介绍
杜氏肌营养不良症(DMD)是一种遗传性X连锁疾病,每3500名男性婴儿中就有1例发生,这是由于缺乏肌营养不良蛋白,肌营养不良素是一种连接细胞内细胞骨架和细胞外基质的大蛋白[1]DMD通常在3岁左右被诊断为骨骼肌衰弱。患者在10岁左右失去了行走能力,并出现了与骨骼肌和呼吸肌无力相关的多种医疗问题。心肌病是第二个十年发展的共同特征。[2], [三], [4]死亡通常发生在生命的第二到第三十年,死于呼吸或心脏衰竭。随着骨骼和呼吸系统治疗的改善和患者寿命的延长,估计10-20%的DMD患者死于心肌病并发症。[5], [6]
贝克尔肌营养不良症(BMD)大约发生在30000名男性中的1人,由肌营养不良蛋白减少和/或异常引起。[7]骨密度是由肌营养不良蛋白的部分功能丧失引起的,表现出更多变的临床过程。[8]虽然骨骼肌功能受到的影响较为轻微,但骨密度患者心脏病的发病率较高,可能需要心脏移植。[9], [10]
将肌营养不良蛋白缺乏症的初始细胞损伤与组织病理学和功能障碍联系起来的事件的确切顺序仍相对缺乏了解,心脏和骨骼肌的机械途径可能不同。例如,骨骼肌经历退化和再生周期,再生潜力随着年龄的增长而降低,随着时间的推移,导致预期的肌肉萎缩和虚弱。另一方面,心脏显示出很少的再生能力,而进行性病理可能是由纤维化和/或心肌细胞丢失共同驱动的。[11], [12]更好地了解杜氏肌营养不良心脏受累的分子和细胞发病机制,将有助于确定合适的治疗靶点,从而最终提高杜氏肌供血不足患者的生活质量并延长生存期。
DMD动物模型中密度纤维板小鼠Xp21.1基因座与人类缺失基因相似。[1], [13], [14]尽管潜在的基因缺陷在人类和中密度纤维板小白鼠,临床图片大不相同。这个中密度纤维板骨骼肌在3-4周龄时经历早期急性退化阶段,随后是成功的再生阶段。这个中密度纤维板小鼠还出现心肌病,伴有心功能下降和心肌纤维化。[15]
我们研究了中密度纤维板用高频超声心动图更好地表征小鼠心脏功能障碍。与临床系统(15 MHz)相比,我们使用了更高的频率(30 MHz),这使得心脏结构的二维(2D)可视化更好,并且能够更精确地测量心脏内的血流多普勒速度中密度纤维板鼠标。我们还将功能和组织学参数与在中密度纤维板心脏用mRNA表达谱和定量实时PCR验证。这些分子和生理相关性可能为DMD和其他形式的心肌病的治疗提供新的治疗见解。
材料和方法
动物护理
所有的老鼠都是按照动物保护和使用委员会的指导方针处理的。一个月龄、三个月龄和九个月龄的C57Bl/6J(野生型)和C57Bl/10ScSn-Dmd中密度纤维板/J型(中密度纤维板)体重20-30克的老鼠从杰克逊实验室(马萨诸塞州巴尔港)购买。所有的老鼠都被关在一个单独的通风笼子系统中,有12小时的光暗循环,并接受标准的老鼠喂食和饮水随意.
