视黄醇和非视黄醇抑制视觉周期的代谢基础脊椎动物中的化合物视网膜^*

摘要

在脊椎动物感光细胞中，视觉对光的吸收生色团，11-顺式-视网膜，与视紫红质结合导致其全光异构化-反式-视网膜和光转导信号级联（参考文献。1). 为了确保持续的视野，11-顺式-视网膜通过一系列复杂的被称为视觉或维甲酸循环的酶反应（参考文献。2–4).该通路位于视网膜色素上皮（RPE）^三和感光细胞。视觉生色团再生的关键酶步骤是所有的异构化-反式-棕榈酸视黄酯和其他酯至11-顺式-RPE65催化反应中的视黄醇(5–7).

维甲酸循环对维持视力的重要性已被证明由编码基因突变引起的疾病的数量和种类参与这一过程的蛋白质(2). 三种主要策略有被开发用于治疗这些疾病。第一种使用病毒介导的转移基因技术来替换有缺陷的基因。这种方法具有成功挽救Leber先天性小鼠和狗模型的视力黑蒙和视网膜色素变性(8–13).第二种方法涉及缺少的药物补充发色团主要应用于以细胞缺陷为特征的疾病类视黄醇生物合成(13–16).第三种策略是通过抑制维甲酸循环的具体步骤(17–20).这种方法用于与有毒物质积累相关的疾病视觉循环副产品(例如脂褐素荧光团，例如N个-视黄烯-N个-视黄基乙醇胺（A2E）及其衍生物衍生物）可导致多种形式的视网膜退化(21–23).具有这种表型的疾病包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性和Stargardt病（参考文献。2).

视觉周期抑制剂可分为四类它们的化学结构。第一个包含13个-顺式-维甲酸的酸（13-顺式-RA）及其羟基苯酰胺全部-反式同分异构体，芬雷替尼(图1A类). 这些维甲酸抑制剂已被用于治疗痤疮和癌症的化学预防(24). 临床报告显示13岁儿童的延迟黑暗适应和夜盲-顺式-RA治疗引起了人们对这些化合物作为潜在视觉疗法的关注(25,26). 13摄氏度是-RA是发现抑制11-顺式-视黄醇脱氢酶，催化视觉循环中的最后一个酶步骤(27)，并绑定RPE65(28). 芬雷他尼减缓了类视黄醇进入眼睛的流量，很可能是通过降低维生素A水平与血清视黄醇结合蛋白（RBP）结合(17). 两种化合物均减少眼睛中的A2E沉积(18–20).全部-反式-视黄胺（Ret-NH₂)及其衍生物(图1B类)可以施加类似的效果。作为异构化的过渡态模拟物开发反应，Ret-NH₂禁止11-顺式-视黄醇生产(29,30). 此外，视网膜-NH₂是可逆的N个-卵磷脂乙酰化：视黄醇酰基转移酶（LRAT）并储存在RPE内的视网膜小体中(30–32).最后一个特征可能有助于其高效运输和维甲酸循环的长期抑制体内.含法尼基的类异戊二烯衍生物，最初由Rando表征和同事(33)，属于第三组抑制剂。这些被认为是通过交互作用发挥作用的带RPE65(图1C类),尽管他们的治疗效果被收回(34). 最后一节课抑制剂由非tinoid疏水伯胺和治疗潜力。这些化合物尚待评估(图1D类).

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图1。

视觉周期抑制剂和类异戊二烯的结构。基于它们的化学结构，被研究的化合物分为四类组：维甲酸衍生物(A类)，带正电荷的类视黄醇(B类)，含法尼基的类异戊二烯(C类)和非tinoid疏水伯胺，如法尼胺(D类).

在目前的工作中，我们使用了生物化学、细胞培养和在里面活泼地比较其性质和治疗的实验方法各种可能有益于视网膜的维甲酸循环抑制剂的潜力疾病。我们评估了抑制效果和效力、分子靶点以及作用方式体内和在体外.法尼西胺和法尼醇衍生物被用来研究氨基在抑制维甲酸循环。最后，我们评估了血清的作用RBP/STRA6（维甲酸反应基因产物6）在传递一些这些治疗药物对眼睛的影响。

材料和方法

动物—卢比^–/–老鼠是之前生成和描述的(35,36)，其基因型为已发布协议确认(36). 所有老鼠都来自混合C57Bl/6×sv129遗传背景。拉特^–/–小鼠的产生和基因分型为如前所述(55).阿布卡4^–/–小鼠按标准生成程序（Ingenious Targeting，Inc.，Rochester，NY）。目标载体通过将外显子1替换为新磁带。阿布卡4^–/–小鼠被维持在混合状态C57BL/6和129Sv/Ev的背景，以及具有亮氨酸残基的同胞使用450（Leu-450）的RPE65。用PCR对小鼠进行基因分型引物ABCR1（5′-GCCAGTGGTCGATCGTCTAGCT-3′）和ABCR2野生型（WT）（619 bp）和A0（5′-CCACAGACATCATCTCC-3′）和N1（5′-TGCGAGCCAGAGGCCACTTGTAGC-3′）用于靶向删除（455bp）。对PCR产物进行克隆和测序以验证其身份。

通常使用6周龄的小鼠进行这些实验。老鼠是一直保持在黑暗中，所有实验操作在昏暗的红光下通过伊士曼柯达公司的安全灯执行过滤器。所有动物手术均由凯斯西储大学批准并符合美国兽医协会的建议安乐死协会专门委员会和视力与健康研究协会眼科学。新鲜的牛眼是从当地一家屠宰场获得的（俄亥俄州布里斯托尔维尔的马汉包装公司）和RPE微粒体由牛眼镜(37).

