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美国国家科学院院刊。1997年11月25日；94(24): 13287–13292.
数字对象标识：10.1073/pnas.94.24.13287
PMCID公司：PMC24301型
PMID：9371838

两种淀粉样前体蛋白转基因小鼠阿尔茨海默病样病理模型

克里斯汀·斯图克勒·皮尔拉特,*† 多萝西·阿布拉莫夫斯基,*† 梅里德·杜克,*‡ 卡尔·海因茨·维德霍尔德,* 克劳迪娅·米斯特尔,* 萨宾·罗萨彻,* 比吉特·莱德曼,* 库尔特·比尔基,* 彼得·弗雷,* 保罗·帕加内蒂,* 卡罗琳·沃里德尔,* 迈克尔·卡尔霍恩,§ 马蒂亚斯·朱克,§ Alphonse探测器,§ 马提亚斯·施陶芬贝尔,*和伯恩德·索默*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

淀粉样前体蛋白（APP）基因突变通过影响淀粉样β（Aβ）肽（AD斑块的主要成分）的形成，导致早发性家族性阿尔茨海默病（AD）。我们表达了人类APP751在转基因小鼠的大脑中含有这些突变。两个转基因小鼠系出现了类似AD的病理特征。病理程度取决于表达水平和特定突变。人类APP在670/671位瑞典双突变的2倍过度表达，再加上V717I突变，导致18个月大转基因小鼠的新皮质和海马中沉积Aβ。矿床多为弥散型；然而，可以检测到一些嗜粘连斑块。在仅含有瑞典突变的人类APP的7倍过表达小鼠中，典型的斑块在6个月龄时出现，随着年龄的增长而增加，首次检测到刚果红阳性。这些嗜丛斑块伴有神经炎性改变和营养不良的胆碱能纤维。此外，大量胶质反应所指示的炎症过程是明显的。最值得注意的是，斑块对过度磷酸化的tau具有免疫反应性，这让人想起早期的tau病理学。这种免疫反应仅见于两个品系的老年性粘连斑块。在高表达系中，可以在6个月大的动物中从生化角度证明tau磷酸化升高，并且随着年龄的增长而增加。这些小鼠与AD病理学的主要特征相似，提示aβ在该病的发病机制中起着中心作用。

阿尔茨海默病（AD）的病理特征是淀粉样斑块和神经纤维缠结(1)由淀粉样β（Aβ），一种39-43-氨基酸肽组成(2,三)和过度磷酸化的tau(4,5). 此外，广泛的神经炎变性已被描述，包括胆碱能纤维的急剧丧失(6,7). Aβ肽被认为在AD发病机制中起着核心作用，这是由编码其前体淀粉样前体蛋白（APP）的基因突变引起的，该基因与早发家族性AD（FAD）有关(8,9). 这些突变要么导致Aβ总量增加(10,11)或增加更多纤维原性Aβ-（1-42）(12,13).

人类APP转基因表达的无数尝试(14–19)已经获得了有效的AD动物模型。然而，只有两个转基因小鼠系被描述为具有AD特征的aβ沉积(20,21). 我们已经产生了各种表达人类APP的转基因小鼠751其中两个品系的转基因衍生APP表达水平和FAD突变不同，在新皮质和海马中形成不同程度的斑块样Aβ沉积。它们还显示了通常与Aβ肽无关的AD病理学的其他方面。

材料和方法

表达构建和转基因小鼠。

本研究中使用的转基因结构包含人类(19)或老鼠(22)Thy-1表达盒和人APP751cDNA起始于优化的Kozak共识序列并延伸至核苷酸3026(Hin公司dIII现场）(19). 人类APP cDNA在670/671位携带瑞典双突变（KM->NL）(8)单独或与伦敦突变（V717I）联合使用(9). Construct APP 14利用人体Thy-1暗盒驱动人体APP751瑞典语，在之前的研究中有详细描述(19). 除了人类APP cDNA中的额外V717I突变外，APP 22表达结构与APP 14相同。它是通过替换600-bpBgl公司II–Spe公司人类APP的I片段751带有携带V717I突变的相应片段的cDNA。为了生成APP 23的构造，APP751将带有瑞典突变的cDNA插入到钝端Xho公司包含小鼠Thy-1.2基因的表达盒的I位点(22). 向量序列被删除不是我和不是我/Pvu公司I分别用于APP 14/APP 22和APP 23的消化。小鼠注射和操作与所述程序相同(19).

