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美国人类遗传学杂志。2008年4月11日；82(4): 959–970.
2008年4月4日在线发布。 数字对象标识：10.1016/j.ajhg.2008.02.017
预防性维修识别码：PMC2427297型
PMID：18371931

肾胱氨酸-3功能的丧失可导致胚胎死亡、Meckel-Gruber样综合征、原位翻转和肾肝胰腺发育不良

卡斯滕·伯格曼,1,18,∗ 曼弗雷德·弗利盖夫,2,18 纳迪娜·奥尔蒂斯·布吕克勒,1 瓦莱斯卡·弗兰克,1 海克·奥尔布里奇,2 简·克什纳,2 伯恩哈德·舍尔默,三 英戈尔夫·施梅丁,三 安德烈亚斯·基斯佩特,4 贝蒂娜·克伦兹林,5 古德伦·纽恩堡,6,7 克里斯汀·贝克尔,6,7 蒂莫·格林,8 Gundula Girschick公司,9 萨利·林奇,10 彼得·科莱汉,11 扬·森德雷克,1 托马斯·纽豪斯,12 托马斯·斯塔尔马赫,13 汉斯沃尔特·曾格拉夫,14 彼得·纽恩伯格,6,15 诺伯特·格雷茨,5 塞西莉亚·罗,16 苏伦·连坎普,17 托比亚斯·施费尔,17 格德·沃尔兹,17 托马斯·本兴,三 克劳斯·泽雷斯,1和海穆特·奥姆兰2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

许多遗传病都与初级纤毛功能障碍有关，初级纤毛几乎无处不在，并作为孤立的细胞机械感觉细胞器发挥作用。纤毛相关疾病（纤毛病）的临床表现和受影响组织的列表很广，如肾结核，这归因于纤毛蛋白的广泛表达模式。然而，对于导致表型如此巨大多样性的分子机制知之甚少。我们最近报道了低形态NPHP3核电站儿童和年轻成人孤立性肾病和相关肝纤维化或绒毡层视网膜变性的突变。在这里，我们在小鼠和人类中选择了一种组合方法来定义NPHP3/NPHP3突变和肾胱氨酸-3蛋白的作用。我们证明了聚碳酸酯突变产生低形态Nphp3号机组导致囊性肾病表型的等位基因，而Nphp3号机组功能导致小鼠发生反转位、先天性心脏缺陷和胚胎致死。在人类身上，我们表明NPHP3核电站突变可引起广泛的早期胚胎形态缺陷临床谱，包括反转位、多指畸形、中枢神经系统畸形、结构性心脏缺陷、耳前瘘管以及广泛的先天性肾脏和泌尿道异常（CAKUT）。在功能水平上，我们表明肾胱氨酸-3直接与反转蛋白相互作用，并能抑制类反转蛋白典型Wnt信号传导，而肾胱胺酸-3缺乏导致非洲爪蟾典型的平面细胞极性缺陷，表明在规范和非规范（平面细胞极）Wnt信号的控制中起作用。

介绍

囊性肾病（CKD）是一组临床和遗传异质性疾病，可能在子宫内出现，也可能在成年后临床表现不明显。1最近的分子发现导致了新的治疗策略的发展，目前正在研究CKD肾功能衰竭的延缓。2有趣的是，CKD基因的大多数产物，也被称为胱蛋白，在由基底体和中心体组成的初级纤毛或纤毛基底部的不同亚细胞结构的多聚物复合体中共定位。1因此，“纤毛病”一词被提议包含这类疾病，纤毛功能障碍和常见的致病途径可能为纤毛病重叠表型提供了分子基础。3,4与这种对纤毛疾病的新理解一致，在患有广泛临床疾病的患者中发现了纤毛基因的突变，其中包括肾病综合征（NPHP[MIM256100])，Joubert（JS；[MIM213300])和Meckel-Gruber（MKS；[MIM249000])综合征。1,5–9

NPHP是一组异质性常染色体隐性遗传囊性肾病，是儿童和年轻人终末期肾衰竭最常见的遗传原因。1作为提议的睫状体网络的一部分，NPHP蛋白在初级纤毛、基底体和/或中心体中表达。1,10我们最近报道了NPHP3核电站负责青少年型肾病（MIM）604387).11在这些儿童和年轻人中，NPHP与称为老年-开放综合征（SLSN3；[MIM606995])和肝纤维化。我们进一步假设纯合子Nphp3号机组错义突变解释多囊肾病的表型(聚碳酸酯)鼠标。11,12

