生物化学杂志。2008年6月13日；283(24): 16283–16292.
O（运行）-GlcNAc调节FoxO激活以响应葡萄糖*S⃞
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迈克尔·霍斯利
‡生物化学系约翰霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩，邮编：21205§哈佛医学院细胞生物学系丹纳-法伯癌症研究所癌症生物学系，马萨诸塞州波士顿02115，以及¶化学和∥弗吉尼亚大学病理学系，弗吉尼亚州夏洛茨维尔22904
约瑟夫·罗杰斯
‡生物化学系约翰霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩，邮编：21205§哈佛医学院细胞生物学系丹纳-法伯癌症研究所癌症生物学系，马萨诸塞州波士顿02115，以及¶化学和∥弗吉尼亚大学病理学，弗吉尼亚州夏洛茨维尔22904
Namrata D.乌代希
‡生物化学系约翰霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩，邮编：21205§哈佛医学院细胞生物学系丹纳-法伯癌症研究所癌症生物学系，马萨诸塞州波士顿02115，以及¶化学和∥弗吉尼亚大学病理学，弗吉尼亚州夏洛茨维尔22904
蒂莫西·凯利
‡生物化学系约翰霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩，邮编：21205§哈佛医学院细胞生物学系丹纳-法伯癌症研究所癌症生物学系，马萨诸塞州波士顿02115，以及¶化学和∥弗吉尼亚大学病理学，弗吉尼亚州夏洛茨维尔22904
杰弗里·沙巴诺维茨
‡生物化学系约翰霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩，邮编：21205§哈佛医学院细胞生物学系丹纳-法伯癌症研究所癌症生物学系，马萨诸塞州波士顿市02115和¶化学和∥弗吉尼亚大学病理学，弗吉尼亚州夏洛茨维尔22904
唐纳德·亨特
‡生物化学系约翰霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩，邮编：21205§哈佛医学院细胞生物学系丹纳-法伯癌症研究所癌症生物学系，马萨诸塞州波士顿02115，以及¶化学和∥弗吉尼亚大学病理学，弗吉尼亚州夏洛茨维尔22904
Pere Puigserver公司
‡生物化学系约翰霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩，邮编：21205§哈佛医学院细胞生物学系丹纳-法伯癌症研究所癌症生物学系，马萨诸塞州波士顿02115，以及¶化学和∥弗吉尼亚大学病理学，弗吉尼亚州夏洛茨维尔22904
杰拉尔德·W·哈特
‡生物化学系约翰霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩，邮编：21205§哈佛医学院细胞生物学系丹纳-法伯癌症研究所癌症生物学系，马萨诸塞州波士顿02115，以及¶化学和∥弗吉尼亚大学病理学，弗吉尼亚州夏洛茨维尔22904
‡生物化学系约翰霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩，邮编：21205§哈佛医学院细胞生物学系Dana Farber癌症研究所癌症生物学系，马萨诸塞州波士顿02115，以及¶化学和∥弗吉尼亚大学病理学，弗吉尼亚州夏洛茨维尔22904
收到日期：2008年3月20日；2008年4月17日修订
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补充数据
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摘要
FoxO蛋白是营养平衡的关键转录调节因子和压力反应。转录因子FoxO1激活糖异生，包括磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶，也激活氧化应激反应酶过氧化氢酶和锰超氧化物歧化酶。荷尔蒙以及通过乙酰化、泛素化和磷酸化已经得到了很好的证实，但FoxO还没有在葡萄糖衍生的上下文O（运行）-链接的β-N个-乙酰葡萄糖胺(O（运行）-GlcNAc）修改。在这里，我们向大家展示O（运行）-糖尿病患者肝脏FoxO1上的GlcNAc增加。此外，O（运行）-GlcNAc调节FoxO1激活以响应葡萄糖，导致糖异生蛋白表达异常增加基因同时诱导编码酶的基因表达解毒活性氧。FoxO的GlcNAcylation提供了一种新的营养物质直接调控转录调节代谢的机制以及通过控制FoxO1活性的应激反应。
严格调节营养平衡，确保敏感人群的健康细胞和组织。对抗营养过剩会导致糖尿病，并导致神经系统、心脏、脉管系统和肾脏(1). 反应的关键分子调节营养和压力水平，包括叉头转录因子FoxO1（FKHR）2和翻译后修饰O（运行）-GlcNAc公司。
FoxO转录因子是广泛基因的重要调节因子表达程序，包括新陈代谢(例如糖异生，氨基酸分解代谢、糖酵解、磷酸戊糖分流和脂肪酸/甘油三酯/甾醇合成）(2)，细胞周期(三)，压力响应(4,5)和寿命秀丽隐杆线虫(6). 泛奎宁和乙酰化(7)是FoxO的翻译后调节器；然而，胰岛素的磷酸化作用信号通路是最具特征的信号转导通路对福克斯的冲击(8). 在胰岛素的存在，这一高度保守的途径导致核在蛋白激酶B（PKB）/AKT磷酸化中排除FoxO1。三个键已确定FoxO1的AKT磷酸化位点：苏氨酸24，丝氨酸256和丝氨酸319。FoxO1的同系物，包括FoxO3和FoxO4，含有保守的AKT磷酸化位点并受胰岛素调节以类似方式发出信号(9). FoxO的核排斥最终导致其泛素化和降解(10). 压力刺激也通过SIRT1脱乙酰化改变FoxO3的活化和周转(7).
