人类分子遗传学。作者手稿；PMC 2008年6月19日提供。
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PMCID公司：下午2431460
美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院26929
半数心肌细胞中全长肌营养不良蛋白表达改善β-异丙肾上腺素诱导的mdx小鼠心肌病
,1 ,2 ,1 ,2和1,*
岳永平
1密苏里大学医学院分子微生物学和免疫学系，哥伦比亚，MO 65212，美国
杰弗里·W·略读
2美国密苏里大学医学院儿童健康系和医学药理与生理学系，哥伦比亚，MO 65212
刘明菊
1密苏里大学分子微生物学和免疫学系，医学院，哥伦比亚，MO 65212，美国
塔米·斯特朗
2美国密苏里大学医学院儿童健康系和医学药理与生理学系，哥伦比亚，MO 65212
段东升
1密苏里大学分子微生物学和免疫学系，医学院，哥伦比亚，MO 65212，美国
1密苏里大学分子微生物学和免疫学系，医学院，哥伦比亚，MO 65212，美国
2密苏里大学医学院儿童健康系和医学药理学与生理学系，哥伦比亚，MO 65212，美国
*收件人：密苏里大学医学院分子微生物学和免疫学系，One Hospital Drive，Room M610G，MSB，Columbia，MO 65212，USA电话：+1 5738849584；传真：+1 5738824287；电子邮件：ude.iruossim@dnaud 摘要
基因治疗有望治愈杜氏肌营养不良症（DMD），这是最常见的致命的儿童遗传性肌肉疾病。DMD基因治疗的成功取决于骨骼肌和心肌功能的改善。许多基因转移研究已被用于纠正骨骼肌病理学，但对心肌病基因治疗知之甚少。由于整个心脏的完全转导是一个不切实际的目标，因此确定成功的DMD心肌病基因治疗所需的最低矫正水平变得至关重要。为了解决这个问题，我们培育了杂合小鼠，该杂合小鼠在50%的mdx小鼠（DMD模型）心肌细胞中持续表达全长肌营养不良蛋白基因。我们质疑一半心肌细胞中肌营养不良蛋白的表达是否足以预防应激诱导的心肌病。在没有外界压力的情况下，mdx小鼠的心脏功能是正常的。为了确定治疗效果，我们用β-异丙肾上腺素攻击3个月大的小鼠。mdx小鼠的心肌细胞膜完整性显著受损，而杂合小鼠和C57Bl/10小鼠则没有受损。重要的是，体内闭胸血液动力学检测显示β-异丙肾上腺素刺激杂合小鼠的左心室功能正常。由于杂合小鼠中的表达谱模拟了病毒转导，我们得出结论，50%的心脏细胞中的基因治疗校正可能足以治疗mdx小鼠的心肌病。这一发现也可能适用于其他遗传性心肌病的基因治疗。
简介
Duchenne和Becker肌营养不良症（DMD，BMD）是最常见的单基因疾病，分别影响大约每3500名新生儿中的一名和每20000名新生儿中一名(1). 肌营养不良蛋白基因的遗传缺陷与DMD和BMD有关。完全消除肌营养不良蛋白质表达的突变会导致致命的儿童期DMD。肌营养不良蛋白水平和/或结构的异常通常与更温和的等位基因BMD有关。尽管事实上肌营养不良基因是1987年通过定位克隆确定的第一个疾病相关基因(2)在改善DMD和BMD患者的临床结局方面取得的进展有限。心脏功能障碍在DMD和BMD患者的发病率和死亡率中起着重要作用。超过十分之一的DMD患者死于心力衰竭(三). 超过90%的BMD患者有心脏表型(4). 此外，在一部分肌营养不良蛋白基因突变的患者中，唯一的临床表现是等位基因X连锁扩张型心肌病(5). 除心脏移植外，症状缓解药物（如血管紧张素转换酶和β受体阻滞剂）是目前唯一可用的治疗方法(6).
通过基因治疗替换和/或修复突变基因是一种有希望的治疗方法。在过去十年中，DMD骨骼肌疾病基因治疗取得了许多进展(7). 例如，为了绕过2.4 Mb肌营养不良蛋白基因的大小限制，开发了新的C末端截断微基因。这些微基因已被证明可以改善骨骼肌的形态和收缩力(8,9). 此外，已经证明，低至20%的正常肌营养不良蛋白浓度足以避免肢体肌肉和膈肌的肌病(10,11).