材料和化学合成—13-顺式-RA和全部-反式-RA购自西格玛，芬瑞替尼购自多伦多Research Chemicals Inc.（加拿大多伦多）。(2E类,6E类)-N个-十六烷基-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三胺（TDH）和(12E类,16E类)-13,17,21-三甲基docosa-12,16,20-三烯-11-酮（TDT）由Acucela Inc.（华盛顿州Bothell）合成。视网膜-NH₂是如前所述合成(29,30). 法尼西胺是法尼基溴与邻苯二甲酰亚胺钾反应制备(38). 反应进度为通过TLC监测。衍生法呢胺的化学结构N、 O（运行）-双（三甲基硅基）三氟乙酰胺用气相色谱-质谱法验证了三甲基氯硅烷光谱分析。

NIH3T3细胞系的稳定转导-NIH3T3稳定表达LRAT的细胞系和两个表达LRAT和LRAT的双稳定细胞系使用LRAT/RPE65和LRAT/STRA6。全长人用LRAT、RPE65和STRA6用于制备这些细胞系的克隆是从American Type公司购买的文化收藏馆（弗吉尼亚州马纳萨斯）。用于构建逆转录病毒表达载体LRAT、RPE65和STRA6 cDNA通过PCR扩增，EcoRI和NotI通过使用在编码序列的末端引入限制性位点以下引物：STRA6、GCAGATGAATTCACATGTCGTCCCAGCCAGCAGCAGG和CGTCTAGCGGCCCGCTCAGGGCGCACCATTGG；轻轨交通，GAGGTGATTCAGCTACTACGCAGGAGAACCCATGCTGG和ACTGACGCGCCGCATGAAGTTAGCCACCATCATAG；RPE65、，TCTGGGAATTCAACTCAACTGGAAAATGTCTATCCAGGTGAG和CTTGCTGGCGCCGCTCAAGATTTTTTGAACAGCTCC。这些引物被克隆到由Dr。T.Kitamura（东京大学）(39). 插入物已排序并确认与LRAT、RPE65和STRA6参考序列相同存放在Ensemble数据库中。Phoenix Eco逆转录病毒产生细胞在生长培养基（GM）中培养NIH3T3细胞由Dulbecco改良的Eagle's培养基组成，pH值7.2，含4m米 我-谷氨酰胺、4500毫克/升葡萄糖和110毫克/升钠丙酮酸，补充10%热灭活胎牛血清，100单位/ml青霉素和100单位/ml链霉素。细胞保持在5%CO中37°C₂转染前24小时，2.5× 10⁶Phoenix Eco细胞接种在6厘米的板上在6 ml GM中培养。为了生成转染混合物，1 ml 50米米HEPES，pH 7.05，含10m米KCl，12米米葡萄糖，280米米NaCl和1.5 m米纳₂高性能操作₄添加到相等体积的250米米氯化钙₂含有20μg质粒DNA的溶液，混合，孵育1分钟，滴入细胞。这种培养基是转染后8小时用新鲜GM替换，24小时后再次替换。转染后48小时收集逆转录病毒上清液，离心以1500rpm离心5分钟以除去分离的细胞，等分成0.5-ml部分，在液氮中冷冻，并在-80°C下储存。24小时转导前，2×10⁵NIH3T3成纤维细胞被镀每6厘米皿装6毫升GM。对于转导，该培养基被替换为由2.5 ml GM（刚刚收集的，不是新鲜GM）组成的混合物，0.5ml病毒上清液和5μg/ml Polybrene。盘子很轻在30°C和5%CO中旋转并培养24小时₂之前用新鲜GM替换培养基。达到汇合后，细胞以2×10的速度劈开并播种⁵.这个感染周期是重复2-4次。

LRAT、视黄醇脱氢酶（RDH）和酶异构化Assays公司-LRAT活性测定在10m内进行米Tris/HCl缓冲液，pH 7.5，含1%牛血清白蛋白（最终体积200μl）。全部-反式-视黄醇以0.8μlof的浓度输送N、 N个-二甲基甲酰胺（DMF）最终浓度为10μ米，反应是由牛RPE的添加引发的微粒体（150μg蛋白质）。反应混合物在30℃孵育在°C下保持10分钟，通过注入300μl甲醇停止，并与相同体积的己烷。在Hewlett上提取并分析了类维生素a配备二极管阵列检测器和用10%洗脱的正相色谱柱（Agilent-Si；5μm，4.5×250 mm）己烷中的乙酸乙酯，流速为1.4 ml/min。

牛杆外段（ROS）和RPE微粒体中RDH的活性通过监测视黄醇生成（视网膜减少）进行测定。每个含有50 m的反应混合物（200μl）米MES，pH 5.5，1米米二硫苏糖醇，200μg经紫外线处理的RPE微粒体或ROS，试验基质和还原剂（NADH或NADPH）。对于RDH5反应是通过添加11-顺式-视网膜（2μ米)然后是60μ米NADH公司。检测RDH活动ROS、NADPH（60μ米)首先添加样品暴露在电子闪光灯的一道闪光下(40). 反应混合物为在37°C下培养20分钟，并用300μlof甲醇终止，用300μl己烷萃取维甲酸。上阶段是使用SpeedVac取出并干燥。将残渣溶解在200μl的己烷和100μl该溶液按规定通过HPLC进行分析以上。

异构酶分析如前所述进行(41,42)进行了一些修改。反应在10 m内进行米Tris/HCl缓冲液，pH 7.5，1%牛血清白蛋白，含1m米ATP和6μ米脱细胞视网膜醛结合蛋白。受试化合物的抑制作用为通过在37°C下预孵育紫外线处理的RPE微粒体5分钟进行评估在添加apo细胞视黄醛结合蛋白和所有-反式-视黄醇（10μ米). 将相同体积的DMF添加到控制反应中。实验重复进行了三次。用于异构化细胞培养中的反应分析，表达LRAT和RPE65的NIH3T3细胞在密度为1×10的6孔培养板中培养⁶细胞/孔，每次实验前20h。取出GM和2 ml新鲜含10μ米全部-反式-视黄醇和3μ米添加了试验化合物。收集细胞和培养基孵育16小时后。用2ml甲醇处理样品，均质，用1皂化米之前2小时37°C下的KOH用己烷萃取。收集并干燥产生的己烷相使用SpeedVac，并在250μl己烷和维甲酸中再溶解如上文所述，通过正相HPLC测定成分。

抑制剂的施用和维甲酸的提取/分析老鼠的眼睛-通常，所有在小鼠中测试的化合物都是通过腹腔注射50μl组织培养级二甲基亚砜注入。与解剖小鼠眼睛分析相关的程序，羟胺衍生化视网膜和类视网膜的分离已被描述(14).通常，每次试验使用两只小鼠，重复试验三次次。