超声心动图
野生型(n=10)和中密度纤维板(n=14)只小鼠在1个月、3个月和9个月时进行扫描。将小鼠置于诱导室中,5%异氟醚与100%氧气混合,持续流入诱导室。老鼠入睡后,将其从诱导室取出,称重,并放置在带有心电图接触垫的加热平台上(德克萨斯州休斯顿,Indus Instruments,THM 100),然后将鼻子放入含有1-2%异氟醚的100%氧气的鼻锥内。使用活性炭吸收过滤器(VaporGuard、VetEquip、Pleasanton、Ca)被动排空多余气体。眼睛被一种石油基眼膏覆盖。电极凝胶放在爪子上,爪子用胶带粘在加热平台上的心电图接触垫上。用凝胶润滑直肠探针,将其放置在直肠内并用胶带固定在平台上。温度保持在36.5至37.5°C。在尾巴周围放置血压(BP)袖带,然后将尾巴放置在传感器组件中进行无创血压监测(SC1000,Hatteras Instruments,Cary,NC)。将脱毛膏涂抹在小鼠胸部,两分钟后取出。将超声凝胶放置在麻醉小鼠的胸部。超声探头(RMZ 702a,Vevo 660,VisualSonics,Toronto,Canada)与超声凝胶接触,扫描时间超过20分钟。获得了B型、M型和频谱多普勒图像。扫描期间持续监测体温、心率(HR)和血压。完成后,从鼠标中移除所有探针和监视器。用水清洗老鼠,然后让它在加热的平台上恢复。醒来后,老鼠被送回笼子。
使用分析软件(VisualSonics,加拿大多伦多)离线进行定性和定量测量。基于心电图千赫的可视化(EKV™)软件分析为模拟的250至1000 Hz静态和Cine循环图像生成了离线重建。超声心动图测量包括血管直径、心室壁厚度和心室大小,以及房室瓣和半月瓣的血流速度。使用改良胸骨旁短轴和长轴的EKV™图像,通过面积-长度法(LVM(g)=1.05{[5/6*LV心外膜面积(左室长轴舒张+心肌厚度)]-[5/6*左室心内膜面积*左室长线舒张)]}测量左室质量。[16]改良胸骨旁长轴心电图环也用于通过Simpson法(Simp)测量射血分数(EF)(). M模式图像()用于测量左心室(LV)室大小和壁厚。根据M模式测量,使用前沿到前沿法,通过公式%缩短分数(%SF)=左心室内径(舒张期)[LVID(d)]−左心室内径(收缩期)[LVID(s)]/LVID(d)计算缩短分数百分比。
营养不良蛋白缺乏中密度纤维板高频超声心动图显示小鼠心功能下降(A) 左心室长轴视图,采用辛普森法测量舒张末期容积。(B) 左心室M型追踪的放大图显示了用于计算缩短分数的测量值。
使用超声心动图衍生值和血压测量值进行其他计算。使用公式SV={[π(主动脉直径)]导出动脉容积[SV(calc)]2/4] *[主动脉速度时间积分]。使用公式CO=SV(calc)*心率(HR)得出的心输出量[CO(calc。使用之前RR间期的{[LVID(d)]−[LVIDs(s)]/LVID(d)}/喷射时间/平方根计算校正心率的周向纤维缩短速度(VCFc)。左心室经向壁应力(WS米)使用公式0.334[收缩压(SBP)*LVID(s)]/{收缩时左心室后壁厚度(LVPWs)[1+(LVPWs/LVID)]}得出。使用公式(等容收缩时间+等容舒张时间/射血时间)计算心肌性能指数(MPI)。
纤维化定量
用苏木精-伊红(H&E)(Sigma,St.Louis,Mo)和Gomori’s三色染色法对石蜡包埋的心脏组织切片进行染色,染色剂包括:固绿FCF、染色2R和磷钨酸。组织在光学显微镜下成像,并使用计算机软件(奥林巴斯C.a.S.T.体视学系统,奥林巴斯美国公司,宾夕法尼亚州中央山谷)获得数字图像。数字图像被复制到PowerPoint中,调整到相同的大小,然后打印出来。图像被放置在包含50个随机间隔的点的覆盖图中。使用三色染色玻片,对覆盖蓝色染色结缔组织区域的所有点进行计数。结缔组织面积表示为计数的点数除以覆盖物上的总点数的比率。[17]
RNA分离
左心室组织在液氮冷却的异戊烷中冷冻。将组织放入装有1 ml Trizol的试管中并均质。根据制造商的说明(Qiagen,Valencia,Ca),分离总RNA,然后使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒进行清洁。在凝胶上检查总RNA的完整性,并使用Nanodrop ND-100分光光度计(Nanodrot Technologies,德国威明顿)进行量化。