RNA定量。

通过逆转录偶联PCR定量转基因mRNA(23). 简言之，从转基因小鼠系APP 14、22和23的大脑中分离出总RNA，并将其转录成cDNA。利用引物5′-ACCACGTGGAGCTCTCCCGTGAA-3′和5′-GCAACTGGCAGTGTACTGTTCTTC-3′，对人类和小鼠APP中常见的序列特异性引物，通过PCR扩增含有Aβ区的APP片段。将片段定向亚克隆到M13复制型DNA中，并将含有斑点的平板上的双滤膜提升物与寡核苷酸5′-AATTCGCATCCATTCCACTCCGA-3′和5′-AATATCGCATCACTCACTCAGA-3′杂交，区分小鼠野生型和突变的人类APP。

现场杂交。

现场按照描述进行杂交(24). A类33在最终浓度为2 pmol/ml的条件下，使用与核苷酸859和898之间人类APP编码序列互补的P标记寡核苷酸探针5′-AGCTCTCCTACCTCATCACCATCCTCATCGTCCG-3′。将杂交玻片暴露于β-max膜（Amersham）中3天。

西部印记。

用10 vol 50 mM Tris●HCl、pH 8/1%Nonide P-40/5 mM二硫苏糖醇/100 mM NaCl/5 mM-EGTA/50 mM氟化钠/1 mM原钒酸钠/100 nM癸二酸/1×完整蛋白酶抑制剂混合物（Boehringer Mannheim）与等体积的2×SDS样品缓冲液混合，使大脑皮层均匀化，并按所述进行处理(25). 样品在SDS/聚丙烯酰胺微凝胶上电泳，将蛋白质转移到Immobilon P（Millipore）膜上，并用抗体AT8（Innogenetics，Gent，Belgium）检测蛋白质印迹(26,27)，R27(28)和tau7，它是针对从成年大鼠脑中纯化的tau培养的，并识别来自多种物种的tau(29). 使用过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG（Dianova，Hamburg，F.R.G.）或过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG（Dianova）作为第二抗体。免疫印迹是用ECL系统（Amersham）开发的。

组织学。

在12岁时对APP 22系杂合小鼠进行分析(n个=3）和18个月(n个= 3). 杂合APP 23小鼠于6日处死(n个= 9), 9 (n个= 12), 12 (n个= 6), 15 (n个= 4), 18 (n个=3）和24(n个=3）个月。同等数量的非转基因同卵双胞胎作为对照。用4%多聚甲醛在磷酸盐缓冲盐水中灌注小鼠。小鼠脑石蜡切片（4μm）用血卟啉/伊红、甲胺银、刚果红、霍姆斯卢克索和加利亚斯碘化银染色(30). 对去蜡脑切片进行免疫组织化学染色。抗MAC-1，乙酰胆碱酯酶(31)用40μm自由漂浮固定冰冻切片进行主要组织相容性复合体（MHC）II类、补体C3和抗金组织化学。为了增强NF200、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和tau抗体的抗原性，脱蜡切片重新水化，并在90°C的柠檬酸盐缓冲液中浸泡30分钟。针对Aβ肽的初级抗体(32)表中总结了​表1。1此外，抗硫酸乙酰肝素单克隆抗体10E4（东京精谷）；抗神经丝NF200（英国纽卡斯尔诺沃卡斯特拉）；抗APP 474对纯化的大鼠APP的作用秒; 抗载脂蛋白E抗体；抗MAC-1和抗MHC II类（Serotec）；抗GFAP和抗磷酸酪氨酸PT-66（Sigma）；抗小鼠补体C3（Cappel，ICN）；抗PHF1(33)识别tau磷酸丝氨酸396和402；AT8单克隆抗体（先天性）(26,27)识别磷丝氨酸202；27兰特(28)针对磷酸化丝氨酸396提出；32兰特(28)如前所述，针对磷酸化丝氨酸262升高，针对τ肽升高N-tau 5(34)和单克隆抗体Alz50(35)使用了。用正常血清处理切片以阻断非特异性位点，并在4°C下与一级抗体孵育过夜。通过使用Vectastain ABC Elite试剂盒（Vector Laboratories）对结合的抗体进行可视化。