在这项研究中，我们定义了肾胱氨酸-3（NPHP3/NPHP3）在小鼠和人类发育中的关键作用Nphp3号机组靶向小鼠的基因功能Nphp3号机组基因。证明低形态的致病意义聚碳酸酯在该小鼠模型中，我们产生了囊性肾表型的复合突变Nphp3号机组pcy/ko动物。纯合子Nphp3号机组-不足(Nphp3号机组ko/ko)动物被用于测定肾胱氨酸-3在早期发育过程中的作用，并导致左右身体不对称、异向性和胚胎致死的随机性。根据我们对小鼠的观察，我们研究了NPHP3核电站用于人类先天性囊性肾病。我们在不同的患者中确定了广泛的致死和非致死表型NPHP3核电站突变。功能丧失突变要么是致命的，导致早期胚胎模式缺陷，如Meckel-Gruber-like综合征，要么导致严重的先天性囊性肾病。根据临床观察NPHP3/NPHP3突变可导致原位反转，我们研究了肾胱氨酸-3和反转蛋白是否直接相互作用，并确定肾胱胺酸-3在典型和非典型（平面细胞极性）Wnt信号传导中的作用。

材料和方法

患者和家属

根据亚琛大学机构伦理审查委员会和合作机构批准的方案，从患者和家庭成员那里获得了签署和知情同意书。在窝藏的家庭中NPHP3核电站突变、DNA样本可从所有父母、健康兄弟姐妹和所有受影响个体（F917家族中死于围产期的老年男性除外）中获得。

单倍型分析和全基因组SNP定位

在多重家族中F806（二级近亲父母）与MKS1-3型如前所述，通过单倍型分析排除。13随后，利用50K Affymetrix SNP阵列（Affymmetrix，加州圣克拉拉）和ALLEGRO程序进行全基因组SNP定位，假设常染色体隐性遗传，外显率完全，疾病等位基因频率为0.0001。

突变分析

NPHP3核电站通过对编码1330氨基酸（aa）肾胱氨酸-3蛋白（GenBank：NM_153240号,NP_694972号; 突变编号+1对应于ATG-translation-initiation密码子的A）。用与侧翼内含子序列互补的寡核苷酸引物通过聚合酶链反应（PCR）扩增受影响个体的基因组DNA(表S1在线提供）。通过变性高效液相色谱（DHPLC）或限制性消化分析测试的400条对照染色体中，所有检测到的剪接和错义突变均不存在。

逆转录聚合酶链反应

使用QIAmp RNA blood Mini Kit（德国希尔登QIAGEN）从F960家族所有成员的新鲜血液样本中提取RNA。相对数量NPHP3核电站如前所述，信使RNA（mRNA）通过逆转录酶（RT）-PCR和逆转录系统（德国曼海姆普罗米加）的使用进行测量。13对于每个反转录酶反应，我们使用500 ng总RNA。PCR产物的数量通过2%琼脂糖凝胶上的分馏和溴化乙锭荧光的测量进行量化。用QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN）对不同的PCR产物进行凝胶提取和纯化，最后按照前面所述进行测序。可根据要求提供引物序列和PCR条件。

的生成Nphp3号机组基因靶向突变小鼠

Nphp3号机组用替换型靶向载体在HM1 ES细胞中突变。用一个与小鼠129/Sv基因组DNA cosmid文库（从德国柏林RZPD德国基因组研究资源中心获得）的第1外显子对应的探针进行筛选Nphp3号机组一个基因组克隆包含整个Nphp3号机组位点（～46kb插入）被进一步表征并用于构建靶向载体。在两个同源区域（2.4 kb PstI片段和3.7 kb SacI片段）之间克隆了一个阳性选择盒。14该盒在所有三个框架中都包含终止密码子，一个独立的核糖体进入序列（IRES），其后是lacZ公司带有SV40多聚腺苷酸化信号的基因和新霉素磷酸转移酶基因。通过同源重组，IRES-LacZ-neo盒被插入Nphp3号机组，外显子4和5以及内含子3和4被替换(图S3). 这个Nphp3型ko等位基因被回交到C57BL/6背景。Nphp3号机组聚碳酸酯小鼠具有混合遗传背景（C57BL/6、KK/Upj-Ay/J和CD1）。

突变小鼠和胚胎的分析

小鼠和胚胎分别用从尾部活检或卵黄囊中提取的基因组DNA通过PCR进行基因分型。此外，通过western-blot分析证实了Nphp3缺乏表达(图S3). 分离成体组织和胚胎，并根据标准程序进行组织学分析（冷冻切片或石蜡包埋）。如前所述进行免疫荧光染色。10纤毛轴突用乙酰化α-微管蛋白抗体染色（德国陶夫基兴Sigma）。二级抗体（Alexa Fluor 488）来自分子探针（Invitrogen，Karlsruhe，德国）。细胞核用Hoechst33342（Sigma）染色。使用蔡司激光扫描显微镜（Axiovert 200 LSM510，德国耶拿卡尔蔡司）进行共焦成像。对于纤毛长度的测定，使用了LSM图像浏览器软件（Zeiss）覆盖模式下的测量和线条绘制工具。为了确定可能的显著性，进行了Student t检验。

协同免疫沉淀

共免疫沉淀实验按所述进行。15总之，HEK293T细胞通过磷酸钙法瞬时转染所示质粒。培养24小时后，将细胞清洗两次，并在1%Triton X-100裂解缓冲液中进行裂解。离心（15000×g，15 min，4°C）后，将含有等量总蛋白的细胞裂解液与抗FLAG（M2）琼脂糖珠在4°C下孵育约2小时。用裂解缓冲液广泛清洗珠，并用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离结合蛋白将斑点与相应抗体孵育后，通过增强化学发光进行可视化。实验重复四次，结果相同。