人RPE65的表达与纯化-全长人含有C末端1D4标记的RPE65被克隆到pFastBac HT a中质粒，并将得到的构建物用于根据按照制造商的说明（Invitrogen Bac-to-Bac手册）。对于蛋白表达，将50 ml高滴度P3杆状病毒添加到600 ml以2×10的密度培养Sf9细胞⁶细胞/ml，以及在27°C下摇动细胞。36–48小时后，通过离心并重新悬浮在10 ml PBS中，pH 7.4，含一个不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂溶片（罗氏应用科学）。细胞悬浮液在液氮中闪速冷冻并储存在–80°C。用40 ml 20 m溶液解冻悬浮液米双三聚丙烯，pH 7.0，含150m米氯化钠，10米米2-巯基乙醇，5%甘油，2 m米CHAPS，其中一个已溶解不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂（罗氏应用科学）。细胞是被Dounce均质化破坏，裂解液在145000下离心×克持续30分钟。收集上清液，稀释2倍使用裂解缓冲液，并加载到3ml塔龙树脂（Clontech）柱上与裂解缓冲液平衡。用30个柱体积清洗柱20米米BTP，pH 7.0，500 m米氯化钠，10米米2-巯基乙醇，5%甘油，2 m米CHAPS和5 m米咪唑。用20 m的缓冲液洗脱蛋白质米BTP，pH 7.0，150 m米氯化钠，10米米2-巯基乙醇，5%甘油，2米米CHAPS和150 m米咪唑，pH 7.0。将含有蛋白质的组分（TEV蛋白酶）合并(43)已在添加浓度为3%（w/w）（基于蛋白质浓度），混合物为在4°C下孵育约14小时，以去除N-末端His₆在Superdex 200凝胶过滤柱上进一步纯化蛋白质。通过免疫印迹法鉴定含有RPE65的组分。RPE65型基于考马斯染色和银染色SDS-PAGE。

Ret-NH的组织提取₂和N-视黄醇酰胺-将小鼠肝脏（1 g）匀浆于10 ml 50米米Tris/HCl缓冲液，pH 9.0和10 ml甲醇。维甲酸类用20ml己烷萃取。含有维甲酸的有机相收集，在SpeedVac中干燥，再悬浮在0.5毫升20%的溶液中甲醇中含有0.5%氨的乙酸乙酯/己烷。N个-在正相HPLC柱上分离视黄醇酰胺（Agilent-Si；5μm，4.5×250 mm），使用20%乙酸乙酯溶液在己烷中，流速为2 ml/min，而Ret-NH₂洗脱在流动的甲醇中，在0.5%氨的存在下用100%乙酸乙酯速度为2.5 ml/min。

小鼠A2E分析-将两只整只小鼠的眼睛均匀化在1.0 ml CH中提取两次_三带有玻璃均质器的CN并使用SpeedVac进行干燥。残渣在120μl（80%）中再溶解中国_三H中的CN₂O与0.1%三氟乙酸和100使用C18柱（4.6×250）通过反相HPLC分析μlmm，5μm，Phenomenex，Torrance，CA），线性梯度为中国_三CN（0–100%）（H）₂O，添加0.1%三氟乙酸，流速为1.5 ml/min。A2E和通过与已知浓度的纯合成A2E和iso-A2E(44).

人血清RBP的表达与纯化-人类RBP克隆到pET3a表达载体的cDNA是J.W.Kelly博士的礼物（斯克里普斯研究所，加利福尼亚州拉霍亚）。RBP表达大肠杆菌属大肠杆菌按照前面的描述完成(45). 简而言之，RBP是根据标准方案在BL-21 DE3细胞中表达。细菌细胞收获后通过渗透性休克进行裂解。不溶性物质被造粒，用20m洗涤三次米Tris/HCl缓冲液，pH 8.0，以及在7中溶解米盐酸胍和10m米二硫苏糖醇。缓冲器（25 m米Tris/HCl，pH 8.8）以稀释盐酸胍浓度为5.0米.过夜后培养，通过超速离心（120000×克，1 h，4°C），收集的上清液用于RBP复性程序。RBP通过滴加溶解材料至含有25 m的混合物米Tris/HCl，pH8.8，0.3米米胱氨酸，3.0米米半胱氨酸，1米米EDTA和1 m米全部-反式-视黄醇在乙醇中的释放时间为4摄氏度。反应在4°C下进行5小时，剧烈混合。通过超速离心（120000×克，在4°C下1小时），对溶液进行透析米米Tris/HCl缓冲液，pH 8.0，4°C过夜，过滤装在DE53纤维素色谱柱上。洗脱折叠的holo-RBP通过NaCl的线性梯度（0–300 m米)10米米Tris/HCl缓冲液，pH 8.0。通过SDS-PAGE和紫外可见光谱。吸光度比为将0.9或更高的280nm/330nm混合、浓缩并储存在–80°C，直到再次使用。

用Ret-NH加载Apo-RBP₂-Apo-RBP为通过提取所有-反式-视黄醇作为科根描述等。(46). 的效率全部-反式-通过记录水相的吸收光谱。用于Ret-NH的重新粘合₂将apo-RBP（2 mg/ml）在20 m内的溶液加入RBP米Tris/HCl，pH 8.0，在4°C和1 m的温度下培养2 h米Ret-NH的₂在含有10%甘油的乙醇中交付。样品被稀释20米米Tris/HCl缓冲液，pH 8.0，在非Q离子交换柱。Ret-NH的存在₂绑定到RBP通过测定其快速蛋白液后的吸收光谱进行确认色谱纯化。

荧光结合分析-荧光分光技术用于研究Ret-NH的结合₂至RBP和RPE65。全部在PerkinElmer Life Sciences LS55模型上进行测量荧光计（马萨诸塞州沃尔瑟姆）。Ret-NH的结合₂由评估监测蛋白质荧光在浓度增加时的猝灭配体。在激发波长设定为285nm的情况下，发射光谱为在300至520nm范围内记录，激励和发射带宽固定在10 nm处。在20°C下20 m内进行滴定米Tris/HCl缓冲液，pH 7.6，含50 m米氯化钠和5%甘油（v/v）。视网膜-NH₂以DMF交付，因此DMF的最终体积不超过样品总体积的0.5%。所有绑定数据都是校正激发和发射光的背景和自吸收。使用Prism 3.02（GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA），我们计算了显然的K（K）_d日单个值的非线性回归结合位点与方程Y（Y）=B类_最大值×X（X）/(K（K）_d日+X（X）)，其中B类_最大值是最大绑定，并且K（K）_d日是达到半最大结合所需的配体浓度。