与多核骨骼肌细胞不同的是，插片分离心肌细胞。因此，病毒的转导仅限于每个单独的心脏细胞，而不是通过整个纤维扩散(12-14). 这种结构差异需要建立心脏基因治疗的心脏特异性参数。我们最近报道了微胱氨酸能够恢复肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物，并保持mdx小鼠心脏肌膜的完整性，这是一种DMD小鼠模型(14). 然而，心肌病治疗所需的肌营养不良蛋白表达细胞的数量尚未确定。
在本研究中，我们使用3个月大的雌性杂合小鼠，即来自C57Bl/10（BL10）的F1和mdx杂交，作为实验模型来评估一半心肌细胞中持续全长肌营养不良蛋白表达是否足以改善mdx小鼠的心脏功能。一般来说，mdx小鼠的心脏功能正常。然而，mdx小鼠的心肌极易受到机械应激的影响(15). 为了确定约50%的心肌细胞中不均匀的肌营养不良蛋白表达是否足以改善mdx心肌病，我们用β-异丙肾上腺素对mdx、杂合子和BL10小鼠进行了挑战。我们的结果表明，肌营养不良蛋白的部分表达可以保护mdx心脏免受β-异丙肾上腺素诱导的损伤。值得注意的是，心肌细胞肌膜完整性显著增强，左心室收缩和舒张功能完全恢复到BL10小鼠的正常水平。
结果
杂合雌性mdx小鼠作为评估部分dystrophin表达治疗效果的模型
由于随机X染色体失活(16)，～50%的心肌细胞预计为肌营养不良蛋白阳性。为了准确测定肌营养不良蛋白的表达，我们手动计数了每个心脏节段中的所有肌营养不良阳性细胞（一个BL10节段为～50000个细胞），并对每个心脏的至少三个代表性节段（基部、体部和心尖部）进行了量化。如所示心肌细胞数为2545±224个/mm2在正常BL10小鼠中(N个= 3). 在母亲体内(N个=7）和父亲(N个=6）杂合小鼠，每毫米有1304±76和1410±110个肌营养不良阳性细胞2分别是。在这两种情况下，大约一半的心脏细胞肌营养不良蛋白染色阳性（母亲为51.22%，父亲为55.40%）。该形态计量学定量结果通过全心脏裂解物的免疫印迹进一步证实(). 在骨骼肌中，肌纤维结构的合胞性质允许一个细胞核产生的肌营养不良蛋白转录物扩散到整个纤维。最终，在骨骼肌的所有肌纤维中都实现了肌营养不良蛋白的同质表达(，左上面板）。有趣的是，营养不良蛋白阳性细胞分布在杂合小鼠心脏的斑块中。在某些地区，90%以上的细胞呈阳性。在其他人中，只看到分散的表达肌营养不良蛋白的细胞(，底部面板）。这种不一致的模式类似于病毒基因转移研究中的转导模式(12-14).