高度丰富和动态的翻译后修饰，O（运行）-GlcNAc与应激反应、胰岛素信号、，营养感应、细胞周期进展、蛋白质周转、翻译和转录，以及其他生物过程(11,12).O（运行）-GlcNAc快速核蛋白和细胞质蛋白丝氨酸和苏氨酸残基的循环类似于磷酸化的方式。然而，与磷酸化不同添加O（运行）-GlcNAc由单个催化亚单位执行(O（运行）-GlcNAc转移酶；OGT），而不是数百个激酶和需要与接合器分子的相互作用才能对数百种细胞产生特异性靶蛋白的(11).O（运行）-GlcNAc起着营养传感器的作用，因为细胞内GlcNAcylation的供体糖浓度，UDP-GlcNAc，快速通过多种代谢途径对流量作出反应，OGT活性高度依赖于供体底物的浓度(13). 通量增加UDP-GlcNAc合成途径导致胰岛素抵抗（特征（II型糖尿病）周围组织(14). 在小鼠脂肪细胞中，升高的O（运行）-GlcNAc直接导致胰岛素抵抗2-脱氧葡萄糖摄取减少(15). OGT在中的过度表达转基因小鼠的肌肉或脂肪组织导致糖尿病(16). 然而，升高了O（运行）-GlcNAc似乎可以防止热休克(17). 在心里，O（运行）-GlcNAc对缺血应激有保护作用(18)，突出显示这种翻译后修改对应力响应的重要性。在哺乳动物和植物，OGT的缺失是致命的(19,20). 然而，在C、。
雅致发现OGT基因敲除改变了糖原温度敏感性海藻糖的储存和dauer形成daf-2型等位基因，表明OGT在胰岛素信号传导中的作用(21).
初步研究表明FoxO1被GlcNAcylated(22,23)；然而，详细机制见解及其与糖尿病的相关性尚未阐明。在这里，我们证明FoxO1在肝脏中被GlcNA酰化，并且这种修饰是糖尿病大鼠增加。此外，己糖生物合成途径用于感知葡萄糖水平并调节FoxO1转录激活通过关键氨基酸的GlcNAcylation与FoxO的复杂相互作用磷酸化。
实验程序
质粒-人FoxO1表达质粒来自Addgene公司。pGEX-4T3-GST-FKHR（Addgene质粒10706）用于在里面
体外分析。pcDNA-FLAG-FKHR（Addgene质粒13507）(24)和pcDNA3 FLAG FKHR AAA突变体（附加基因质粒13508）(24)用于细胞培养实验、荧光素酶测定和定点突变（QuikChange，Stratagene；PAGE纯化引物，Invitrogen）。pGEX-4T3-GST-FoxO3野生型（Addgene质粒1790）1–525aa（Addgene质粒10826）和pGEX-4T3-GST-FoxO3 1–525aa TM8351（Addgene质粒8351）(25)用于在里面体外分析。
腺病毒感染-腺苷-OGT(26)在24小时无血清DMEM中100的多重感染循环重组酶和GFP腺病毒购自美国贝勒学院医学媒介发展实验室(矢量.bcm.tmc.edu).Adeno-FLAG-FoxO1、Adeno-FLAG-3A-FoxO1（T24A/S256A/S319A），以及如前所述使用aden-FLAG-HA-PGC-1(27).OGT公司–/弗洛克斯小鼠胚胎成纤维细胞(19,28)被感染了在收获前3天使用aden-CRE或aden-GFP。
细胞培养和治疗-Fao大鼠肝癌细胞在Coon改良的Ham’s F-12培养基中培养（2 g/升葡萄糖；Sigma）补充5%胎牛血清。在DMEM中培养MEFs（1g/L葡萄糖）补充10%胎牛血清。细胞经过处理100μ米
O（运行）-（2-乙酰氨基-2-脱氧-d日-葡萄糖吡喃烷）氨基-N-苯氨基甲酸酯（PUGNAc；多伦多研究化学品公司）过夜。这个用1、5或25m米葡萄糖或25m米葡萄糖+10米米无血清DMEM中的葡萄糖胺过夜。胰岛素在指定浓度下使用1小时。
转录激活分析-FoxO1转录使用荧光素酶报告子构建pGL3启动子来测量激活，Promega）包含来自IGFBP的FoxO1结合位点的三个副本发起人(29). 10 ng/井FoxO1报告子构建以及10 ng/孔的β-半乳糖苷酶对照构建物在24孔培养皿中转染到HEK293细胞Lipofectamine 2000（Invitrogen）。p Shuttle-OGT以100 ng/井的速度使用。这个细胞在无血清DMEM（Invitrogen）中转染4h。培养基是然后用含有不同量葡萄糖和隔夜孵化。发光归一化为β-半乳糖苷酶活动。
基因表达分析-使用TRIzol收集RNA使用Super Script II反向转录（Invitrogen）和cDNA（Invitrogen）。使用SYBR对Stratagene MX3000进行实时PCR混合（Invitrogen）。数据归一化为18 S rRNA。
免疫印迹分析—O（运行）-测定GlcNAc水平通过免疫沉淀和测量与反-O（运行）-GlcNAc抗体CTD110.6(30)（Covance）或GlcNAc-结合凝集素琥珀酰化小麦胚芽凝集素(31)（安永实验室）。FoxO1是使用FKHR抗体进行免疫沉淀（细胞信号编号9462）。福克斯O1用抗FKHR（Santa Cruz sc-11350）和抗FoxO1进行印迹磷酸丝氨酸256（Santa Cruz sc-22158）。
蛋白质相互作用分析-协同免疫沉淀分析对感染Ad-FLAG-HA-PGC-1a的Fao细胞的裂解物进行检测。将抗-FLAG琼脂糖（Sigma）或抗OGT（AL28）涂敷于含1%Nonide P-40的三缓冲盐水。清洗免疫沉淀物三次，SDS-PAGE凝胶电泳分离，用抗HA或抗OGT（DM-17；Sigma）。
UDP GlcNAc测定-UDP-GlcNAc水平通过毛细管区带电泳(32).