基因表达谱分析
为了确定候选分子网络,研究了左心室的基因表达谱中密度纤维板9至10个月龄的野生型(n=3)小鼠。根据Affymetrix协议(Affymetix USA),对从左心室提取的总RNA进行扩增(一个周期),并与Affym特里克斯GeneChip®小鼠表达集430 2.0杂交。
使用不同的探针集算法(MAS5.0、dCHIP、RMA)进行基因表达数据分析,并使用GeneSpring软件(Stratagene、La Jolla、Ca)进行数据可视化和统计分析。[18]根据RMA和dChip算法中的一致性,选择显示病理相关变化的候选探针集,其中至少有一个当前调用,Welch ANOVA t检验与野生型相比p<0.05,基因表达存在两倍差异。我们还使用了Ingenuity Pathway Analysis程序(Ingenuiity Systems,Red Wood City,Ca)来定义涉及所选转录物的已知蛋白质和基因蛋白质网络。
所有微阵列数据都可以在公共表达式分析资源网站上公开获取(http://pepr.cnmcreesearch.org/home.do). 本网站包含。日期。CEL和。每个微阵列的TXT文件以及在线时间查询和可视化工具,以帮助分析数据库。
实时聚合酶链式反应(RT-PCR)
选择与病理生理学相关的mRNA转录物,并通过RT-PCR进行确认。独立于肌营养不良蛋白缺乏心脏(n=4)、腓肠肌(n=5)、野生型心脏(n=3)和腓肠肌的基因剖析实验的样本用于验证研究。如上所述分离总RNA,并使用300 ng总RNA和ABI高容量cDNA试剂盒(加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司)生成cDNA。将该cDNA添加到TaqMan 2x通用PCR混合物和所需的TaqMan基因表达测定引物(加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司)中。使用7900 HT Fast Real time PCR系统(Applied Biosystems,Foster City,Ca)以相对定量ΔΔct模式进行实时PCR。使用制造商提供的SDS2.2软件分析数据。
免疫荧光化学
心脏组织在异戊烷中快速冷冻,然后在-80°C下保存。使用低温恒温器制作6微米厚切片的组织载玻片,并将其固定在4%的多聚甲醛中。将载玻片置于0.1%的triton-X中。用1%的山羊血清进行阻断。将载玻片与抗鼠Nox4抗体(埃默里大学病理学和实验医学系J.David Lambeth博士的礼物)在4°C下以1:200的稀释度孵育过夜。将载玻片与二级抗体AlexaFlour 594(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)在室温下以1:1000的稀释度孵育1小时。盖玻片上涂有Vectashield安装介质(加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories),并用透明指甲油密封。[19]使用蔡司Axiovert 200M ApoTome显微镜(纽约州桑伍德市卡尔蔡司显微成像公司)观看幻灯片。
统计
在1个月龄、3个月龄和9个月龄时,使用未配对t检验分析比较每个测量或计算变量的超声心动图值。采用非配对t检验计算纤维化程度的显著性。基因表达数据采用Welch ANOVA t检验(p<0.05)确定显著性。RT-PCR利用未配对t检验分析比较2-ΔΔCt±标准。与野生型相比的Dev.(ΔCt),并与HPRT1对照探针标准化。
结果
高频超声心动图显示mdx心脏功能障碍
我们在1个月龄和3个月龄时未检测到心脏结构或功能的变化(数据未显示)。然而,在9-10个月大时,许多功能参数存在显著差异。显示了左心室M型成像的解剖测量结果中密度纤维板和C57Bl/6J,9至10个月龄。显著差异包括收缩末期左心室内径增加[LVID(s)](p=0.0023)和收缩末期左室后壁厚度减少[LVPW(s)][p=0.0019)。然而,流入道和流出道的多普勒速度测量值没有显著差异().