维甲酸摄入分析-实验前20小时，在6孔培养基中培养表达LRAT或LRAT和STRA6的NIH3T3细胞密度为1×10的板材⁶细胞/孔。清洗细胞137米米氯化钠，67米米磷酸钾2.7米米KCl，pH 7.4，无血清培养基中含有RBP-Ret-NH型₂或游离Ret-NH₂添加溶解在DMF中的溶液。在37°C下培养16小时后，用137清洗细胞两次米米氯化钠，67米米磷酸钾，2.7米米KCl，pH 7.4，收获，用1体积甲醇提取，然后用2体积甲醇提取己烷的体积。收集整个己烷相，在SpeedVac，并在250μl己烷中再溶解。视黄醇的分析方法为在Hewlett-Packard 1100系列HPLC系统上的正相HPLC。N个-在Agilent-Si柱（4.6×250 mm，5μm）与20%乙酸乙酯在己烷中平衡，并用相同的溶液，流速为2ml/min(29,30).

视网膜电图（ERG）-ERG记录如下前面描述过(47,48).

结果

高效视觉循环需要可原生物降解的氨基抑制-评估不同类别的11上的抑制剂-顺式-RPE微粒体中的视黄醇生成，我们执行在体外3存在下的异构化活性测定μ米视网膜-NH₂、法尼胺或TDT(图2A类). 这个异构化反应，增加11-顺式-视黄醇当Ret-NH₂或添加了法尼胺，而TDT没有明显的抑制作用。法尼醇用于控制类异戊二烯部分对异构化反应仅表现出轻微的抑制作用，这与预期相符。收件人进一步表征这些和其他化合物的抑制特性，我们进行了一系列浓度增加的实验（范围0–100 μ米)试验抑制剂(图2B类).视网膜-NH₂再次成为IC最有效的抑制剂₅₀=650牛顿米，该值与之前发布的值一致结果(29). 法尼西胺在异构化反应中表现出较低的抑制活性集成电路₅₀=1200牛顿米芬雷替尼、TDH、TDT、，13-顺式-RA和所有-反式-RA的抑制作用弱得多影响。

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图2。

抑制11-可视化循环抑制器的顺式维生素E生产。RPEmicrosomes为每种化合物在3μ浓度下测试5分钟米先前的通过添加10引发异构化反应μ米全部-反式-视黄醇和6μ米apo细胞视黄醛结合蛋白。A类，进度异构化反应增加11-顺式-视黄醇集中精力。B类，抑制剂的剂量依赖性作用11-顺式-RPE微粒体产生视黄醇。分析在30°C持续1小时。C类，HPLC色谱图表明表达RPE65和LRAT的NIH3T3细胞的异构化反应用10μ孵育米全部-反式-生长培养基中的视黄醇有机萃取前16小时。生长培养基的补充3μ米视网膜-NH₂或法尼西胺导致完全抑制11-顺式-视黄醇生产。峰值是根据相同的洗脱时间和吸收光谱进行鉴定采用合成标准(1, 11-顺式-视黄醇；2,13-顺式-视黄醇；三, 9-顺式-视黄醇；4,全部-反式-视黄醇）。D类显示数量11-顺式-用3μ米测试化合物的浓度（*，低于检测水平）。mAU、，毫吸光度单位。

上述结果通过细胞培养实验得到了验证。NIH3T3细胞稳定表达的LRAT和RPE65用10μ米全部-反式-视黄醇和3μ米每个假定的细胞均质、皂化和维甲酸前16小时抑制剂提取。高效液相色谱分析显示11-顺式-非处理细胞中的维甲酸，而视网膜-NH₂或法尼胺显著降低异构酶活性(图2，C类和D类). RA异构体以及TDH和TDT没有显著差异尽管非那定表现出部分抑制作用，但对该活性的影响与法尼醇类似。因此，上述结果与我们的在体外数据。唯一的例外是N个-法尼基乙酰胺在组织培养实验中显示出更高的抑制效力(图2D类). 这个差异可以用水解N个-法尼基乙酰胺法尼胺发生于细胞培养过程中。类似的效果是已为报告N个-以往研究中的视黄酰胺(30). 总之，这些观察表明，可质子化的氨基是维甲酸异构酶抑制剂的疗效(29). 这个想法也是与异构化的分子机理一致反应（参考文献。49).

视网膜-NH₂阻止RPE65型-牛RPE中视黄醇异构酶RPE65的鉴定(5–7)除Ret-NH外₂作为一种有效的异构酶抑制剂强烈表达LRAT和RPE65的NIH3T3细胞提示直接相互作用带正电的Ret NH₂使用RPE65。因为之前已发表的观察未能揭示Ret-NH的特定作用₂潜在不稳定溶解RPE微粒体中RPE65活性洗涤剂(29)，我们避开了本实验中洗涤剂的使用。相反，RPE65表达于Sf9细胞，纯化至均匀，并假定结合视网膜-NH₂用荧光法检测。如所示图3A类，孵化视网膜-NH₂RPE65导致蛋白质指数下降荧光。这种衰变显示出饱和结合等温线(图3B类)，提供普通装订K（K）_d日80 n米.此结果将RPE65确定为视黄酸胺抑制剂的主要靶点异构化，这一发现与关于这些化合物的眼部效应。尽管Ret-NH₂可以是经LRAT代谢形成N个-视黄酰胺类(30),全部-反式-视黄醇仍然是这种酶的首选底物，并且因此，我们没有观察到Ret NH的影响₂视黄醇酯形成，或者在体外或体内(29,30). 重要的是，两者都不是视网膜-NH₂也没有法呢胺干扰RDH活动（数据没有如图所示），据报告为13-顺式-无线电高度表(50). 因此，RPE65似乎成为Ret NH的主要目标₂破坏视觉效果的动作RPE中的循环。