育种方案和肌营养不良蛋白表达谱。(一)将mdx小鼠与BL10小鼠杂交，产生父系和母系雌性杂合小鼠。在母体杂合小鼠中，突变的肌营养不良蛋白基因是从mdx母体遗传而来的。在父系中，突变基因来自mdx的父亲。(B类)心脏肌营养不良蛋白阳性心肌细胞的形态计量学定量。母鼠和父鼠之间没有显著差异。然而，BL10小鼠的值显著高于杂合小鼠的值。N个=BL10为3，N个母体杂合子=7，N个父亲杂合子=6。(C类)不同小鼠品系心脏中全长肌营养不良蛋白表达的代表性western blot（427 kDa，箭头）。杂合，杂合小鼠的心脏裂解物。(D类)顶部面板是杂合小鼠胫前肌（TA，左上）和心脏（右上）中肌营养不良蛋白表达的代表性免疫荧光染色。心脏中两个代表性区域的高倍显微照片显示在底部面板中。方框1描述了肌营养不良蛋白高表达的区域。框2是一个低肌营养不良蛋白表达区。左上方面板（TA）中的比例尺为300μm。右下面板（方框2）中的比例尺为100μm。此比例尺也适用于左下面板中的显微照片（方框1）。
50%肌营养不良蛋白表达减少mdx小鼠的心脏肥大
为了确定mdx心脏是否存在解剖学变化，我们检测了相对较大的年龄和性别匹配的小鼠群体（32只BL10和40只mdx）。总结如下()mdx小鼠的整个心脏和孤立心室都比BL10小鼠重。然而，两个菌株的心脏重量（HW）与体重（BW）的比值（HW/BW）和心室重量（VW）与BW的比值（VW/BW。然而，骨骼肌病理学的显著变化导致mdx小鼠的HW与胫骨肌重量（TW）（HW/TW）和VW与TW（VW/TW。在杂合小鼠中，上述所有指标均与BL10相似。显然，杂合小鼠骨骼肌病理学的缺乏促成了这一观察(17). 总之，杂合子和BL10 HW之间的相似性表明，一半表达肌营养不良蛋白的心脏细胞已经达到了正常心脏解剖的阈值。
表1
| BL10型 | 中密度纤维板 | 杂合的 |
|---|
| 样本大小(n个) | 32 | 40 | 24 |
| 年龄（天） | 91.66 ± 0.35 | 93.03 ± 0.50 | 93.38 ± 3.91 |
| 体重（克） | 22.25 ± 0.30 | 25.51 ± 0.30一 | 22.40 ± 0.93 |
| TW（毫克） | 34.96 ± 0.50 | 55.50 ± 1.36一 | 37.24 ± 1.78 |
| HW（毫克） | 104.07 ± 1.97 | 119.39 ± 1.48一 | 106.46 ± 4.44 |
| VW（毫克） | 95.57 ± 1.82 | 109.59 ± 1.36一 | 98.42 ± 4.13 |
| 硬件/硬件 | 4.67 ± 0.05 | 4.70 ± 0.06 | 4.76 ± 0.20 |
| 硬件/时间 | 2.98 ± 0.05 | 2.19 ± 0.05一 | 2.90 ± 0.14 |
| 大众/大众 | 4.29 ± 0.05 | 4.31 ± 0.05 | 4.40 ± 0.19 |
| 大众/太瓦 | 2.74 ± 0.04 | 2.01 ± 0.05一 | 2.68 ± 0.13 |
杂合小鼠心脏比mdx心脏更能抵抗应激诱导的肌膜损伤
肌营养不良蛋白在收缩过程中对维持肌肉细胞完整性起着关键作用。肌肉完整性可以使用体内埃文斯蓝染料（EBD）吸收试验，染料仅扩散到受伤的肌肉细胞中。因为mdx心脏功能正常，适合日常活动(14,15)，我们用β-异丙肾上腺素对心脏进行了药理学强调。如所示，给药后BL10心脏中检测到极少EBD阳性细胞。与之形成鲜明对比的是，β-异丙肾上腺素的机械刺激导致mdx心脏中出现11.26±3.40%的EBD阳性区域。重要的是，杂合小鼠的EBD阳性区域减少到2.37±0.70%。额外的免疫染色证实这些EBD阳性细胞不表达肌营养不良蛋白().