荧光素酶测定

如前所述进行荧光素酶分析。16简而言之，将HEK293T细胞接种到12孔板中，并瞬时转染TOPFlash或FOPFlash荧光素酶报告子构建物、β-半乳糖苷酶表达载体以及指导所需蛋白表达的载体，包括Dishevelled-1、NPHP2/INVS和NPHP3。报告者构建的TOPFlash和FOPFlash来自Upstate Biotechnology（纽约州普莱西德湖）和Millipore（德国施瓦尔巴赫）。DNA总量调整为10μg/孔。12小时后收集细胞，并在4°C的100μl报告裂解缓冲液（Applied Biosystems）中裂解10分钟。在离心裂解产物（13.500 rpm，5 min）以去除不溶物后，我们使用商业分析系统（Applied Biosystems）测定荧光素酶活性，并将其归一化为β-半乳糖苷酶活性，以校正转染效率。

非洲爪蟾胚胎操作

鸡蛋来自爪蟾雌性大鼠，注射600-800 U人类绒毛膜促性腺激素，体外受精，并在0.1×Marc改良的Ringer培养基中培养，如前所述。17根据Nieuwkoop和Faber确定胚胎期。18在四细胞期向两个背侧卵裂球注射mRNA或吗啉反义寡核苷酸NPHP3-MO（5′-TAACCAGAGAGGCTCCCACAT-3′）或标准对照吗啉（5′-GTGGACTACAGAATGCAAATGCAATATCAACAATTC-3′），每个胚胎8-32 ng（GeneTools）。用SalI线性化后，通过hNPHP3-pxT7的体外转录（mMessage-mMachine kit，Ambion），用T7 RNA聚合酶生成带帽合成RNA。为了追踪原肠胚形成期间的细胞运动，在64细胞期将荧光右旋糖酐（70kD）注射到一个背侧卵裂球中，并培养至原肠胚发育。使用徕卡MZ16F立体显微镜拍摄荧光和亮场图像。表型缺陷代表会聚延伸受损（ICE），评分如下：CEI 0（正常），无缺陷；CEI 1（轻度缺陷），与未注射胚胎相比，轴延伸减少不到25%，背部轻度弯曲；CEI 2（中度缺陷），轴伸长率降低25%-50%；CEI 3（严重缺陷），缩短50%以上，头部与尾部融合或神经皱褶开放。19所有实验都得到了动物委员会和德国巴登-符腾堡Regierungspräsidium Freiburg的批准。

结果

在一个患有Meckel-Gruber-like综合征的血缘土耳其多重家族（F806，LODmax 2.65的对数）中，我们将致病基因定位于染色体3q21.2-q22.3上的11.6 Mb区间(图S1). 该家族的两名受累女性患有肝胆管板畸形和多囊肾发育不良(图1)伴低血压血症与肾功能不全相符，与生活不相容。此外，其中一名女孩患有Dandy Walker畸形，另一名女孩患有主动脉瓣狭窄（更多详细信息，请参阅表1). 候选基因的测序NEK11号机组（MIM609779),CEP63公司(NM_025180)、和NPHP3核电站（MIM608002)位于最小临界区域，确定了一个纯合子必需NPHP3核电站影响内含子19（c.2694-12del）高度保守的典型受体剪接位点的剪接突变，内含子19与表型分离，预计会导致框架外转录物过早终止翻译(图2). 在一个非洲多基因家族（F888）中，我们还通过单倍型分析检测到NPHP3核电站这两名受累儿童的基因座，其表型包括与肾功能不全一致的多囊性肾肥大、少缺水、肝和胰腺多发性囊肿、导管板畸形、心脏结构缺陷、脉络丛囊肿和发育不良的颅盖骨，并伴有扩大的囟门(图1,表1). 两名男性均在出生后不久死亡。测序显示，该基因第11外显子的新纯合无义突变c.1729C→T（p.Arg577X）NPHP3核电站基因(图2).

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功能丧失患者的病理学表现NPHP3核电站突变

（A–D）888家族第二位受累患者的尸检结果。

（A） 多囊肾发育不良。较小的右肾因子宫内输尿管闭锁而肾盂扩张。左肾未闭，但输尿管变薄，排尿量减少。

（B） 高倍镜组织学检查（×20）显示肾囊肿大小和位置不同，间质纤维化与多囊性肾病一致。

（C） 先天性胰腺疾病，有越来越小的囊肿和纤维化。胰腺腺泡外观正常（×40）。

（D） 肝组织学显示胆管板畸形伴胆管增生和先天性肝纤维化（×40）。

（E） 806家系第一例患者肾脏横切面（×2.5）的低放大组织学检查，与多囊性发育异常肾病一致。

（F） 960家系先证者肾活检标本显示弥漫性肾小球肾炎（×40）。请注意囊肿内的肾小球结构。

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NPHP3核电站四个家族中的突变

上图显示了家族的谱系结构，下图显示了序列色谱图，说明了预测的NPHP3核电站所述家族中的功能丧失突变。突变与每个家族的疾病状态分离（P表示父亲遗传的等位基因；M表示母亲遗传的等位基因）。在纯合子突变的情况下，为了清晰起见，显示了父母之一的杂合子电泳图。