表1
Mdx公司9至10个月大时,与野生型相比,小鼠的左心室M型测量值发生了显著变化
M模式 测量(mm) | 9-10个月 |
---|
野生型 | 中密度纤维板 |
---|
左室前壁(d) | 0.89±0.14 | 0.90±0.14 |
低压内径(d) | 3.61±0.33 | 3.85±0.39 |
左室后壁(d) | 0.82±0.12 | 0.78±0.12 |
左室前壁 | 1.31±0.22 | 1.14±0.22 |
LV内径 | 2.40±0.36 | 2.94±0.39* |
左室后壁 | 1.12±0.15 | 0.94±0.10* |
表2
9-10个月龄野生型和中密度纤维板老鼠
频谱多普勒 测量 | 9-10个月大 |
---|
野生型 | 中密度纤维板 |
---|
主动脉Vmax(mm/s) | 880±101 | 882±165 |
主动脉VTI(mm) | 2.31±0.34 | 2.71±0.64 |
肺动脉Vmax(mm/s) | 667±59 | 619±78 |
肺动脉VTI(mm) | 2.3±0.4 | 2.3±0.5 |
二尖瓣E波峰值速度(mm/s) | 629±46 | 610±97 |
三尖瓣A波速度(mm/s) | 464±104 | 426±68 |
在以下几个参数中观察到显著的功能差异:中密度纤维板和野生型小鼠(). 舒张压(p<0.0001)和平均血压(p<00001)在中密度纤维板老鼠。收缩压呈显著下降趋势(p=0.05)。最重要的是,中密度纤维板小鼠的缩短分数显著降低(p<0.0001),缩短分数是评价心脏收缩功能的金标准。还计算了喷射分数,并在中密度纤维板小鼠与野生型小鼠比较(p<0.05)。子午壁应力(WS)的计算米)年也显著增加中密度纤维板小鼠(p<0.01)。VCFc在中密度纤维板小鼠(p<0.0001)。9-10个月大的左心室重量(根据面积-长度公式得出)有增加趋势中密度纤维板小鼠,但这没有达到统计学意义。[20], [21]最后,心肌性能指数(MPI)(收缩和舒张功能的全面评估)在中密度纤维板小鼠(p<0.05),表明心脏舒张和收缩功能下降。总的来说,超声心动图数据与9-10个月大婴儿的心肌病相一致中密度纤维板小鼠与野生型对照组进行比较。
表3
9-10个月大婴儿功能评估的显著差异中密度纤维板小鼠与野生型的比较
功能测量 | 野生型 | 中密度纤维板 |
---|
心率(bpm) | 506±82 | 460±83 |
收缩压(mmHg) | 90±13 | 80±10 |
舒张压(mmHg) | 75±7 | 45±6*** |
平均血压(mmHg) | 81±6 | 56±6*** |
缩短分数% | 33.6±4.8 | 23.5±5.1*** |
射血分数%(Simp) | 54±11 | 40±14* |
中风量(calc)ml | 0.037±0.01 | 0.043±0.01 |
心输出量(calc)ml/min | 18.62±3.5 | 19.21±5.1 |
墙体应力米(克/厘米2) | 43±15 | 63±12** |
VCFc(圈/秒) | 0.29±0.04 | 0.20±0.04*** |
左心室质量(mg) | 75±11 | 90±23 |
心肌性能指数 | 0.78±0.12 | 0.88±0.06* |
mdx心脏的心脏纤维化显著升高
左心室结缔组织比率增加中密度纤维板心脏与野生型小鼠的比较(p<0.0001)表明9-10月龄小鼠的纤维化增加(). 染色显示纤维化呈斑块状,遍及整个左心室,包括侧壁游离壁和室间隔().
左心室中密度纤维板组织形态计量学显示小鼠纤维化面积增加(A) 9-10月龄结缔组织面积与正常心肌面积比值的图示中密度纤维板小鼠和野生型小鼠。纤维化组织面积显著增加中密度纤维板左心室(p=0.0001)。(B) 野生型小鼠(10X)的H&E染色左心室。(C) H&E染色左心室中密度纤维板出现斑片状纤维化区域的小鼠(10倍)。(D) H&E染色野生型小鼠左心室心肌细胞形态正常(40倍)。(E) H&E染色的左心室心肌中密度纤维板小鼠出现局部心肌细胞变性和成纤维细胞浸润增加(40X)。(F) 与B板(10X)对应的三色染色组织。(G) 与C板相对应的三色染色组织显示胶原面积增加(10X)。(H) 相应的三色染色组织与板D显示正常的细胞形态(40X)。(一) 与E板相对应的三色染色组织显示心肌广泛的胶原浸润。