表1

识别小鼠和人类斑块的Aβ抗体

抗体抗原残基
达科8–17
NT11公司1–40
β11–40
AS 1–5*1–5
AS 12-28标准12–28
作为40/18*17–40
AS 42/14标准*36–42
AS 43/15标准*36–43
*这些抗体分别特异性识别Aβ氨基酸1、40、42和43。 

结果

Thy-1启动子控制的转基因小鼠脑内APP过度表达。

含有Thy-1启动子的表达盒用于驱动转基因小鼠中神经元特异性APP的表达（图。​（图1）。1). 两条鼠标线APP 14(19)和APP 22携带人类Thy-1启动子以驱动不同APP cDNA的表达。APP 14构造包含人类APP751随着670/671位瑞典双突变（KM→NL），APP 22表达单元还携带伦敦突变（V717I）。如APP 22小鼠所示，两种构建体在新皮层和海马中产生了具有最高转基因衍生mRNA水平的可比较的空间表达模式（图。​（图22A类). 在这两个品系中，mRNA水平超过内源性APP mRNA 2倍（数据未显示），这是由半定量PCR测定的。在第三行，APP 23，APP751瑞典表达由小鼠Thy-1启动子驱动。空间表达模式（图。​（图22B类)在性质上与APP 14和APP 22小鼠相似；然而，转基因是7倍的过度表达。通过Western blotting对所有三种小鼠品系的APP过度表达程度进行了确认（数据未显示）。

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APP转基因小鼠的转录单位。这些图是注入表达式构造的线性表示，并相应地进行了标记。人类Thy-1基因的外显子显示为实心框，带斑点的框表示APP 14和APP 22结构体3′端的猿病毒40肿瘤抗原序列。带阴影的方框表示APP 23构造中使用的小鼠Thy-1外显子。应用程序751cDNA显示为带有垂直线的开盒，标记了瑞典（S）和伦敦（L）FAD突变的位置。

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转基因小鼠脑中APP mRNA的表达和Aβ的沉积。(A类,C类、和E类)取自18个月龄APP 22小鼠的切片。(B类,D类、和F类)24个月龄APP 23小鼠的切片。现场小鼠APP 22脑矢状面切片的杂交(A类)和APP 23(B类)用人类APP特异性寡核苷酸探针进行。cp，尾壳核；cx，皮层；嗨，海马体。（条形=1 mm。）免疫组织化学(C类和D类)刚果红染色(E类和F类)转基因小鼠大脑的矢状面切片。使用针对Aβ8–17（Dako）的抗体进行免疫染色。（条形=100μm）箭头指向D类和F类.

APP 22和APP 23转基因小鼠在新皮质和海马中形成Aβ沉积。

尽管APP 14小鼠在2岁之前没有表现出任何AD病理学迹象（数据未显示），但在18个月龄但12个月龄APP 22小鼠的新皮质和海马中检测到Aβ沉积（图。​（图22C类). 较高表达的APP 23细胞系在6个月大时出现首次罕见沉积。它们的大小和数量随着年龄的增长而增加，最终在24个月大的小鼠中占据了新皮质和海马的大部分区域（图。​（图22D类). 在这个年龄段，丘脑和嗅核也有沉积物，尾状壳核中也有沉积物。在这两条线中，所有沉积物都显示出对Aβ特异的不同抗体的免疫反应性（图。​（图22 C类和D类和表​表1），1)，与AD患者大脑的结果相当（数据未显示）。值得注意的是，APP 22小鼠与末端特异性Aβ42抗体的免疫反应强度与高表达APP 23小鼠的切片相似，反映了717位突变对更具淀粉样蛋白生成能力的Aβ-（1-42）的产生的影响(12). AD中典型的斑块相关蛋白，如与Aβ结合的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和载脂蛋白E，也存在于大多数沉积物中（数据未显示）。雄性和雌性小鼠之间没有差异。

APP 22和APP 23小鼠的牙菌斑解剖差异。

直接比较时，APP 23小鼠沉积物中Aβ和硫酸乙酰肝素蛋白多糖特异性免疫染色的强度更强。与这一概念一致，APP 22小鼠的大多数沉积物是“弥散”型。新皮质和基底膜中刚果红阳性斑块相对较少（图。​（图22E类). 相比之下，APP 23小鼠的几乎所有细胞外沉积物都被甲胺银强烈染色，首次出现时已经显示出刚果红双折射（图。​（图22F类)显示致密的核心斑块。

