American Type Culture Collection CRL 1739）是一种人胃腺癌上皮细胞系，在DMEM/F12和10%胎牛血清中生长，但在血清饥饿条件下除外。Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞（斯坦福大学J.Theriot捐赠）在DMEM和10%胎牛血清中生长，血清饥饿条件除外。
酪氨酸磷酸化蛋白质的免疫沉淀。
裂解物由感染了幽门螺杆菌如前所述87A300(三)并在使用前储存在−80°C。使用制造商描述的50000标称分子量限值Amicon浓缩器（Millipore）进行蛋白质浓缩。单克隆抗磷酸酪氨酸抗体（Py20，加利福尼亚州圣地亚哥信号转导实验室）通过二甲基吡米特交联到蛋白质G Sepharose珠（法玛西亚生物技术公司），用冷PBS洗涤两次，添加到浓缩裂解液中，并在4°C下摇晃过夜。收集珠子（1500rpm×200克)上清液被吸入。用冷PBS洗涤两次后，在1×SDS/PAGE负载缓冲液的等体积中煮沸10分钟，洗脱蛋白质。再次煮沸以确保所有蛋白质都已释放。
质谱肽图谱。
从珠中释放的蛋白质样品在Bio-Rad Protean II单元中浇铸的10%SDS/PAGE凝胶上运行。用抗磷酸酪氨酸免疫印迹凝胶进行平行比较，以确定感兴趣的条带。用剃须刀将带切除，送往哥伦比亚大学蛋白质核心（纽约），用Lys-C（罗氏分子生物化学）进行酶消化，然后进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析(5). 所收集的肽块与人类和幽门螺杆菌蛋白质数据库。
抗体和试剂。
兔多克隆抗体-幽门螺杆菌以前曾描述过抗体(4). 从Austral Biological购买单克隆和多克隆抗CagA，并以1:100的稀释度使用。FITC缀合的山羊抗兔、四甲基罗丹明B异硫氰酸酯（TRITC）缀合的山羊抗小鼠和TRITC标记的鬼笔肽购自Sigma。Vectashield安装培养基（含或不含4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI））来自Vector Laboratories。重组HGF购自Calbiochem。
相位对比显微镜。
AGS电池（1×105)使用完整的培养基将培养基放置在60mm的组织培养皿中，允许附着2-4小时，然后取出培养基并用无血清培养基替换。第二天早上，抽吸培养基，适当数量的细菌（5×106, 5 × 107，或5×108)加入最终体积为2 ml的无血清培养基中。在感染后的不同时间内，使用奥林巴斯CK2倒置显微镜和附带的奥林巴斯显微照片PM-10AD系统进行相控显微镜检查。
免疫荧光（IF）显微镜。
对于IF研究，1×104每个孔将AGS细胞镀入完整培养基中的四腔组织培养载玻片（Falcon）中。2-4小时后，取出培养基并用无血清培养基替换。第二天早上，抽吸培养基，适当数量的细菌（5×105, 5 × 106，或5×107)加入无血清培养基中，最终体积为400μl。培养载玻片，并在适当的时间点抽吸微孔，用PBS（pH 7.4）清洗五次，然后进行IF处理。IF显微镜是使用尼康Optiphot倒置显微镜和尼康HFX摄影系统进行的。利用奥林巴斯IX-70倒置显微镜，在Applied Precision（华盛顿州Issaquah）DeltaVision反卷积系统上进行反卷积成像。利用反褶积三维模型程序进行三维建模。
结果
145-kDa磷酸化蛋白的鉴定。
145-kDa蛋白的鉴定通过质谱分析完成。感染AGS细胞的裂解物幽门螺杆菌如前所述，制备了87A300(4)，浓缩，并通过使用与ProteinG Sepharose珠交联的抗磷酸酪氨酸单克隆抗体进行免疫沉淀。通过煮沸从小球中去除免疫沉淀蛋白，在10%SDS/PAGE凝胶上分离，从凝胶中提取感兴趣的条带，并用Lys-C进行酶消化，然后进行质谱分析。所收集的肽块与人类和幽门螺杆菌蛋白质数据库，结果如图所示。鉴定出10个肽匹配物，占CagA蛋白的16.0%。这些数据表明，该蛋白并非如先前推测的那样来源于宿主，而是来源于幽门螺杆菌CagA蛋白。我们的结果证实并扩展了M.Stein、R.Rappuoli和A.Covacci的结果，显示CagA后的磷酸化幽门螺杆菌绑定到AGS单元（个人通信）。