基因表达谱显示促纤维化基因表达
基因表达分析中密度纤维板和对照组(野生型)的左心室在10个月大时进行(每组3个),并使用两种探针集算法(dCHIP和RMA)分析微阵列。我们和其他人已经表明,解释相同微阵列图像的不同方法(探针集算法)之间的一致性约为30-40%。[18]减少微阵列研究中假阳性和假阴性基因选择的一种方法是研究那些对两个探针集算法显示统计意义的转录本。使用这种方法,两种探测集算法的阈值均为p<0.05,另外两种数据过滤器(“当前调用”过滤器和>2倍变化过滤器),我们发现中密度纤维板与野生型心脏相比,参与肝纤维化前通路的几个基因存在显著差异(). 许多上调基因与TGF-β信号传导相关,包括细胞周期素依赖性激酶抑制剂(Cdkn1A/p21)、NADPH氧化酶4(Nox4)、赖氨酸氧化酶(Lox)、血管内皮生长因子C(Vegfc)、成纤维细胞生长因子12(Fgf12)、结缔组织生长因子(Ctgf)和基质金属蛋白酶14(Mmp14/MT1-MMP)。其他感兴趣的基因包括利钠肽前体B型(Nppb),这是心力衰竭和心脏容量过载期间分泌的蛋白BNP的前体,以及肌浆网钙处理蛋白肌脂蛋白(sln)。
表4
基因分析数据显示9-10个月大婴儿左心室中发现上调基因中密度纤维板小鼠和与野生型小鼠相比的倍数增加(FI)对于两种探针集算法(dCHIP,RMA),所有显示的转录本均显著(p<0.05)。
Genbank ID | 基因名称 | 简要说明 | 金融机构 |
---|
电话:005446 | 第1章 | CAP,腺苷酸环化酶相关蛋白1(酵母) | 12.14 |
NM_007669 | Cdkn1a型 | 细胞周期素依赖性激酶抑制剂1A(P21) | 9.82 |
NM_007598号 | 第1章 | CAP,腺苷酸环化酶相关蛋白1(酵母) | 7.97 |
BM233251型 | Wdfy1型 | WD40和FYVE域包含1 | 6.44 |
BC021831号 | 错误1 | 红细胞分化调节剂1 | 6.05 |
AK013278号 | 待定5 | BTB(POZ)域包含5 | 5.82 |
AK008863公司 | Sln公司 | 沙克菌素 | 4.99 |
BQ031098号 | Wdfy1型 | WD40和FYVE域包含1 | 4.30 |
BC021378号 | 第4个 | NADPH氧化酶4 | 3.47 |
NM_010728号 | 洛克斯 | 赖氨酰氧化酶 | 3.44 |
AK007630 | Cdkn1a型 | 细胞周期素依赖性激酶抑制剂1A(P21) | 3.35 |
NM_010858号 | 第4年 | 高迁移率基团核糖体结合域1 | 3.21 |
AK004853号 | Dkk3型 | Dickkopf同源物3(非洲爪蟾) | 3.11 |
NM_022879 | Myl7公司 | 肌球蛋白,轻多肽7,调节性 | 2.86 |
NM_013749 | Tnfrsf12a号 | 肿瘤坏死因子受体,成员12a | 2.86 |
NM_013749 | Tnfrsf12a号 | 肿瘤坏死因子受体,成员12a | 2.83 |
NM_009003号 | 拉伯4a | RAB4A,RAS癌基因家族成员 | 2.64 |
NM_015814 | Dkk3型 | Dickkopf同源物3(非洲爪蟾) | 2.64 |
NM_009994号 | Cyp1b1周期 | 细胞色素P450,家族1,亚家族b,多肽1 | 2.59 |
AW228853型 | 素食主义者 | 血管内皮生长因子C | 2.57 |
BC019757号 | 历史1h4i | 组蛋白1,H4i | 2.49 |
AK011892公司 | 图3 | 磷脂酶C,δ3 | 2.49 |
NM_008966号 | Ptgfr公司 | 前列腺素F受体 | 2.48 |
BB774399型 | 姆拉纳 | 黑色素瘤-A | 2.40 |
BB559501型 | 罗拉牌手表 | RAR相关孤儿受体α | 2.38 |
AF020738型 | 第12层 | 成纤维细胞生长因子12 | 2.37 |