（A） 序列色谱图描述了内含子19剪接受体位点−1_2位置处典型受体剪接位点核苷酸的缺失，预测会导致框架外转录和提前终止。

（B） 左侧显示了917家族受影响个体的序列色谱仪，显示杂合子G→a交换，预测p.Arg973Gln氨基酸替换。右侧显示了预测终止密码子（p.Gln1114X）的杂合C→T交换。

（C） 序列色谱显示杂合C→T交换，可预测终止密码子（p.Arg577X）。

（D） 序列色谱图显示杂合子G→A在内含子13剪接供体位点+5位置的交换导致外显子13的跳跃和导致翻译提前终止的帧外转录(图S2).

表1

本研究中新患者的表型和基因型

家庭原产地NPHP3核电站突变病人年龄或死亡中枢神经系统肾脏肝脏胰腺心脏其他功能
806（C）土耳其c.2694-1_2删除（P）女性美国/TOP 23 gw，验尸Dandy-Walker畸形多囊肾发育不良、羊水过少导管板畸形尸检正常尸检正常网膜囊前部单个囊肿
c.2694-1_2删除（M）
806（C）土耳其c.2694-1_2删除（P）女性围产儿死亡、呼吸功能不全、肾肝活检未注明日期。多囊肾发育不良、羊水过少导管板畸形未注明日期。主动脉狭窄
c.2694-1_2删除（M）
888喀麦隆约1729C→T（p.Arg577X）（p）男性第49天死亡神经异常，肌肉张力增高，硬膜下小集合，右心室底部囊肿，双侧脉络丛囊肿多囊性肾发育不良肝囊肿未注明日期。房间隔缺损、持续性动脉导管未闭、右心室肥大
约1729C→T（p.Arg577X）（M）
888喀麦隆约1729C→T（p.Arg577X）（p）男性围产期死亡，尸检颅盖发育不良，囟门极度增大多囊性肾发育不良，羊水过多导管板畸形囊性胰腺PDA，瓣膜尖端结节性发育不良右输尿管闭锁，额头高，小而深，耳朵异常折叠，与典型的波特序列不同
约1729C→T（p.Arg577X）（M）
917瑞士c.2918G→A（p.Arg973Gln）（p）男性围产期死亡、呼吸功能不全、死亡未注明日期。多囊肾发育不良、羊水过少导管板畸形尸检正常尸检正常
c.3340C→T（p.Gln1114X）（M）
917瑞士c.2918G→A（p.Arg973Gln）（p）男性17年正常的神经和认知评估多囊肾胆管板畸形，胆汁性肝硬化回声增强正常14个月时出现肝脾肿大、终末期肾功能衰竭和腹膜透析、进行性肝硬化和肝功能衰竭、3岁时进行肝肾联合移植
c.3340C→T（p.Gln1114X）（M）
960越南c.1985+5G→A（P）女性8年正常的神经和认知评估肾小球囊性肾病肝病伴胆汁淤积、肝硬化和门脉高压胰腺淀粉酶持续升高，内分泌和外分泌功能正常正常3个月时全身倒置，双侧耳前瘘管，轴后多指左脚，双侧腹股沟疝，终末期肾衰竭和腹膜透析，4岁时进行肝肾联合移植
c.1985+5G→A（M）

GenBank（基因银行）NM_153240号; 核苷酸+1是ATG翻译起始密码子的A。使用以下缩写：父母血缘关系已知（C）、父亲遗传等位基因（P）、母亲遗传等位蛋白（M）、未确定（n.d.）、孕周（gw）、超声检查结果及随后终止妊娠（US/TOP）、先天性肝纤维化伴胆管增生（管板畸形）。

与此相反NPHP3核电站我们最近报道了与更长生存期明显不相容的空等位基因NPHP3核电站患有孤立性青少年肾病综合征和相关肝纤维化或视网膜变性的儿童和年轻人的突变。11为了进一步描述NPHP3核电站，我们对表型重叠的患者进行了序列分析，并在其他两个家族中发现了突变。先前详细描述了一个患有肾-肝-胰腺发育不良的非血源性瑞士多发性家族（F917）的临床数据(表1).20其父，在外显子20中，发现了新的错义突变c.2918G→A（p.Arg973Gln），该突变影响进化上高度保守的精氨酸残基，并且在400条控制染色体中不存在。母亲在外显子24中检测到新的无义突变c.3340C→T（p.Gln1114X）(图2). 在一个越南家系中，我们发现了新的纯合剪接突变c.1985+5G→a，该突变影响内含子13的供体剪接位点，并且在400条控制染色体中缺失(图2). RNA水平的实验证实了该剪接突变的致病性，该突变揭示了患者的帧外转录物(图S2). 这名8岁的前位者的表型特别令人感兴趣，因为她表现出广泛的早期胚胎模式/侧性缺陷，包括全反位和轴后多指畸形，以及鳃弓发育不良伴双侧耳前瘘管(表1). 此外，她出现早期肾功能衰竭，自出生后第三个月开始接受腹膜透析。由于肾-肝-胰腺发育不良，在4岁时进行了肾-肝联合移植(图2).