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图3。

Ret-NH的结合₂至RPE65，通过淬火测定蛋白质荧光。将纯化的RPE65稀释至20 m米Tris/HCl缓冲液，pH 7.6，含50 m米氯化钠和5%甘油（v/v）至最终浓度0.05μ米.增加数量Ret-NH的₂加入1μl等分DMF至2 ml总量样品。每次添加后，将滴定溶液混合并培养在285 nm激发和记录发射光谱前1分钟。A类，添加增加Ret-NH浓度₂(0–1 μ米).B类，最大排放量随增加而变化视网膜-NH₂在345nm处监测浓度；已更正为背景、稀释和内过滤效应；并用于估计显然的K（K）_d日显示的值。美国。，任意单位；F类，蛋白质荧光。

Ret-NH的效果比较₂、法尼西胺和体内维甲酸循环的其他抑制剂-一些测试化合物可能有非直接作用机制调节RPE65活性。因此，我们进一步评估了抑制这些化合物在小鼠体内的剂量和效力。动物接受一种治疗腹腔注射三剂抑制剂。然后他们是暴露在强光下，随后进行暗适应4h后对眼睛成分进行分析。正如预期的那样视觉周期抑制剂变化显著(图4). TDH和TDT拥有对视觉生色团再生的影响最小，尽管它们是在最高剂量（2mg/只）。13-顺式-RA，全部-反式-RA和芬雷他尼抑制30–50%的视觉周期中间再生在我们的实验条件下。但两者都是Ret-NH₂和法尼西胺产生最大的抑制作用，这意味着这些化合物以最低剂量达到治疗效果体内(图4). 因为我们认为，受试化合物对眼睛的吸收和传递可能不同检查了每种抑制剂（1mg）对11-顺式-视网膜宽（48小时）时间范围内的生产(图5，A类和B类). 与所有人一起-反式-RA，13岁-顺式-RA和芬雷他尼，复方给药后2h可检测到抑制作用注射后持续7小时。相反，Ret-NH₂完全地阻止视觉循环超过18小时。从HPLC分析中获得的数据与中所示的电生理测量结果一致图5，C类和D类.绘制单次闪光ERG a波和b波响应作为不同光强的函数，记录用于控制和分别在漂白后5小时和16小时处理动物。显著衰减在Ret NH中的这些反应₂-给药后16小时持续给药漂白剂。13-顺式-RA处理的小鼠表现出轻微但显著的5小时时ERG反应减少，但与对照组无显著差异在漂白后16小时（***，第页<0.0001，单向分析方差）。TDH治疗组ERG反应无明显变化小鼠在这些实验条件下。

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图4。

11的比较-顺式-小鼠视网膜再生选定的视觉生色团抑制剂。给适应黑暗环境的小鼠注射给药前4小时腹腔注射抑制剂的显示剂量150坎德拉米漂白20分钟^–2在甘兹菲尔德的房间里。再生11-顺式-之后，视网膜在黑暗中持续4小时用正相高效液相色谱法提取和分离眼类视网膜在“材料和方法”中进行了描述

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图5。

时间进程11-顺式-在给定视觉周期的情况下，再分析再生抑制剂。A类,通过腹腔注射给小鼠每种受试化合物1mg，作为在“材料和方法”中描述。暴露于光后足以漂白80%的视紫红质，动物被置于黑暗中4–16 h。总量11-顺式-暗适应眼中的视网膜通过HPLC测定。暗适应的视觉生色团水平(顶部)并漂白(底部)动物展示如下虚线酒吧。B类，之间抑制作用持续时间的差异Ret NH公司₂和法尼西胺，剂量为0.1mg/小鼠。C类和D类表示强度增加的单闪光ERG响应未经治疗的对照小鼠和接受Ret-NH治疗的小鼠₂,13-顺式-维甲酸或TDH。小鼠暗适应5小时(C类)和16小时(D类)漂白后。增加闪光灯的串行响应刺激被绘制成a波和b波响应的函数与在暗适应条件下改变光强度。ERG衰减反应被Ret-NH保留₂-漂白16h后给小鼠进行治疗。光盘坎德拉。

Ret-NH的直接比较₂法尼西胺表明这些化合物在相对低剂量0.1mg/只。然而，Ret-NH₂抑制继续超过几天(47),而法尼胺减少11-顺式-视网膜产量低于20小时(图5B类). 这个这一结果可以用Ret-NH的有效酰胺化来解释₂由LRAT催化。N个-视黄醇酰胺是Ret NH公司₂在视网膜色素上皮内的视网膜小体中积聚(30)，它们在哪里受到保护不会被快速代谢。支持这一观点的证据来自比较Ret-NH₂WT和拉特^–/–老鼠。Ret-NH的量₂在LRAT缺乏小鼠的肝脏中检测到用1mg抑制剂灌胃后6天内检测不到的水平。在对比和忽略形成N个-WT小鼠中的视黄酰胺，视网膜-NH₂在这些动物中保持恒定水平达2周(图6C类). 因此，酰胺缓慢水解回到胺形式似乎提供了一个常数提供抑制剂，以解释其长期疗效。

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图6。

Ret-NH的影响₂关于A2E在阿布卡4^–/–小鼠及其抑制剂的比较WT和LRAT缺乏小鼠的清除率。 A类，代表性HPLCRet-NH中检测到的A2E色谱图₂-治疗小鼠，比较用一只只与载具一起处理的控制鼠标。一个月大阿布卡4^–/–给老鼠灌胃视网膜-NH₂（1 mg）于150μl植物油中，每2周服用2次在3个月大时最后一次灌胃后1周进行分析。老鼠被保持在完全黑暗中(D类)或12小时/12小时内暗/亮(信用证)循环（～10勒克斯）。A2E和iso-A2E水平为按照“材料和方法。”根据洗脱时间和紫外可见光谱确定峰光谱(正确的).峰值1，A2E；峰值2，iso-A2E。B类，对眼睛中发现的A2E和iso-A2E进行定量。这个错误酒吧指出S.E(n个= 3; *,第页< 0.0001;视网膜-NH₂-处理过的与视网膜-NH₂-未经处理）。C类，Ret-NH的比较₂WT肝脏中随时间变化的水平和拉特^–/–单剂量灌胃小鼠（1mg）Ret-NH₂.多澳大利亚单位，毫吸光度单位。

有趣的是，服用有效剂量的Ret-NH₂做对小鼠无毒性作用(47). 相反法尼胺超过0.5mg/只动物产生的显著毒性表现为皮毛蓬松，呼吸困难，行动不便。这些毒性作用可能与据报道抑制调节由多种信号蛋白控制的细胞活动，包括小G蛋白(51,52). 法尼西胺也是线粒体外膜酶的竞争性抑制剂单胺氧化酶B，参与控制神经递质胺的水平(53,54).