AB013592号 | 肌细胞 | 肌球蛋白 | 2.37 |
AK017926号 | 日期4 | DNA损伤诱导转录物4 | 2.31 |
NM_008726号 | Nppb公司 | B型利钠肽前体 | 2.28 |
BB353211型 | 英赫布 | 抑制素β-B | 2.26 |
BG966751型 | 等电位5 | ets变异基因5 | 2.23 |
NM_022814号 | 多才多艺 | Von Willebrand因子A型、EGF和戊四氮 | 2.19 |
X16834型 | 拉加尔3 | 凝集素,半乳糖结合,可溶性3 | 2.16 |
AV343573型 | Cbln4号机组 | 小脑蛋白4前体蛋白 | 2.14 |
NM_010217 | 细胞生长因子 | 结缔组织生长因子 | 2.13 |
AV273591 | Nt5e号 | 5'核苷酸酶,外 | 2.09 |
纳米_008608 | 14毫米 | 基质金属蛋白酶14(插入膜) | 2.08 |
BC018236号 | 阿拉德 | 氨基乙酰丙酸,δ-,脱水酶 | 2.04 |
BC014731号 | 第16部分 | 聚(ADP-核糖)聚合酶家族,成员16 | 2.01 |
RT-PCR显示Nox4上调是心肌特异性的
在9-10个月大的婴儿中进行RT-PCR中密度纤维板野生型左心室组织独立于用于表达谱分析的样本。选择用于验证的转录物包括已知参与心肌细胞存活和心肌纤维化的转录物。Nox4在中密度纤维板小鼠与野生型小鼠的比较(p=0.001)。与野生型相比,NADPH氧化酶1(Nox1)或Nox2(Cybb)mRNA水平没有显著差异。Lox mRNA水平与野生型相比显著增加(p=0.0016)(). 还研究了3个月大的婴儿的Nox4和Lox mRNA水平中密度纤维板野生型小鼠没有心肌病的证据。Nox4 mRNA没有显著改变(1.25±0.56 in中密度纤维板野生型为1.0±0.38,p=0.26)。然而,Lox在这一早期显著增加(1.96±0.29倍于中密度纤维板野生型为1.0±0.38,p<0.0001)。因此,在9-10个月大时,心肌中Lox mRNA水平早期升高,随后Nox4和Lox mRNA水平升高。
左心室Nox4 mRNA表达增加中密度纤维板心肌病小鼠9-10个月大婴儿心脏(A)和骨骼肌(B)组织中Nox1、Nox2、Nox4和Lox的实时PCR结果中密度纤维板和野生型小鼠。Nox4和Lox在中密度纤维板心肌中的小鼠以及骨骼肌中的Nox2和Lox。P值用于中密度纤维板每个基因的野生型。
在骨骼肌样本中,Nox4和Nox1没有显著差异。然而,Nox2(p=0.008)和Lox(p=0.0001)在中密度纤维板小鼠骨骼肌与野生型的比较(). Nppb mRNA水平也验证了增加的基因表达谱数据(p=0.009)。其他与心肌细胞存活有关的基因IGF-1、IRS-1趋于显著(分别为p=0.06和0.07)。肉大肠杆菌素实际上在中密度纤维板心脏,与表情分析数据相反().
左心室Nppb mRNA表达增加中密度纤维板表现出心肌病的小鼠9-10个月大婴儿心脏组织中Igf-1、Irs-1、Pdpk1、Nppb和Sln的实时PCR结果中密度纤维板和野生型小鼠。Nppb显著增加中密度纤维板小鼠(p=0.009)。
免疫荧光显示左心室组织中Nox4蛋白水平增加
对9个月大的婴儿心室组织进行免疫荧光检测中密度纤维板和正常小鼠。抗-Nox4抗体在心肌细胞核中的结合增强(). 这与其他组织类型的研究一致,即培养中的血管平滑肌细胞。[22]这些结果支持基因表达和RT-PCR数据显示心室组织中Nox4表达增加。
9~10月龄左心室心肌细胞核中Nox4蛋白增加中密度纤维板老鼠使用原发性Nox4抗体的免疫荧光显示左心室心肌细胞结合增强中密度纤维板(顶部面板)小鼠与野生型(wt)小鼠的比较(底部面板)。DAPI反染色证实细胞核定位。
讨论
随着骨骼肌和呼吸肌功能障碍延长寿命治疗方法的改进,心肌病正在成为越来越多DMD患者的死亡原因。[5], [6]需要更好地了解这种独特的心肌病的发病机制,以改善患者的预后和生活质量。本研究利用高分辨率超声心动图无创评估心功能,并确定DMD小鼠模型心肌病中发生的分子变化中密度纤维板鼠标。9-10个月大时心功能明显下降,左心室组织中Nox4和Lox基因表达增加。这是第一份关于全球基因表达变化的报告中密度纤维板心肌病。