为了验证并进一步描述我们在男性身上获得的数据，我们生成了一个Nphp3号机组利用基因敲除技术检测零等位基因(图S3). 杂合小鼠没有表现出任何明显的形态缺陷或行为异常。繁殖和寿命也在正常范围内，因此排除了任何杂合子效应（最老的动物通过肉眼检查分析形态缺陷，通过冷冻切片苏木精-伊红（HE）染色分析囊性肾病，结果如下：21周，n=2；31周n=2；35周n=1；42周n=2）。这与我们在人类（受影响儿童的父母）中的数据一致NPHP3核电站杂合性均无异常。然后我们用我们的Nphp3号机组pcy/pcy携带低形态错义变异体I614S的小鼠可导致肾排斥性肾病表型。我们认为I614S变异体是一个低形态等位基因，因为小鼠的表型不如Nphp3缺陷小鼠严重。此外，我们通过western blot分析证明肾胱氨酸-3在Nphp3号机组pcy/pcy小鼠（数据未显示）。总共14个Nphp3号机组pcy/重量和14Nphp3号机组pcy/ko对小鼠进行分析（每组10只4周大的动物和4只12周大的动物）。与野生型相比，Nphp3号机组千/重量、和Nphp3号机组pcy/重量小鼠，全部14只（7只雌性，7只雄性）复合恒生动物(Nphp3号机组pcy/千)发育成囊性肾。这与我们的论点一致Nphp3号机组聚碳酸酯确实代表了一种低形态Nphp3号机组这些小鼠囊性肾表型的等位基因(图3). 早在出生后4周，这些动物的囊肿就很明显，囊肿的大小和数量随着年龄的增长而逐渐增加。我们没有比较两组囊性肾病表型的严重程度Nphp3号机组pcy/ko和Nphp3号机组pcy/pcy因为这两个等位基因不在相同的遗传背景下，所以不能排除疾病严重性的修饰效应。

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混合性子宫内膜囊肿性肾病Nphp3号机组pcy/ko小鼠和反转部位总数Nphp3号机组ko/ko胚胎

复合持久性Nphp3号机组pcy/ko小鼠（A-C）发展为囊性肾病，而对照组（数据未显示）和单等位基因Nphp3号机组pcy/ko（D–F）小鼠没有表现出明显的肾脏表型。冷冻肾切片的苏木精-伊红染色Nphp3型pcy/ko鼠标（A）和Nphp3号机组pcy/重量显示鼠标（D）。用乙酰化α-微管蛋白（绿色）抗体作为肾脏冷冻切片的纤毛标记物（细胞核，蓝色）进行免疫荧光染色Nphp3型pcy/ko小鼠（B）证明肾囊肿的上皮细胞携带的单眼纤毛比对照小鼠（E）的肾单眼纤毛虫长。（C） 和（F）表示（B）和（E）中所示图像的放大倍数较高。纯合子Nphp3号机组ko/ko胚胎（G-J）具有反转位置，并在胚胎发育过程中死亡。内倒位Nphp3号机组ko/ko胚胎由左侧尾巴弯曲（G）和心脏镜像排列（H）表示。组织学检查Nphp3号机组ko/ko胚胎证实右位心（I）和右侧胃的位置（J），与总反转位一致。杂合子的位置排列正常Nphp3号机组千/重量和对照胚胎（K–N）。

根据我们对患有NPHP3核电站等位基因为空，我们还假设纯合子小鼠中有更严重的表型Nphp3号机组功能丧失突变。来自11个杂合杂交的70只小鼠（32只雌性，38只雄性）的基因型分析Nphp3号机组重量/ko小鼠出生时，野生型（n=20；12只雌性，8只雄性）与杂合子（n=50；20只雌性，30只雄性）和纯合子同卵双胞胎的比率约为1:2:0，与胚胎致死率一致Nphp3号机组ko/ko老鼠。然后，我们分析了胚胎（n=308；来自39名怀孕女性的胚胎，通过杂交获得Nphp3型重量/千克小鼠），以确定致死时间点及其潜在原因。在E9.5–E12.5胚胎（n=221）中，我们发现大约17%（n=37）的所有分析样本存在左侧尾巴弯曲，这表明胚胎翻转可能是反转的或随机的Nphp3号机组-缺陷胚胎(图3). E9.5–E13.5胚胎的基因型分析（n=148；包括36Nphp3号机组重量/重量和83Nphp3号机组重量/ko胚胎）揭示了Nphp3号机组ko/ko胚胎（n=29）要么有孤立位置（n=8），要么有反转位置（n=15），要么位置安排不一致（n=6）。此外，由于宫内死亡和吸收或复杂的发育缺陷，一些胚胎无法评估。连续切片E11.5–E12.5的组织学染色比较Nphp3号机组ko/ko具有野生型和杂合子同窝卵的胚胎（n=17）证实了完全反转位（心脏右旋位和胃右旋位；n=7）、孤立位（n=5）和杂合位（n=5）以及复杂的心脏缺陷Nphp3号机组-缺陷胚胎(图3). 因此，我们的结果表明Nphp3号机组有规律地导致左右不对称和妊娠中期胚胎死亡的随机性，这可能是由相关的复杂心脏缺陷引起的。