心脏肌膜完整性的定量评估。(一)BL10、mdx和杂合小鼠整个心脏切片的代表性显微照片。比例尺，1 mm。EBD摄取在德克萨斯州红色通道下可视化。条形图显示心脏损伤区域（EBD阳性区域）的百分比。所有组之间以及任何配对菌株之间的结果都有显著差异。N个BL10=17，N个=11（对于mdx），N个杂合子=10。杂合小鼠。(B类)心脏切片的代表性高倍显微照片。采用间接免疫荧光染色（FITC通道）检测肌营养不良蛋白的表达。德克萨斯州红道显微照片显示了同一区域的EBD摄取。EBD摄取也可以在FITC通道下显示为充满荧光信号的细胞。然而，这与肌营养不良蛋白的连续外周膜染色不同。Arrow，杂合小鼠心脏切片中的EBD阳性区域。比例尺，300μm。
半数心肌细胞中全长肌营养不良蛋白的表达可纠正mdx心脏的血流动力学功能障碍
DMD心肌病基因治疗的最终目的是改善心脏血流动力学功能。然而，在没有外源性应激的情况下，mdx心脏功能似乎是足够的(). 为了确定约50%心肌细胞中肌营养不良蛋白的表达是否可以改善血流动力学性能，我们用β-异丙肾上腺素对小鼠进行激发。
体内心脏功能的血流动力学评价。(一)BL10、mdx和杂合小鼠β-异丙肾上腺素激发后的代表性追踪。d日P（P）/天t吨左心室压力变化率；LVP，左心室压。(B类)不同小鼠品系在无（开放栏）或有（填充栏）β-异丙肾上腺素激发时的血流动力学特征。根据最小舒张压和收缩压之间的差值计算产生的压力。β-异丙肾上腺素治疗组，N个对于BL10＝10，N个对于mdx和N个杂合子=11。对于非处理组，N个=BL10为3，N个对于mdx和N个杂合子=3。在没有β-异丙肾上腺素刺激的情况下，BL10、mdx和杂合小鼠之间没有统计学差异，β-异丙肾上腺素处理的mdx与同样处理的BL10或杂合子显著不同，β-异丙肾上腺素处理的mdx与未处理的mdx有显著差异。
与我们的EBD摄取结果一致，β-异丙肾上腺素应激后mdx左心室功能显著受损(). 具体来说，收缩压峰值和最大dP（P）/天t吨收缩功能减退。舒张期舒张功能受损反映为峰值d的增加P（P）/天t吨最小和最小舒张压。结果，mdx小鼠的左心室发育压力也显著降低。
尽管在杂合小鼠中只有～50%的心脏细胞表达肌营养不良蛋白，但即使在β-异丙肾上腺素应激下，这些小鼠的心脏功能也正常。d没有恶化P（P）/天t吨最大值，dP（P）/天t吨β-异丙肾上腺素激发后的最小收缩压、最小舒张压和发展压力().
讨论
心肌病通常会导致DMD和BMD患者死亡。尽管我们对其发病机制的理解取得了巨大进展，但DMD和BMD的治疗仍然是个谜。因为肌营养不良蛋白的缺乏是骨骼肌和心脏功能障碍的主要原因(2,18)，通过基因治疗恢复肌营养不良蛋白的表达可能最终治愈这种毁灭性疾病。DMD和BMD的成功治疗需要骨骼肌和心肌的功能改善。用小鼠模型进行的实验揭示了治疗DMD骨骼肌疾病的许多重要方面。这些包括确定治疗所需的最低数量的肌营养不良蛋白，以及开发适合病毒载体的新型肌营养不良素亚型。在骨骼肌中，50倍的过度表达是无害的(19)低至20%的正常肌营养不良蛋白浓度足以维持肌肉功能(10,11). 患者研究表明，只有50%的正常细胞分布均匀，就足以避免最严重的骨骼肌损伤(20,21). 在一名42岁女性携带者中，骨骼肌中50%的镶嵌表达与极轻微的骨骼肌无力相关，但她的异常心电图提示有心肌病(22). 显然，50%骨骼肌纤维中肌营养不良蛋白的表达对心脏的保护作用最小。目前，确定正常心脏功能所必需的肌营养不良蛋白表达的最小范围是DMD心肌病基因治疗的首要任务。
基因转移方法的最新发展允许50-80%的成年小鼠心脏携带腺病毒和AAV(12,13). 为了探讨是否只有部分心脏中的肌营养不良蛋白表达可以改善mdx心脏中应激诱导的心肌病，我们使用了遗传定义的女性杂合模型。在女性杂合mdx心脏中显示出镶嵌型肌营养不良蛋白的表达(23-26). 由于X染色体随机失活，预计约50%的心肌细胞在杂合小鼠中表达肌营养不良蛋白(16). 然而，以前的一些研究显示，母体中有70%的肌营养不良阳性细胞(24)或父亲的(26)雌性杂合子小鼠。由于在这些研究中，每个心脏切片的心肌细胞数量少于5000个，这种不一致可能是由于采样不足造成的。我们在两个手机上的全面量化(和D）和器官水平()证明无论突变型dystrophin基因（父系或母系）的起源如何，在杂合小鼠中只有一半的心肌细胞表达dystrophin。