之前的一项使用传统M型成像的研究记录了一种扩张型心肌病中密度纤维板老鼠。[15]在那项研究中,意识中密度纤维板在8周、29周和42周龄时对小鼠和年龄匹配的C57BL10ScSn对照组进行研究。在8周龄和29周龄小鼠中没有发现差异。在42周大的时候中密度纤维板与野生型小鼠相比,小鼠左心室舒张末期内径增加。此外,缩短率百分比在中密度纤维板小鼠与对照组比较。这是42周龄扩张型心肌病的证据中密度纤维板老鼠。
我们的研究也没有发现6周龄和18-20周龄小鼠有任何显著差异。在老年小鼠中,我们的研究与Quinlan等人(2004年)的研究一致,发现中密度纤维板小鼠采用高频超声心动图。[15]由于之前的研究使用了清醒的小鼠,而我们的研究是使用吸入异氟烷麻醉进行的,因此数值不同。众所周知,异氟烷麻醉可以降低小鼠的心率和收缩力,因此我们的研究表明,心率降低,缩短百分比整体下降。[23]虽然麻醉时心率的变化可能会影响心输出量等计算值,但对缩短分数的影响在各组之间是一致的。心室功能下降与左心室收缩末期内径显著增加相对应。然而,正如Quinlan等人(2004年)所见,我们没有发现左心室舒张末期内径显著增加,这表明存在扩张型心肌病。
我们利用增加频率(30 MHz)的超声和使用EKV™成像的超声心动图系统,以及基于千赫兹ECG的可视化,对之前的报告进行了扩展。使用分辨率为1000 Hz的M模式图像数据对单个心跳进行二维重建,改善了心内膜和心外膜边界的可视化。通过使用EKV™成像,我们能够追踪心脏收缩和舒张时的心内膜边界,从而得出射血分数。这个超声心动图视图()与临床上使用的心室不同,因此有人担心左心室略微缩短,可能导致测得的心室容积变小。然而,使用这项技术,我们始终显示出中密度纤维板小鼠与野生型对照组进行比较。虽然射血分数是人类临床超声心动图实验室中常用的功能测量值,但以前的技术不允许在小鼠中进行此测量,因此这是一项评估小动物模型心脏功能的新发现。
高频系统分辨率的提高也提供了执行功能评估的更多功能。其中许多评估都是衍生计算,需要包括心率和血压在内的数据。9-10个月大的婴儿血压显著下降中密度纤维板老鼠。血压下降的确切机制尚不完全清楚,但心功能下降和麻醉可能是其原因。此外,在中密度纤维板小鼠,已知血管内皮功能失调涉及一氧化氮合酶。一氧化氮的不当反应可能会影响血管阻力和血压。[24], [25]
其他重要的功能评估包括壁应力,这是对收缩期间心肌纤维承受的压力的估计。该值在中密度纤维板这表明,变薄、功能不良的心肌实际上比正常心脏承受的压力更大,可能会导致心肌细胞死亡的增加。另一项功能评估,即VCFc,是计算心肌纤维缩短的速度。这在年显著减少中密度纤维板小鼠心脏功能恶化。这些是新的心脏功能测量方法,从中密度纤维板并提高我们对心肌病的评估和理解中密度纤维板小鼠模型。
最近的研究证实,与传统的临床平台相比,高频超声心动图在研究小鼠模型的心脏功能方面更为可行和可重复。[26]我们使用高频超声心动图测量缩短分数的结果也与在不同小鼠模型中使用类似技术的其他研究一致。[27], [28], [29], [30]射血分数的计算也与最近的研究一致。[31]在2D胸骨旁长轴上直接测量射血分数百分比的附加功能允许高频超声心动图与其他新的成像方式(如3D回波和MRI)一起使用[32], [33], [34]
我们的组织学结果与之前的研究一致,这些研究表明中密度纤维板老鼠。[15], [35], [36], [37], [38]功能性肌肉组织的丧失和由此产生的纤维化可导致心脏收缩和舒张功能下降。由于纤维化是片状的,并且不会专门局限于肌肉受累最严重的区域,即左心室游离壁,因此可能涉及的机制不仅仅与膜不稳定和剪切力的异常传递有关。然而,这些途径及其对心脏细胞死亡的贡献程度尚不清楚。
心肌病中密度纤维板小鼠也可以有不同的临床表现。在我们的研究中,我们认为观察到的变化并不显著。从功能角度来看,野生型缩短率测量的标准偏差为±4.8%,野生型为±5.1%中密度纤维板这表明在对照小鼠和中密度纤维板老鼠。在基因表达谱分析中使用p值作为筛选方法时,使用n=3个重复可能对更细微的变化不敏感,但仍应保持足够的特异性。考虑到我们确实使用了相对较少的动物,我们将重点放在使用替代方法,即定量RT-PCR和免疫荧光,在独立样本中验证关键通路成员。通过在独立样本中验证这些结果,我们进一步证明了不受个体差异影响的显著差异。