APP转基因小鼠大脑的炎症反应。

除了Aβ沉积外，在这些小鼠中还发生类似AD的炎症过程。在这两种情况下，在有斑块的大脑区域都可以显示出大量的胶质细胞反应，这在APP 23小鼠中更为明显，因此与嗜软斑块的高负担相关。GFAP的免疫细胞化学（图。​（图3三A类)，磷酸酪氨酸（图。​（图3三C类)，MAC-1（图。​（图3三B类)、MHC II类和补体C3表明星形胶质细胞和小胶质细胞都有贡献。

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12个月大APP 23转基因小鼠炎症过程的特征。GFAP特异性抗体免疫染色(A类)表示星形胶质细胞肥大。用MAC-1抗体免疫染色可观察到活化的小胶质细胞(B类)和磷酸酪氨酸抗体(C类). 两种胶质细胞类型都与Aβ沉积密切相关。（巴=50μm）

在斑块附近观察到胆碱能纤维的神经炎性丢失和变形。

斑块周围是神经丝可见的营养不良神经炎（图。​（图44C类)、APP和突触素（数据未显示）免疫染色，仅在致密致密Aβ沉积物的外缘可见。在细胞密度高的区域，如海马锥体细胞，靠近aβ肽沉积的细胞体明显减少（图。​（图44D类). 虽然这可能只是细胞移位，但细胞内空间缺乏压缩表明斑块附近的神经元局部丢失。当乙酰胆碱酯酶染色时，观察到斑块的强烈标记和胆碱能纤维网络的局部畸变（图。​（图44A类). 乙酰胆碱酯酶活性遍及淀粉样斑块和斑块周边扩大的神经突起（图。​（图44A类).

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APP 23小鼠的退化过程。(A类和B类)12个月龄转基因小鼠和对照小鼠的乙酰胆碱酯酶染色。斑块附近胆碱能纤维的局部畸变(A类)与正常动物相比(B类)可以注意到。神经炎球体（箭头）用神经丝抗体NF200染色(C类). CA3区Aβ沉积附近锥体神经元的损失如图所示D类甲苯胺蓝染色。（棒材=50μm）

嗜软性斑块周围环绕着含有高磷酸化Tau的变形神经节。

当检测神经纤维病理学方面时，在两个品系的转基因小鼠大脑中都可以检测到超磷酸化微管相关蛋白tau。AT8抗体的免疫染色仅与APP 22和APP 23小鼠的刚果红阳性斑块相关。它突出了沉积物核心周围类似扭曲神经突的结构（图。​（图55 A类和B类). 与抗体PHF1、R27和R32（数据未显示）的反应类似，这些抗体识别tau的不同磷酸表位。有趣的是，Alz50抗体也显示出类似的染色模式（图。​（图55C类). 这些抗体不会对非转基因窝友对照组的切片进行染色。我们未能通过Gallyas方法检测到神经原纤维缠结。

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12个月大APP 23转基因小鼠大脑中tau的磷酸化。在自由漂浮切片（40μm）上用AT8抗体进行免疫细胞化学(A类和B类). 免疫染色显示类似扭曲神经突的纤维状结构。用Alz50抗体获得了定性相似的图案(C类). [棒材=100μm(A类)和10微米(B类和C类).] 

APP 23小鼠脑提取物中可生化检测到高磷酸化Tau。

6个月龄和15个月龄APP 23小鼠与AT8孵育后的脑提取物的免疫印迹也可以证明tau磷酸化增加（图。​（图66A类)和R27抗体（数据未显示）。与年龄匹配的室友对照组显示出较弱的免疫反应，且不随年龄增长而增加。当与磷酸化依赖性抗体tau7孵育时，转基因小鼠中未发现总tau蛋白上调（图。​（图66B类). 因此，tau磷酸化似乎与Aβ肽沉积平行发生。

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过度磷酸化tau蛋白的生化检测。APP 23小鼠、6个月龄（第2车道）和15个月龄的（第4车道）小鼠和室友对照组（第1车道和第3车道）小鼠脑提取物的免疫印迹如所示A类和B类.斑点用抗体AT8染色(A类)和tau7(B类). 数字表示标记蛋白的分子量（kDa）。