Ret-NH的影响₂关于A2E在阿布卡4^–/– 老鼠-Ret-NH对视觉周期的抑制作用₂是伴随着脂褐素荧光团积累减少。管理抑制剂每2周1毫克/只，持续2个月，可减少A2E和iso-A2E英寸阿布卡4^–/–小鼠到水平在黑暗中饲养的动物中发现(图6，A类和B类). 这个结果表明阻塞RPE65活性是降低A2E积累速率的有效方法体内此外，Ret NH的剂量₂需要唤醒与13只小鼠相比，小鼠的治疗效果要低得多-顺式-RA或芬雷他尼(17,18).

Ret-NH的交付₂芬瑞汀对眼睛的作用不是RBP-或依赖于STRA6-多跨膜的最新鉴定蛋白STRA6作为RPE细胞内的RBP受体(55)具有重要的对理解RBP-结合的维甲酸化合物是如何传递的影响肉眼可见。阐明RBP和STRA6在Ret-NH中的作用₂运输，我们检查了Ret-NH₂与RBP的结合及其吸收表达STRA6的细胞。如紫外可见光谱和荧光所示测量，Ret-NH₂与高亲和力的apo-RPB结合(K（K）_d日=220牛顿米)生理pH值(图7，A类和B类). 该值与之前报告的值相当人类所有人的亲和力-反式-用于apo-RBP的视黄醇(K（K）_d日=150牛顿米)(46). 因此，RBP加载带Ret-NH₂并在离子交换柱上重新纯化，用于我们的摄入分析。因为高效维甲酸需要LRAT活性细胞内储存(32,56)，NIH3T3细胞过度表达的LRAT和STRA6与RBP-Ret-NH孵育₂补充到介质。细胞被清洗、收获和提取用正相高效液相色谱法测定维甲酸含量。吸收效率为评估为N个-在这些细胞中发现的视黄酰胺时间(图7C类). 在与对照实验相比-反式-视黄醇在表达STRA6/LRAT的细胞中，holo-RBP的表达量是对照组的10倍仅表达LRAT的细胞(图。7D类,插入)Ret-NH的比率₂Ret-NH吸收₂-加载的RBP无法区分两个细胞系(图。7D类). 有趣的是N个-视黄酰胺仅过表达LRAT的细胞的累积量与所有的-反式-过度表达STRA6/LRAT的细胞对视黄醇的摄取。此外，Ret-NH₂预绑定到RBP的速度要慢得多这些细胞类型比游离Ret-NH₂当浓度相同时添加到培养基中。这些观察结果表明RBP/STRA6依赖机制不能增强Ret-NH₂运输就像视黄醇与RBP结合一样。相对较高的速率N个-视黄酰胺在细胞孵育中的积累RBP-Ret-NH型₂表明已充电的Ret NH₂可以结合蛋白和细胞膜之间的分配。

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图7。

Ret-NH的相互作用₂RBP及其被细胞吸收表达LRAT和STRA6。 A类，通过萃取制备apo-RBP用乙醚进行holo-RBP。监测配体缺失的完整性通过紫外可见光谱(灰色线条). apo-RBP与视网膜-NH₂并在快速蛋白质液相色谱上进行再验证离子交换柱生产Ret-NH₂-具有紫外-可见光谱的RBP具有两个最大值，一个在280 nm处，另一个在330 nm处(黑色线)分别对应于蛋白质和视黄醇吸光度。在330 nm处进行吸收，以指示Ret-NH的结合₂到RBP。明显的K（K）_d日通过荧光确定值apo-RBP滴定（0.2μ米)随着浓度的增加视网膜-NH₂20米米Tris/HCl缓冲液，pH 7.6和50米米NaCl，如所示B.C（英国），Ret-NH的摄取₂NIH3T3过度表达LRAT和STRA6与RBP结合。吸收效率为作为全部金额-反式-N个-提取的视黄酰胺来自单元格。色谱图表示正常相HPLC分离N个-从不同时间收集的细胞中提取的视黄酰胺与RBP-Ret-NH孵育后的点₂.峰值1、2、和三对应于所有-反式-N个-视黄酰胺类分别含有C18、C16和C14酰基。D类,视网膜-NH₂表达STRA6和LRAT的NIH3T3细胞的摄取(填充形状)或仅LRAT(打开的形状). 孵化含有Ret-NH的细胞₂绑定到RBP(圈子)位于浓度为8μ米无血清Dulbecco改良Eagle培养基显示两种细胞株的吸收效率没有差异。当两种细胞系均为用“免费”Ret-NH培养₂在相同浓度下(三角形). 对照实验(插入)显示出稳健STRA6/LRAT细胞与与仅表达LRAT的细胞相比，holo-RBP。澳大利亚，吸光度单位。

进一步研究了RBP在维甲酸类药物眼部给药中的作用具有卢比击倒小鼠。两个Ret-NH₂芬瑞替尼已显示绑定到RBP。此外，芬利替尼可降低RBP-转甲状腺素复合物形成，导致游离RBP和血清RBP水平降低，进而降低视黄醇向眼睛。这种机制被认为是维生素A循环减少的原因非那替尼治疗患者的发病率观察(18). 为了验证这一假设，黑暗适应RBP缺乏小鼠在光照前4小时灌胃1 mg非那替尼或1 mg Ret-NH₂.黑暗4小时后适应，动物被处死，11级-顺式-视网膜和其他视觉类维甲酸通过HPLC在眼睛中定量。卢比^–/–小鼠体内的再生的视觉发色团（对照水平的20%）比WT小鼠（10%）(图8，A类和B类). 同时，Ret-NH的摄取₂,由以下数量决定N个-眼睛中发现的视黄酰胺WT高25%与敲除小鼠(图7C类). 尽管这些差异具有统计学意义，它们表明RBP在Ret-NH中的次要作用₂进入眼睛在里面活泼地芬瑞替尼似乎也是如此。管理后者降低11-顺式-两者的视网膜生成量均增加20%卢比^–/–和WT小鼠(图8，A类和B类). 此外发现治疗动物的眼睛(图。8C类).