mdx小鼠是小鼠DMD模型的原型。不幸的是，其心脏病理学尚未得到系统评估。两项研究表明mdx心脏可能肥厚(15,27). 然而，在这些研究中，样本量（分别为5只和12只小鼠）太小，无法揭示具有统计学意义的肥大。在本研究中，我们描述了mdx心肌病的特征。虽然我们发现HW和VW显著增加，但这种增加可能只是因为成年mdx小鼠的BW和肢体肌肉重量同时增加所致(28,29). 在mdx小鼠中检测到的最显著的心脏病变是β-异丙肾上腺素激发后EBD摄取增加和左心室功能降低。这些病理结果与体外Langendorff心脏制剂的结果(15). 在这两种情况下，增加心脏做功都会导致mdx小鼠的左心室功能障碍。
杂合小鼠中50%的肌营养不良蛋白阳性心肌细胞提供的保护首先通过HW和VW的正常化来证明。为了更准确地确定这种程度的肌营养不良蛋白表达的治疗效果，我们用β-异丙肾上腺素对小鼠进行激发。杂合小鼠心脏的EBD摄取量显著降低。它被减少到mdx心脏EBD摄取量的五分之一。部分纠正如何导致肌营养不良蛋白阴性细胞的全球保护尚不清楚。考虑到即使在肌营养不良蛋白缺失的mdx心脏中，EBD泄漏也仅在约11%的心脏组织中检测到，我们施加的压力可能还不足以损伤心脏中的所有心肌细胞。或者，未知的心脏代偿机制可能掩盖了心脏功能障碍。综上所述，我们的结果表明杂合小鼠心脏的肌膜完整性得到了显著改善。由于杂合子心脏对EBD的摄取仍高于BL10心脏，较高比例的营养不良阳性细胞可能提供更好的保护。
最令人印象深刻的修正出现在体内血液动力学测定。在杂合小鼠中，50%的肌营养不良阳性心肌细胞对β-异丙肾上腺素应激产生100%的保护作用。尽管在d中获得了有意义的结果P（P）/天t吨在血压测量中，β-异丙肾上腺素激发不会显著改变心率(). 在持续输注β-异丙肾上腺素期间，心率立即增加(30-32). 我们只能推测，在我们的研究中，从β-异丙肾上腺素给药到心率测量的延迟是心率没有增加的原因。
在本研究中，我们证明了在mdx小鼠中部分表达dystrophin的治疗效果。我们的结果表明，mdx心脏50%的校正足以增强年轻成年小鼠的心肌细胞膜完整性并使血流动力学功能正常化。在50%的心脏细胞中表达全长肌营养不良蛋白具有巨大的治疗前景。
材料和方法
心脏肌营养不良蛋白表达的繁殖、心脏采集和量化
所有动物实验均按照美国国家卫生研究院和密苏里大学的机构指南进行。亲代BL10和mdx小鼠购自Jackson实验室。随后在密苏里大学通过繁殖建立了群体。父系杂合小鼠是通过将mdx雄性与BL10雌性杂交获得的。通过BL10雄性与mdx雌性杂交获得母体杂合小鼠(). 所有实验均在3个月大的雌性小鼠身上进行。
为了表征不同品系的心脏，通过颈部脱位对小鼠实施安乐死。取下心脏，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗三次，然后进行印迹干燥。在测量整个HW后，移除心房并测量左、右VW。为了确定相对HW和VW，我们还分离了左、右胫前肌（TA）并测量了TA重量。两个TA权重的平均值被定义为TW。
为了量化肌营养不良蛋白阳性细胞的数量，根据我们公布的方案，在液氮冷却异戊烷中快速冷冻新鲜切割的心脏，并在8μm冰冻切片中使用抗肌营养不良素C末端抗体（Dys-2，英国纽卡斯尔Novocastra Laboratories Ltd，UK）进行间接免疫荧光(14). 为了获得综合评价，对每个心脏样本从底部、中部和心尖的三个以上代表性截面进行量化。整个心脏节段的蒙太奇由每个节段的数字化图像组成。使用电子菌落计数器手动计数整个心脏切片中的所有肌营养不良阳性细胞。用Scion Image 1.62软件测定心脏相对面积。心脏绝对面积（mm2)通过使用参考KR 867微米将相对长度单位转换为公制单位，从相对心脏面积中扣除（Klarmann Rulings Inc.，美国新罕布什尔州利奇菲尔德）。心脏横截面积使营养不良蛋白阳性细胞总数正常化。