NPHP3/NPHP3在从早期胚胎阶段到后期形态完整性的维持的整个发育过程中发挥着关键作用，这一点可以通过患有NPHP3核电站/Nphp3号机组突变。低形态的NPHP3核电站晚发性（青少年）肾病患者的等位基因导致肾脏萎缩，仅有少数囊肿局限于皮质髓质交界处。组织学上，出现肾小管扩张和萎缩、间质纤维化和肾小管基底膜改变。11,12在本研究中，我们有机会详细分析截断的影响NPHP3核电站肾脏形态学突变。令人惊讶的是，我们发现了一系列严重的先天性肾脏异常，包括肾小球肾炎(图1F） 多囊性肾变大伴早期胚胎性肾功能衰竭(图1B和1E）(表1). 组织学上，囊肿形态多样，位于肾单位的所有节段。根据早期胚胎发育不良，在我们的一名预测为纯合子的患者中观察到输尿管闭锁NPHP3核电站功能丧失突变。

我们先前报道的原位杂交分析与报道的疾病表型的广谱一致，显示了特异性Nphp3号机组在淋巴结、大脑、肾小管、胆道和肝脏的胚胎细胞中表达，这些细胞都携带单殖吸虫。11

研究囊肿是否在Nphp公司pcy/ko小鼠是由纤毛生成不足引起的，我们用针对乙酰化α-微管蛋白的抗体对12周龄对照和突变动物的肾脏进行了染色(图3). 高分辨率免疫荧光图像分析显示，正常和扩张肾小管上皮细胞中存在肾单丝蚴，从而排除了纤毛生成缺陷Nphp公司pcy/ko老鼠。有趣的是Nphp公司pcy/ko突变体动物（n=3）比单孢菌（n=86；平均长度1.62μm；SD 0.57）长Nphp公司pcy/重量对照小鼠（n=2）(图3p<0.005），这可能表明纤毛长度控制存在缺陷。

我们之前已经证明，肾胱氨酸（NPHP1）直接与反转蛋白（NPHP2）和肾胱蛋白3（NPHP3）相互作用。11,21NPHP蛋白肾胱氨酸和反转蛋白都被亚定位于纤毛和/或纤毛基底，10,21,22提示肾胱氨酸-3也有类似的定位。肾胱氨酸-3和反转蛋白之间密切的物理和功能相互关系也通过重叠患者和小鼠的疾病表型而得到提示NPHP3/NPHP3和投资/投资突变。21这两种表型的相似性变得更加明显发票和Nphp3号机组ko/ko小鼠会引起反转位点，这两种基因都会导致肝胰腺和肾脏疾病。为了研究反转蛋白和肾胱氨酸-3是否直接相互作用，我们在HEK293T细胞中共表达了不同截短的肾胱胺酸-3和表位标记的反转蛋白。V5-tagged inversin与肾胱氨酸-3共沉淀，但不与对照蛋白共沉淀(图4). 肾胱氨酸-3的截短可能将相互作用映射到aa 1至603（数据未显示）。

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肾胱氨酸-3与转化蛋白的相互作用

作为阴性对照，（A–C）V5标记的反转蛋白与N末端FLAG标记的全长肾胱氨酸-3（FLAG.NPHP3 FL）或FLAG标记CD2AP蛋白（FLAG.CD2AP）共表达。用V5抗体（A）进行免疫印迹，确认V5标记的反转蛋白在细胞裂解物中的表达。用FLAG抗体免疫沉淀后，用V5特异性抗血清（B）检测共沉淀V5标记的反转蛋白。作为对照，FLAG特异性抗体检测到沉淀的FLAG。反转和标记。CD2AP（C）。

（D–F）在反向实验中，V5标记的全长肾胱氨酸-3（V.5NPHP3 FL）与Flag标记的反转蛋白或Flag标记的CD2AP共表达。所有车道（B、C、E和F）中可见的额外约60kDa波段代表重链。在（E）中可见的100kDa条带是在（B）中长时间暴露后也出现的非特异性条带。