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图8。

RBP在Ret-NH中的作用₂传递到眼睛。 卢比^–/–WT小鼠灌胃剂量为1Ret-NH毫克₂或用胃灌胃法将芬利替尼注入油中。四个小时随后，将小鼠暴露在强光下，可以漂白90%的视紫红质然后将其置于黑暗中，以允许视觉生色团再生。A类，小鼠眼睛中类视黄醇的色谱图。峰值1,全部-反式-视黄酯；峰值2,2′-11-顺式-视网膜肟(同步，反).B类,11的量化-顺式-在眼部样本中检测到视网膜血氧从交流，浓度N个-视黄醇酰胺和甲氰菊酯在RBP缺乏和WT小鼠的眼睛中发现。在中检测到化合物用30%正相高效液相色谱法从解剖的眼睛中制备己烷提取物以1.4毫升/分钟的流速使用乙酸乙酯/己烷作为溶剂。

讨论

荧光脂褐素色素的过度生产(即二氢-N个-亚视黄碱-N个-视黄基磷脂酰乙醇胺）感光细胞及其在形态中的转化和积累眼底自体荧光显示RPE中A2E先于黄斑年龄相关性黄斑变性和Stargardt的变性和视力丧失疾病(57). 强大Best患者视网膜内也观察到自体荧光卵黄状黄斑营养不良症和一组被诊断为圆环病的患者营养不良(58). 水井研究表明A2E的细胞毒性作用表现为诱导释放线粒体中的促凋亡蛋白(59)，受损退化吞噬的外节磷脂(21)，类似洗涤剂细胞膜失稳(60)和RPE致敏细胞对光损伤(61,62). 因此变化，RPE细胞开始异常功能，并失去其支持光感受器活动，最终导致感光细胞变性(63). 因为A2E积累导致视网膜和黄斑变性，抑制脂褐素色素形成似乎是减缓视力丧失的进展。该策略的实用性由观察到阿布卡4^–/–老鼠（动物）人类Stargardt病模型）在完全黑暗中升高的水平降低A2E与接受周期性光照的动物相比(18,19,64). A2E的前体，二氢-N个-亚视黄碱-N个-视黄酰磷脂酰乙醇胺磷脂酰乙醇胺与两分子全部-反式-位于ROS中的视网膜(63). 因此全部-反式-视网膜生成应减缓A2E的发生率积累。影响光依赖形成全部-反式-视网膜通过以下方式调节视觉发色团再生药物抑制。为此，需要确定，开发并表征有效、选择性和无毒的视觉生色团再生可以有效地传递到眼睛。在本研究中，我们评估了一些化合物声称是可能有用的视觉周期抑制剂用于治疗变性视网膜疾病。

作用方式与治疗的关系方法-我们研究了四种视觉循环的化学类别抑制剂，以确定其抑制效力、效力和特异性在体外在细胞培养和体内(图1). 在化合物中研究，Ret-NH₂和法尼丁胺是最有效的11种抑制剂-顺式-每个实验中的视网膜生成系统（图。​（图2，2,​,5,5、和​和6）。6). Similarities between the这两种化合物的结构和抑制性能表明它们是相同的作用机制。RPE65可能是Ret-NH的目标₂动作，不仅因为Ret-NH₂对此有很高的抑制效力酶(图3)而且因为它不能抑制LRAT或杆锥RDH活性。总之，这些结果表明一种高度特异和敏感的分子Ret-NH通过的机制₂减速11-顺式-视网膜通过干扰RPE65在视觉上的基本动作形成循环。

我们发现13-顺式-RA对维甲酸仅有轻微影响异构化在体外和细胞培养分析。这与之相矛盾以前的报告建议13-顺式-RA抑制视觉生色团通过与RPE65结合再生(28,65). 另一种选择解释是13-顺式-RA抑制11-顺式-RDH和全部-反式-RPE和控制棒外段的RDH(27,40). 大于10倍降低K（K）_我13的报告值-顺式-RA抑制共11页-顺式-RDH活性与全部-反式-RDH提示后一种RPE定位蛋白可能是13-cis-RA的主要靶点。相对较弱的13-顺式-观察到RA对视觉生色团产生的影响在里面活泼地（图。​（图44和​和5），5)，但这可能是由于通过氧化快速清除RA，严格控制细胞内RA水平通过CYP26酶(66).13摄氏度是-RA也被证明会自发异构化为全部-反式-同分异构体体内; 这将缩短其半衰期可能会限制其对视觉周期的影响体内（在中审查裁判。67). 尽管管理13-顺式-RA至阿布卡4^–/–小鼠阻止A2E的形成，高需要剂量的这种化合物来抑制视觉周期。此外13的毒性-顺式-RA使其不适合长期治疗视网膜变性疾病患者(17,20).

目前尚不清楚非那定影响视觉发色团的机制眼部形成。它不阻止11-顺式-视黄醇生产RPE微粒体或培养细胞中。此外，它无法抑制LRAT或RDH活动测试人在体外化验(图2). 唯一可测量的这种类视黄醇对11-顺式-观察到视网膜生成老鼠(18)（图。​（图44和​和5）。5). 根据临床研究，芬瑞替尼的一个拟议作用是降低视黄醇的循环水平通过对限制性商业惯例的竞争约束。这将降低可用的视黄醇库以支持视觉，从而减少A2E的形成(68). 但鉴于我们发现急性暴露于这种视黄醇会适度抑制WT和卢比^–/–老鼠，这个机制无法解释短期后观察到的眼部影响治疗体内.仅在长期给药后（几个月）芬利替尼组患者出现夜盲症。人类的这些观察结果提示芬利替尼并不直接抑制视觉周期。因此，非那替尼作用的主要靶点尚不清楚。未充电含有不饱和和不带电物质的化合物，如TDH和TDT长链酯在我们的体内和在体外分析。