为了确认形态计量学定量结果，对BL10、mdx和杂合小鼠的心脏裂解物进行western blot。简言之，将新鲜解剖的心脏在液氮中粉碎，并重新悬浮在含有5mM乙烯的裂解缓冲液中-第二类-氧乙基三硝基四乙酸（EGTA）、1%十二烷基硫酸钠（SDS）和1×蛋白酶抑制剂（美国印第安纳波利斯罗氏应用科学公司；目录号1836145）。在功率输出为6.0（Misonix Sonicator 3000，Misonix Inc.，Farmingdale，NY，USA）的条件下进行5分钟的超声处理后，在台式离心机（Eppendorf离心机5417C）上以4°C、10 000 rpm的转速旋转5分钟，清除裂解产物。每个菌株的100μg上清液在4°C下用6%SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳15小时，然后转移到Hybond硝化纤维素膜（Amersham Bioscience，目录号RPN303E）。Ponceau-S染色证实了蛋白质的装载和转移。首先用Dys-2抗体（C末端特异性，1:100稀释）检测印迹，然后用HRP结合的抗小鼠二级抗体（1:2000，美国宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson Immunoresearch Laboratories，West Grove）。ECL免疫检测系统（Amersham Bioscience，目录号RPN2106）显示信号。
心脏对EBD的摄取
根据β-异丙肾上腺素（一种正性肌力药物）激发后的EBD摄取量，测定心肌细胞的肌膜完整性。在心脏收获前24小时，将EBD（PBS中10 mg/ml，体重20μl/g）注入小鼠尾静脉。在12、18和21小时后依次给药三种剂量的β-异丙肾上腺素（350 ng/g BW，腹腔注射）。使用尼康E800荧光显微镜在德克萨斯红通道下观察EBD摄取。用Scion Image 1.62软件测定EBD阳性区域的百分比。
闭胸式体内血液动力学测定
为了测定心脏血流动力学功能，我们用2%异氟醚诱导小鼠麻醉，然后腹腔注射含有720μg/g氨基甲酸乙酯、5μg/g依托咪酯和1μg/g吗啡的新制鸡尾酒(12,33). 在解剖显微镜下，进行中线切口以暴露右侧颈总动脉。然后将1.4 F Millar微压导管（Millar Instrument，美国德克萨斯州休斯顿；目录号SPR-671）插入右侧颈总动脉，并通过主动脉瓣进入左心室。心率、收缩压和舒张压以及压力变化率（dP（P）/天t吨最大值，dP（P）/天t吨最小值）通过BIOPAC MP100数据采集装置以500 Hz的采样率记录（BIOPAC Systems Inc.，Goleta，CA，USA）。使用AcqKnowledge软件对每只小鼠的8秒记录进行分析。由于并非每只小鼠的舒张末期都有明确的界限，我们选择使用最小左心室压作为舒张功能的替代指标。
如前所示，在没有外部压力的情况下，mdx心脏功能得到了完全补偿(15). 为了测量肌营养不良蛋白的心脏保护作用，用β-异丙肾上腺素对小鼠进行激发。简单地说，在血液动力学分析之前的12、6和3 h，依次给药三种剂量的β-异丙肾上腺素（i.p.350 ng/g BW）。在这些研究中，血液动力学参数的记录和分析方法与无β-异丙肾上腺素激发时完全相同。
统计分析
数据表示为平均值±SEM。我们首先在SAS软件（SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）中使用Shapiro–Wilk测试确保数据是正态分布的。然后，我们进行了单向方差分析测试，以确定基因差异是否影响每个终点。后hoc使用同方差学生的t吨-测试。显著性水平设为0.05。
致谢
我们感谢Robin L.Davisson博士、Timothy E.Lindley博士、James Bosanquet先生和Vinay Rawlani先生在开发体内血液动力学测定。我们感谢Richard Tsika博士分享他的心脏采集技术，感谢Bin Ge女士进行统计分析。我们也感谢马凯·斯科特博士和林恩·斯迈尔女士的帮助。这项工作得到了国家卫生研究所（AR-49419，D.D.）、肌肉营养不良协会（D.D.和J.S.）和密苏里大学研究委员会（D.D.）的资助。
参考文献
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