CagA蛋白的氨基酸序列幽门螺杆菌菌株26695（基因组研究所）。酪氨酸磷酸化蛋白的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析中确定的区域以红色突出显示。
I型反卷积IF幽门螺杆菌附着在AGS细胞上的CagA蛋白磷酸化的额外证据（图。). 图。A类显示的图像幽门螺杆菌G27附着在AGS细胞上，并对细胞核DNA（宿主DNA和细菌DNA均为蓝色）、CagA（红色）和磷酸酪氨酸（绿色）进行免疫染色。CagA集中在与磷酸化酪氨酸共定位的少数区域。该区域的三维导线建模，如图中的箭头所示。A、，如图所示。 B类和C类，带2B类横截面和2C类纵向视图。这些图表明，CagA与磷酸酪氨酸形成了一个圆柱结构；圆筒的一端与相邻的细菌相连。
反卷积免疫荧光和三维建模幽门螺杆菌连接到AGS电池。(A类)幽门螺杆菌将附着于AGS细胞上的G27菌株用DAPI染色[将宿主细胞细胞核（大粉红色箭头）和细菌细胞核（小粉红色箭头）染色为蓝色]、抗CagA抗体（红色）和抗磷酸酪氨酸抗体（绿色）。绿色和红色呈黄色。该图像由0.2μm Z轴截面组成。中白色箭头指示的区域A类用于生成三维导线模型，如所示B类和C类.C类是的纵向视图B类. (B类和C类)幽门螺杆菌为蓝色，CagA为红色，磷酸酪氨酸为绿色。在应用精密DeltaVision反卷积系统上成像和建模。
CagA桩的位置幽门螺杆菌附件。
免疫荧光分析幽门螺杆菌用抗CagA抗体附着在AGS细胞上，并用反卷积显微镜检测。CagA蛋白可以直接在幽门螺杆菌附着在宿主细胞上并延伸到宿主细胞质中（图。 A–C). 如图所示。 B类和C类，CagA似乎通过极性机制插入宿主，在细菌附近形成同心结构。
反卷积免疫荧光和三维建模幽门螺杆菌连接到AGS电池。幽门螺杆菌应变G27(A–F)，菌株87A300(G–I). (A类)幽门螺杆菌附着在AGS细胞上并染色幽门螺杆菌（红色）和CagA（绿色）。Colocalization为黄色。该字段为0.2微米图像。(B类)幽门螺杆菌附着在AGS细胞上并染色幽门螺杆菌（红色）和CagA（绿色）。Colocalization为黄色。该场是0.2微米图像的体积合成。(C类)中箭头指示的区域B类放大倍数为C类. (D类)幽门螺杆菌附着在AGS细胞上并染色幽门螺杆菌（蓝色）、CagA（绿色）和肌动蛋白（红色）。绿色和红色呈黄色，蓝色和绿色呈青色，红色和蓝色呈洋红。该场是0.2微米图像的体积合成。中箭头指示的区域D类用于生成如所示的三维实体模型E类和F类.F类是的侧视图E类. (E类和F类)幽门螺杆菌是蓝色的，CagA是绿色的，actin是红色的(G公司)幽门螺杆菌（小的粉红色箭头）附在AGS细胞上并染色幽门螺杆菌（蓝色）、CagA（绿色）和肌动蛋白（红色）。绿色和红色呈黄色，蓝色和绿色呈青色，红色和蓝色呈洋红。该字段为0.2微米图像。中的字段G公司用于生成三维导线模型，如所示H（H）. (H（H）)幽门螺杆菌是蓝色的，CagA是绿色的，actin是红色的(我)幽门螺杆菌贴在AGS细胞上的（小粉红色箭头）用DAPI染色[染色宿主细胞核（大粉红色箭头）和细菌细胞核DNA蓝色]、抗CagA（绿色）和肌动蛋白（红色）。绿色和红色呈黄色，蓝色和绿色呈青色，红色和蓝色呈洋红。该场是0.2微米图像的体积合成。在应用精密DeltaVision反卷积系统上成像和建模。
生成数据以生成图中的图像。 D类和G公司用于生成三维实体和线模型。图中中频图像的3D建模。D类如图所示。 E类和F类这些模型证实了图中所示的数据。显示CagA形成圆柱形结构。CagA圆筒最常与内部细菌有关，尽管也可以看到空的CagA圆柱体；它经常被发现与动态肌动蛋白动员的区域共定位，例如小孢子形成（图。 G公司和H（H）)和细胞皱褶（图。我). 未全部附加幽门螺杆菌似乎生产了一个CagA气缸。这些结果表明，在附着后的早期，CagA通过极性方式插入宿主细胞幽门螺杆菌随后，在细菌附近或周围形成CagA圆柱体；这种结构经常在肌动蛋白募集区域附近发现。
Ⅰ型诱导宿主胃细胞生长因子样反应幽门螺杆菌.