RBP在视觉抑制剂转运中的作用-眼睛依赖于RBP确保从循环中提供足够的维甲酸以维持视觉功能。基因敲除突变小鼠卢比基因在生命早期表现出视觉障碍(69). RBP主要是肝脏合成和分泌全部-反式-体内主要维甲酸储存器官中的视黄醇(70). 维生素A的摄取RPE涉及RBP的多跨膜细胞表面受体，由这个STRA6型基因(55).除眼睛以外的其他组织对维甲酸的需求可以通过以下方式完全满足RBP转运的替代物包括乳糜微粒或白蛋白介导交付(35). 因此，aRPB/STRA6依赖性维甲酸吸收途径可能构成高度特异性将视觉抑制剂对准眼睛的方法。这里我们测试了两种药物的吸收与RBP、Ret-NH结合的化合物₂和芬利替尼，通过使用细胞培养系统和RBP缺陷小鼠。因为利率没有差异Ret-NH的₂在表达STRA6/LRAT的细胞中观察到摄取与仅LRAT，合成物的RBP/STAR6依赖运输维甲酸不能成为Ret-NH的主要途径₂交付至眼睛(图7). 累计N个-与Ret-NH孵育的细胞产生的视黄酰胺₂预先绑定RBP的积累速度也慢于游离细胞的积累速度视网膜-NH₂在介质中。此外11-顺式-视网膜和视网膜-NH含量₂或发现芬雷他尼在卢比^–/–和WT小鼠这些化合物具有可比性(图。8).

合成类视黄醇的运输取决于它们的疏水性化合物。因为Ret-NH₂而非那替尼的疏水性较差与视黄醇酯或视黄醇相比，前两种化合物最有可能不是并入乳糜微粒，但被吸收到门脉循环和转运与白蛋白结合。像RA和视黄醇一样，合成维甲酸可能通过被动方式从白蛋白和跨细胞膜上解离非离子扩散(71). 对于极性类视黄醇类Ret-NH₂，吸收也可以由以下因素驱动血液（pH 7.4）和细胞质（pH～7.0）之间的pH差异。这个第页K（K）_一Ret-NH氨基的值₂是约7.0。因此，Ret-NH质子化₂可能有选择把它集中在一个牢房里。确保高效组织的另一种方法这种化合物的补充是通过LRAT的酯化或酰胺化进行的。这些过程将导致Ret-NH的主动分配₂从进入组织的循环和建立缓慢代谢的前药在眼睛和肝脏中的储存池(30).

可原生化氨基在视觉结构中的作用循环抑制剂-RPE65晶体结构尚未迄今为止确定的，以及关于RPE65异构化的唯一信息反应机理来源于生化研究。各种出版数据表明，该反应涉及碳正离子机理。质子化作用维甲酸的消除反应导致共轭双键中充满正电荷，从而降低所需构象变化的能量需求11-顺式-维甲酸形成(三,72)（参考文献。49).视网膜-NH⁺_三可能会模拟建议的过渡状态这种碳正离子机制，以及氨基的任何修饰会降低这种抑制剂的效力。相反，β-紫罗兰酮环对Ret-NH的抑制特性不是至关重要的₂，因为无环Ret-NH₂衍生物也表现出抑制活性(29). 此观察打开设计非tinoid疏水伯胺抑制剂的可能性以RPE65为目标。其中一种具有高抑制效力的化合物是法尼胺（图。​（图2，2,​,5,5、和​和6），6)，但法尼丁胺利用碳正离子机制干扰其他酶反应。戊基转移酶很好地说明了这一困难，包括三类酶：异戊二烯焦磷酸合成酶、蛋白质戊基转移酶和萜类环化酶(73,74)（参考文献。75). 异戊二烯转移酶广泛分布于自然界，支持多种重要的生物与细胞生长和存活、运动、细胞骨架有关的功能调节、细胞内转运、分泌和细胞信号(76,77). 抑制因素RPE65和蛋白丙酰转移酶的法尼胺是另一个论点维甲酸异构化的碳正离子机理。然而过渡态与重要内源性化合物的相似性在法尼西胺的作用机制中产生冗余，导致其不良副作用和高毒性。

酰胺形成在降低胺毒性中的作用-LRAT的功能是允许组织积累和储存视黄醇(32,56). 视黄醇的形成酯类还减少了可被氧化的视黄醇，从而防止RA的过度生产(78). LRAT在以下方面的作用含有酒精或氨基官能团的类视黄醇解毒可用于治疗优势。Ret-NH的转换₂进入之内N个-视黄酰胺保护相对活性的氨基和减少这种化合物的极性，使其能够储存在脂滴中眼睛、肝脏，可能还有其他组织。因此，这种酰胺化作用作为防止潜在毒性的保护机制，也有助于延长Ret-NH的治疗效果₂与我们研究的其他视觉周期抑制剂(图6C类).不幸的是，LRAT对维甲酸衍生物具有高度特异性，因此其益处仅限于这些化合物(79). 疏水醇像香叶醇和十四烷醇一样，是较差的LRAT底物，并且是非维甲酸像法尼胺这样的胺甚至比它们的类似酒精的物质更糟糕。这个LRAT对类维生素A的选择性从比较Ret-NH的抑制特性₂和法尼西胺。虽然两者都有化合物表现出类似的抑制效力在体外和在细胞内培养研究表明，法尼西胺的毒性要大得多，在生物学上仍然存在活动时间显著缩短体内比视网膜-NH₂.

总之，我们的研究结果表明，Ret-NH₂是最多的所研究化合物中的强效和特异性视觉周期抑制剂。视网膜-NH₂通过RBP和STRA6独立进入眼睛机制，但需要眼组织中的LRAT活性治疗效果。像Ret-NH这样的药物₂，高度清晰特定的分子靶点和低有效剂量，不太可能导致非特异性相互作用的毒性。视网膜-NH₂是第一个基于拟维甲酸机制的视觉周期抑制剂异构化，专门针对催化这种反应。此外，Ret-NH₂实现视黄醇循环减慢选择性抑制该途径的关键酶，即速率限制酶。缺乏其抑制作用的冗余可能对高Ret-NH表现出的效力和毒性缺乏₂.

致谢

笔记

^*这项工作得到了美国国立卫生研究院EY09339和第30页EY11373。华盛顿大学授权了部分技术此处介绍给Acucela Inc.。K.P.是Acucella Inc.的顾问这篇文章的出版费用部分由下列款项支付页面费用。因此，必须在此标记此物品“广告“根据《美国法典》第18卷第1734节只是为了表明这一事实。

脚注

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