此外，反转蛋白和肾胱氨酸-3都能抑制Dishevelled-1诱导的典型Wnt-signaling活性(图5A） 并在HEK293T细胞中显示出协同作用。肾胱氨酸-3在吗啉寡核苷酸敲除后的变化非洲爪蟾胚胎与inversin基因敲除的胚胎相似。19我们通过追踪荧光标记的细胞克隆，观察到原肠胚形成期间有缺陷的形态发生细胞运动。这些细胞没有嵌入并汇聚到内侧中线，导致胃孔闭合严重延迟(图5B） ●●●●。低剂量（16 ng）时，神经折叠保持开放状态(图5C） 和缩短的躯干轴(图5D） 在后期以剂量依赖的方式观察到(图5E） ●●●●。通过过度表达人肾胱氨酸-3 RNA改善表型，证明了敲除的特异性(图5E） ●●●●。这些有缺陷的收敛延伸运动的标志性表型表明NPHP3在非经典PCP Wnt-pathway激活中起作用。

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Inversin和Nephrocysin-3抑制Dishevelled-1诱导的典型Wnt-信号活性

（A） inversin和NPHP3均抑制了Dvl1诱导的HEK293T细胞中TCF/LEF-1依赖荧光素酶报告结构（TOPFlash）的激活。两种NPHP蛋白的联合表达导致荧光素酶活性的进一步抑制。带有突变TCF/LEF-1结合位点的荧光素酶报告子构建物（FOPFlash）没有显示出显著的背景刺激。至少进行了四个独立实验，每个实验一式三份。分散诱导的刺激总是高于背景值的20倍。数据归一化为β-半乳糖苷酶表达。p值采用双尾Student t检验计算。

（B–E）原肠胚形成和神经形成期间的形态发生细胞运动在NPHP3基因敲除后出现缺陷非洲爪蟾并提示在PCP-Wnt途径中发挥作用。将吗啉反义寡核苷酸注射到两个背侧卵裂球（B）后，NPHP3被击倒后，胃运动被延迟。在64细胞期用荧光右旋糖酐标记细胞克隆，在12期用荧光显微镜观察细胞运动。上图和下图显示了原肠胚形成时相同胚胎的亮视场和荧光图像。在后期观察到神经折叠的不完全闭合（C）和体轴缩短和背侧弯曲的表型（D），这表明PCP/Wnt信号中断。这种表型具有剂量依赖性，并且可以通过共注射NPHP3-RNA（E）来部分挽救。用收敛延伸指数（CEI）对表型变化进行评分。

讨论

在本研究中，我们在患者和小鼠中选择了一种组合方法来定义NPHP3/NPHP3突变及其编码蛋白肾胱氨酸-3的作用。观察到的广泛表型表明，肾胱氨酸-3在从早期胚胎阶段到后期维持形态完整性的整个发育过程中具有显著的功能作用。令人印象深刻的是，广泛的肾和尿路异常，从肾萎缩伴间质纤维化和仅有极少数局限于皮质髓质交界处的囊肿，到肾小球囊肿性肾病和严重增大的多囊肾发育不良伴早期胚胎肾功能衰竭。后者的囊肿数量多，形态多样，位于肾单位的所有节段。此外，在一名携带纯合子的严重受累患者中还观察到输尿管闭锁NPHP3核电站无意义突变。先天性肾和尿路异常（CAKUT）与早期胚胎发育不良一致，表明看似无关的不同囊性肾表型可能由非常相似的分子机制引起。有趣的是，我们的一名早期肾功能衰竭、全倒位和轴后多指畸形患者进一步表现为双侧耳前瘘管，因此其表型与鳃弓（BOR）综合征重叠，该综合征可能将纤毛病与鳃拱发育不良联系在一起。

这个聚碳酸酯小鼠已被用于囊性肾病的新型治疗策略。然而，到目前为止聚碳酸酯错义变异体I614S仅被推测为导致这些小鼠肾病表型的原因。我们的实验装置并没有完全排除双基因疾病机制的可能性，假设第二个基因与Nphp3号机组基因位点在Nphp3号机组聚碳酸酯老鼠。然而，我们在复合杂合子中获得的数据Nphp3号机组ko/pcy公司与解释一致，即聚碳酸酯突变确实产生了一个负责囊性肾病表型的低形态等位基因。这些发现对肾结石和其他睫状体病患者的未来治疗方法具有重要的临床意义，因为一些药理学介入研究已经证明，肾表型在肾结石和睫状体疾病患者中的表达与临床表现密切相关聚碳酸酯小鼠可以得到显著改善。23

与携带低形态pcy等位基因的小鼠相比，Nphp3号机组具有完全丧失功能等位基因的小鼠表现为原位反转、先天性心脏缺陷和胚胎致死。基于突变类型的基因型-表型相关性先前已被描述为tg737型和Rpgrip1升(Ftm公司)突变小鼠。Tg737型小鼠鞭毛内转运蛋白IFT88（polaris）发生突变，该蛋白对颅内贩运很重要。24,25 卢比1升/卢比1升最近被证明编码纤毛相关Hedgehog信号传导和发育过程所必需的基体蛋白，如左右不对称的建立以及神经管和四肢的模式。6,7,26根据我们的Nphp3号机组突变数据，低形态Tg737型和Rpgrip1升等位基因导致相似的、可行的表型，而预测的功能丧失突变导致在Nphp3号机组-缺乏动物。另一种类似的动物模型Nphp3号机组突变体和支持纤毛相关疾病的机制是办公室1-缺陷小鼠，由于缺乏初级纤毛的生成，表现出侧性缺陷和肾囊肿。27有趣的是，我们这里也报告了纤毛生成的缺陷。然而，它与缺乏纤毛生成不同，最好描述为纤毛长度控制缺陷(图3).