使宿主细胞与幽门螺杆菌（感染多重性>10:1）在AGS细胞中诱导生长因子样反应（图。). 这种表型的特征是细胞扩张和拉长生长，出现跛足（细胞边缘出现薄肌动蛋白片）和丝状突起（指状突起包含紧密的肌动蛋白丝束）；我们将其标记为蜂鸟表型（图。B类). MDCK细胞在粘附幽门螺杆菌（图。E类). 这种表型的诱导是I型特有的幽门螺杆菌并且依赖于剂量和时间（数据未显示）。对PAI中先前显示影响磷酸化的等基因突变体的分析表明，蜂鸟表型与分离物诱导145-kDa蛋白酪氨酸磷酸化的能力相关（数据未显示）。这些结果提供了I型毒力之间的直接联系幽门螺杆菌分离物、PAI、CagA磷酸化和诱导宿主细胞生长变化。
术后AGS和MDCK细胞的相差显微镜观察幽门螺杆菌附件。(A类)AGS控制，30小时(B类)AGS plus公司幽门螺杆菌G27，30小时(C类)AGS plus公司幽门螺杆菌77国集团/cagA公司，30小时(D类)AGS plus公司幽门螺杆菌77国集团/真空吸尘器，30小时(E类)MDCK加幽门螺杆菌87A300，24小时(我)MDCK加HGF，24小时。
AGS细胞中诱导的蜂鸟表型与MDCK细胞中HGF激活c-Met受体的报道相似(6). 因此，我们在上述附着试验中使用MDCK细胞来观察是否幽门螺杆菌能够诱导类似的细胞表型。附着后产生的表型幽门螺杆菌MDCK细胞与向细胞单层中添加纯化的HGF产生的细胞似乎相同（图。 E类和F类).
I型和II型诱导的形态发生表型幽门螺杆菌.
同基因CagA突变体的显微分析幽门螺杆菌菌株G27提供了第二种表型的证据，其特征是产生丝状体、多核、扩散和宿主细胞的空泡化增加（图。C类). 这种表型在I型中变得明显幽门螺杆菌在较低的感染倍数（<10:1）或附着后的较早时间点。免疫荧光分析显示，感染CagA基因敲除的宿主细胞中产生了数量惊人的应激纤维（图。)与野生型相比；我们将其标记为应力纤维相关（SFA）表型。第二种表型的产生与CagA无关，I型和II型均可观察到幽门螺杆菌关于感染条件的变化。对菌株G27的一个等基因VacA突变体和一个CagA/VacA双敲除突变体的分析表明，VacA不必产生上述两种表型中的任何一种（图。D类和D类).