讨论

转基因技术在动物模型生成方面取得了最新进展，发展了AD病理学(20,21). 在这项研究中，我们描述了以神经元特异性方式过度表达人类APP和AD-连锁突变的转基因小鼠系。

携带瑞典双突变的人类APP的总表达增加到内源性APP的7倍以上，导致新皮质和海马中淀粉样斑块的早期形成，如APP 23线小鼠所示。奥运会报道了10倍以上的过度表达等。(20)，而萧和同事(21)描述转基因APP水平超过内源性APP 6倍。有趣的是，在每项研究中使用了不同的启动子结构、APP亚型和FAD突变。虽然在个别研究中很难比较转基因表达的量化，但很容易推测，FAD相关突变超过人类APP的特定阈值表达是斑块样病理学的触发因素。

我们的结果还表明，转基因小鼠中两种遗传损伤的组合导致AD斑块的发展，其表达水平显著降低。小鼠系APP 22过度表达APP 2倍与系APP 14的定量和空间表达相匹配(19). APP 14小鼠仅携带瑞典双突变，在2岁之前不会出现任何明显的病理变化。然而，APP 22小鼠表达人类APP与瑞典联合(8)和伦敦(9)突变，在18个月大时形成斑块。这些数据还表明aβ-（1-42）物种在给定表达水平上对AD病理学的发展有重要贡献。

有趣的是，APP 22小鼠中的大多数Aβ沉积为弥漫型，海马和新皮质中有少量嗜软斑块。相比之下，APP 23小鼠在第一次出现时就已经形成了几乎完全一致的斑块。这些结果可能难以与提议的假设相一致(1)弥散型沉积物是嗜软性神经炎斑块的前兆。因此，所述的两种小鼠系为研究这种拟议的斑块成熟过程提供了机会。

当检查其他特征时，两个品系的神经胶质反应都很明显。与AD一样，在整个大脑中都可以检测到增殖的星形胶质细胞，并在沉积物周围堆积(36). 还发现了磷酸酪氨酸、MAC-1、MHCⅡ类和补体C3免疫反应性。尽管被认为表明AD患者大脑中存在活化的小胶质细胞(37)这些标记的确切细胞起源需要进一步研究。这些小鼠提供了一个合适的模型来详细研究aβ形成后炎症过程的途径。

除了通过抗神经丝和抗APP免疫反应检测斑块周围的营养不良神经突外，还可以观察到胆碱能纤维的局部畸变。胆碱能神经突起变性以及胆碱酯酶活性与老年斑块的相关性是AD的另一个明确特征(6,7,38)这在转基因小鼠中复制，表明aβ沉积和胆碱能退化之间存在因果关系。

最重要的是，在两种转基因小鼠系中，仅与亲缘斑块相关的畸变神经突中都可以检测到过度磷酸化的tau，这两种转基因鼠系具有识别tau不同磷酸表位的抗体。据报道，在神经元原代培养中，纤维性而非无定形Aβ可诱导tau的过度磷酸化和微管结合的丧失(39). tau磷酸化的类似变化也被描述为AD患者神经原纤维变化的早期指标(40). Alz50抗体的免疫反应是τ相关病理学的进一步证据。该抗体最初被描述为识别AD特异性表位(35)现在被认为与tau的一个不连续表位发生反应，该表位是在与聚合相关的tau构象改变后形成的(41). 因此，尽管这些小鼠没有神经纤维缠结，但可能会出现神经纤维病理学。这一观点需要通过超微结构分析加以证实。APP转基因小鼠病理学超微结构的详细研究(20)然而，并没有提供成对螺旋丝的证据(42).

我们的两个转基因小鼠系形成了AD病理学的独特特征，并提供了系统研究Aβ肽在AD发病机制中的作用的模型系统。

致谢

H.van der Putten提供了小鼠Thy-1表达盒。M.J.获得了瑞士国家科学基金会的资助。

缩写

Aβ淀粉样β
AD公司阿尔茨海默病
应用程序淀粉样前体蛋白
时尚家族性AD
MHC公司主要组织相容性复合体
GFAP公司胶质纤维酸性蛋白

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