总的来说，我们的突变发现增加了越来越多的证据表明，睫状体基因/蛋白质显示出多效性效应，相关疾病和看似无关的临床实体之间存在表型重叠。三然而，这仍然是一个有争议的问题，人们对同一基因中可比较甚至相同的突变如何导致截然不同的表型还知之甚少。28–30考虑到胱蛋白的假定网络，声称蛋白质相互作用的修饰物和上位性效应是导致某些观察到的表型变异的原因可能是合理的。31最近，Badano等人。优雅地剖析了Bardet-Biedl综合征（BBS）的遗传基础，BBS是多效性和寡基因遗传的主要例子之一。32他们发现MGC1203/CCDC28B基因(NM_024296.3号)，编码一种与BBS蛋白共定位并相互作用的中心粒蛋白，为BBS提供上位性等位基因。最近还报道了肾结石可能的双基因和寡基因遗传的一些证据。33对于我们只有一个确定的患者，在其他可信的解释中（例如，在内含子序列变异或大缺失的情况下缺乏突变检测），双基因和寡基因遗传模式也是可以想象的NPHP3核电站突变。11其他睫状体基因的改变也可能是受影响兄弟姐妹中观察到的一些熟悉内表型变异的原因，这种变异在我们的家族中也存在。根据Tory等人。表明杂合子提供上位效应CEP290公司(NM_025114.3号)和空气处理接口1(NM_017651.3号)突变和变异可能有助于从非综合征性肾病到Joubert综合征表型的加重，并在有肾外特征的患者中出现NPHP1型突变。34解释多效性基因效应的机制的鉴定需要进一步的研究，但很可能会对疾病的发病机制提供有价值的见解，也可能为疾病表达的修饰提供一个通用的概念。

考虑到几乎所有的NPHP蛋白都在原发性纤毛、基底体和/或中心体中表达，现在人们普遍认为纤毛功能缺陷会导致肾病综合征的囊肿形成。1,10,21,22,35我们接下来的目的是更好地描述肾胱氨酸-3的功能作用。人类和小鼠的类似表型NPHP2/INVS公司(Nphp2/投资)或NPHP3核电站(Nphp3号机组)突变促使我们研究肾胱氨酸-3和反转素是否发挥类似的功能。根据这个概念/假设，我们证明了肾胱氨酸-3与反转蛋白的直接相互作用。对HEK细胞的研究证实，类肾胱氨酸转化酶可以抑制典型的Wnt-signaling途径。19此外非洲爪蟾随着肾胱氨酸-3的敲除，确定了有缺陷的收敛延伸表型，表明在非经典PCP Wnt-pathway激活中起作用。结合对典型Wnt信号传导的已证明作用，可以推测反转蛋白和肾胱氨酸-3在控制典型和非典型（平面细胞极性）Wnt信号之间的转换中的类似作用。19有趣的是，两种肾胱氨酸都增强了各自对典型Wnt信号的抑制活性。这一观察结果使我们相信，这两种蛋白质在调节典型和非典型Wnt信号时，并不相互作用于上游或下游，而是平行地聚合在同一下游靶点上(图5). Wnt信号改变不仅见于肾病相关疾病，也见于Bardet-Biedl综合征。36,37

在这项研究中，我们在患者和小鼠身上证明NPHP3/NPHP3突变导致了广泛的早期胚胎模式缺陷临床谱，包括反转位、多指畸形、中枢神经系统畸形、结构性心脏缺陷、耳前瘘管以及广泛的肾和尿路异常（CAKUT）。最后，NPHP3/NPHP3突变可导致孤立性肾结核、老年-莱肯综合征、肾-肝-胰腺发育不良、梅克尔-格鲁伯样综合征和胚胎致死。

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致谢

我们感谢患者及其家属参与这项研究，感谢E.Golz Staggemeyer、E.von Heel、E.Bünger、T.Knöbl Deledezma、C.Tessmer、S.Franz、U.Ackermann、C.Böhm、J.Kalnitski、C.Reinhardt、K.Sutter和C.Kopp提供的技术援助，感谢H.U.Völker和C.Monoranu提供的显微镜照片。我们感谢O.Strauch、N.Klemm、N.Störmer、D.Guhl、K.Thumm、J.Herbst、M.Bohrer、E.Klimczak、J.Christophel和V.Skude对动物的出色处理，以及R.Nitschke和S.Haxelmans对共焦成像的支持。这项工作得到了德国肾脏基金会（Deutsche Nierenstiftung）（C.B.）、亚琛大学莱茵-威斯特法理工学院（RWTH）医学院START项目（C.B..）和德国肾脏基金（K.Z.和C.B.，H.O.[SFB592]）的支持。

工具书类

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文章来自美国人类遗传学杂志由以下人员提供美国人类遗传学学会