反卷积免疫荧光幽门螺杆菌贴在AGS细胞上5小时（0.2μm切片）。所有区域都被肌动蛋白染色。(A类)AGS控制(B类)加幽门螺杆菌G27(C类)加幽门螺杆菌77国集团/cagA公司, (D类)加幽门螺杆菌77国集团/cagA公司/真空吸尘器图为应用的精密DeltaVision反卷积系统。
讨论
研究最深入的蛋白质之一幽门螺杆菌已成为CagA，但其功能尚未确定。此处显示的数据（图。和)将CagA鉴定为酪氨酸磷酸化蛋白，之前称为145-kDa蛋白，并表明CagA的磷酸化是宿主细胞产生生长因子样反应所必需的。附着在细胞表面的细菌百分比与高浓度CagA的形成有关，CagA似乎在细菌周围形成一个细胞外的圆柱形结构（图。和). 目前还不知道为什么只有一些幽门螺杆菌生产CagA气缸。一种可能性是，该事件发生在个别细菌附着后的不同时间。另一种解释是，在细胞表面或细胞质中存在宿主细胞因子，这是生成CagA圆柱体所必需的。CagA柱体的位置通常与肌动蛋白重组的活跃区域有关，如小孢子形成和皱褶。这种关联可能表明CagA柱体的功能（通过未知机制）通过引导细胞伸长和运动来引导宿主细胞的运动。图中，CagA气缸位于褶边的中间位置。我与细菌无关，尽管褶边底部存在细菌。这一现象表明肌动蛋白重组可能是在CagA柱形成后发生的。
CagA插入宿主细胞似乎是通过幽门螺杆菌由cag PAI编码的IV型分泌系统（M.Stein、R.Rappouli和A.Covacci，个人通讯）。这一特征，再加上CagA在附着到宿主细胞后发生磷酸化及其与细胞骨架重排的关联，使我们可以将其与肠致病性疾病进行类比大肠杆菌轮胎蛋白(7). Tir由细菌EspE基因编码，最初被认为是真核蛋白。在细菌III型分泌系统将Tir分泌到宿主膜后，Tir被酪氨酸磷酸化，并作为细菌表面上内膜结合的受体，诱导宿主细胞信号通路。
我们已经证明了这一点幽门螺杆菌能够诱导细胞在粘附培养的胃上皮细胞时发生变化。由幽门螺杆菌与时间和剂量有关。这一特征使人联想到细菌毒素对宿主细胞产生的变化，并提请注意，毒素诱导的许多变化都是由与真核生物生长因子诱导的相同信号转导因子的干扰引起的（综述见参考文献。8). 已确定的细胞变化之一（蜂鸟）是宿主细胞的急剧伸长和扩散，包括丝状体和跛足纲的产生。蜂鸟的反应只由I型引起幽门螺杆菌并依赖于细菌CagA蛋白的磷酸化。这种反应与观察到的c-Met受体的HGF激活类似(6). 第二种宿主反应（SFA）是由I型和II型诱导的，其特征是产生大量应激纤维、丝状体、多核、细胞扩散和增加空泡化幽门螺杆菌并且独立于CagA。这种细胞反应类似于大肠杆菌CNF-1毒素，激活Ras GTPases Rho、Rac和cdc42(9,10). SFA细胞表型也类似于由激活鸟嘌呤核苷酸交换因子Tiam1产生的表型，该因子激活Rac(11)并且已经证明可以根据细胞类型和底物增强或抑制细胞-细胞的粘附和迁移(12,13). 液泡毒素幽门螺杆菌（VacA）通过导致含有Rab7的内质体溶酶体液泡的积累来干扰囊泡的运输，但在所述的任何一种宿主反应表型中都不起作用（图。和).
我们已经证明，CagA的酪氨酸磷酸化发生，并与I型诱导的发病机制相关幽门螺杆菌胃细胞。I型诱导的细胞运动幽门螺杆菌可能在I型感染相关的致癌过程中起重要作用。与CagA（蜂鸟）相关的宿主细胞变化实际上掩盖了I型和II型引起的第二类变化（SFA）幽门螺杆菌二类幽门螺杆菌与胃癌无关，并且似乎只诱导轻微的炎症细胞反应。我们已经确定了II型病毒的毒力特征幽门螺杆菌，提示SFA表型也可能在胃炎的发病机制中起作用。这一发现可能揭示了II型幽门螺杆菌导致疾病。
鸣谢
我们感谢R.Rappouli和A.Covacci共享数据和进行个人通信。这项研究得到了美国国立卫生研究院拨款AI23796（给L.S.T.）的支持。
缩写
| 个人事故保险 | 致病岛 |
| 真空断路器 | 空泡细胞毒素 |
| DAPI公司 | 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚 |
| 国际单项体育联合会 | 免疫荧光 |
| 三维 | 三维 |
| HGF公司 | 肝细胞生长因子 |
| 国家林业局 | 应力纤维相关 |
| MDCK公司 | Madin–Darby犬肾 |
工具书类
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