与我们的研究一样,基因表达谱已被广泛用于研究许多其他小鼠和人类心肌病模型的遗传变异。在小鼠病毒性心肌炎模型中,BNP和Lox在感染后3天和9天升高。还存在影响细胞外基质(即IV型胶原)和应激反应(即热休克蛋白27、60、86)的上调基因。[39]在缺乏肌肉LIM蛋白的小鼠中,心肌病与BNP、Ctgf和热休克蛋白25和27的增加有关。Ctgf在心力衰竭早期到晚期的进展过程中也表现出显著的表达增加。[40]BNP和Ctgf也被证明是人类特发性扩张型心肌病的标志物。[41], [42]其他对人类的研究显示许多其他细胞外基质相关基因上调。[43], [44]
我们发现9至10个月大的婴儿左心室组织中Nox4和Lox mRNA增加中密度纤维板小鼠,而氧化酶Nox1和Nox2(Cybb)没有上调(). 在之前提到的任何心肌病模型中都没有提到Nox4表达增加。Lox mRNA在3个月大的左心室组织中也增加中密度纤维板老鼠。因此,Nox4和Lox可能在心肌纤维化增加中起着重要作用中密度纤维板老鼠。
Lox是一种细胞外铜依赖酶,可启动胶原蛋白和弹性蛋白的交联。[45]Lox已被证明在心血管发育和功能中非常重要,特别是与主动脉中的弹性蛋白层有关。[46], [47]这个基因家族在心脏重塑中也很重要。在小鼠冠状动脉结扎模型中,在远离梗死部位的纤维化心肌中也发现Lox mRNA上调。[48]在一项使用培养的大鼠心脏成纤维细胞的研究中,当赖氨酸氧化酶被一种氨肽酶B抑制剂arphamenine a抑制时,胶原蛋白的生成减少。[49]另一种赖氨酰氧化酶抑制剂氨基丙腈在血管紧张素I、II和III刺激下,可消除成年男性心脏成纤维细胞的胶原收缩[50]这些研究表明,Lox在心脏纤维化中也有重要作用。值得注意的是,我们还观察到中密度纤维板鼠标。因此,Lox可能参与骨骼肌和心肌纤维化的共同途径。
Nox2在中性粒细胞和巨噬细胞中表达,主要参与宿主防御和炎症反应。[51]因此中密度纤维板骨骼肌可能与肌肉细胞死亡和再生相关的炎症反应有关。在一项使用Nox2(gp91phox)缺陷小鼠的研究中,发现与对照组相比,显示广泛膜损伤的肌肉纤维数量减少了90%。[52]然而,在心脏组织中没有发现Nox2活性增加,在中密度纤维板心肌组织(). 因此,在中密度纤维板心脏似乎与显著的炎性细胞浸润无关,Nox2可能比心肌更与骨骼肌病理有关。
这项研究表明,增加的Nox4是心脏组织特有的,位于细胞核中。Nox4在中密度纤维板骨骼肌(图6)和我们实验室提供的大量人类骨骼肌数据均未显示多发性肌营养不良症中Nox4 mRNA的增加(网址:http://sas.cnmcresearch.org).体外研究开始关注心脏成纤维细胞和与纤维化和瘢痕形成相关的次级信使。Cucoranu等人(2006年)在组织培养中表明,TGF-β1的刺激可使人原代心脏成纤维母细胞分化为心肌成纤维细胞,其表达的平滑肌α-actin mRNA数量增加[53]他们还表明,当TGF-β刺激时,心脏成纤维细胞表现出Nox4 mRNA的表达增加。用siRNA抑制Nox4表达可使平滑肌α-actin mRNA的表达降低95%。最后,已知TGF-β信号通路使用Smad 2/3磷酸化,而Nox4的缺失使Smad 2/3磷酸化降低了75%。Colston等人(2005年)发现,在培养基中添加过氧化氢后,原代人心脏成纤维细胞产生活性氧。他们还表明,与Nox2相比,成人心脏成纤维细胞非常丰富地表达Nox4。[54]这些研究,以及我们的发现中密度纤维板表明Nox4可能在心脏组织的纤维化反应中起重要作用。
Lox和Nox4在肌营养不良蛋白缺乏型心肌病中的相互作用和影响目前尚不完全清楚。两者都参与心脏纤维化对其他信号机制的反应,潜在的TGF-β或活性氧物种。随着我们继续寻找治疗杜氏肌营养不良的方法,如果针对减少心脏纤维化的数量,那么目前的潜在治疗可能是有效的。通过调节Nox4和/或Lox,可以保护DMD患者的心脏功能,改善生活质量,降低心脏死亡率。因此,Nox4通路似乎对心脏组织具有特异性,这是心脏纤维化的关键因素,可能为DMD心肌病提供一个新的治疗窗口。