OGT和激酶分析-重组AKT来自细胞信号（7500）。在室温下将GST-FoxO1标记在珠子上1小时在200μ米制造商指示的ATP。表达重组OGT的质粒是苏珊娜·沃克送给我们的礼物(33). AKT后的OGT分析在室温下于50℃下对珠状FoxO1进行2小时的标记米米Tris，pH值7.5。1μ米UDP-GlcNAc公司。0.25μCi[三H] UDP-GlcNAc（美国放射性标记化学品）被添加到反应并在室温下培养1h。珠子当时是通过闪烁计数或SDS-PAGE和放射自显影。
预计离港时间（MS/MS）-GST-FoxO1与谷胱甘肽结合珠结合（Amersham Biosciences）用二硫苏糖醇（Amersham生物科学）和碘乙酰胺（Sigma-Aldrich）在室温下前面描述的(34). 这个蛋白结合珠被两种内蛋白酶酶消化LysC（罗氏应用科学）或内蛋白酶AspN（罗氏实用科学）100m酶底物比1:20米铵碳酸氢盐，pH 8，在室温下振荡6.5小时。上清液含有产生的蛋白水解肽的蛋白质被从纺纱机中去除用冰醋酸（Sigma-Aldrich）酸化至pH 3.5。
将消化样品中的一份上清液装入聚酰亚胺涂层熔融石英毛细管反相预柱（360-μm外径×75-μm内径；Polymicro Technologies）包装C18树脂（直径5–20μm，孔径120μm；YMC公司）用0.1%乙酸脱盐。预柱与毛细管相连分析柱（360-μm外径×50-μm内径）用C18树脂（直径5μm，孔径120μm；YMC公司）和如参考文献。35.洗脱肽以60 nl/min的流速进入质谱仪，梯度为60分钟内为0–60%B，5分钟内为60–100%B（A=0.1米乙酸，B=70%乙腈，0.1米乙酸）使用1100系列二元高压液相色谱法（安捷伦科技）(35).
样品的等分样品在热电子LTQ-Orbitrap质量上进行分析光谱仪（Thermo Fisher Scientific）。使用Orbitrap分析仪的分辨率为30000（米/z400). 获得了碰撞活化解离串联质谱与四极线性离子阱分析仪相关的数据。预计离港时间（MS/MS）光谱是在修改过的Finnigan LTQ（Thermo Fisher Scientific）上获得的用化学电离源产生荧蒽自由基的房子通过ETD分解的阴离子（45毫秒ETD反应）(36). 靶向ETD MS/MS为在第二个Finnigan LTQ（Thermo Fisher Scientific）上收购Thermo Fisher ETD原型升级（ETD反应100毫秒，ETD AGC目标试剂离子1E5）。所有数据都是人工解释的。
半乳糖标记分析—O（运行）-GlcNAc水平为测量单位：[三H] GlcNAc的UDP半乳糖标记(37). FoxO1是使用冷标记抗体进行免疫沉淀（细胞信号技术）取0.1g肝，在10ml放射免疫沉淀分析缓冲液中溶解。然后过夜标记免疫沉淀物，用SDS-PAGE分离考马斯G-250染色。脱训练后，用英语三Hance（PerkinElmer Life Sciences）并接触放射自显影术电影。
动物实验-雄性Sprague-Dawley大鼠（～16周老年人）单次注射链脲佐菌素（50毫克STZ/kg体重体重）引起高血糖。2周后处死动物，收获了肝脏。控制动物单独接受载具。
对于OGT过度表达研究，八只9周龄雄性balb/c小鼠（Taconic）注射8.0×108腺-OGT或腺-GFP病毒粒子。基因表达经36B4校正并归一化为GFP。
结果
糖尿病患者FoxO1-GlcNAcylation升高-考虑到福克斯O1是一种转录因子，控制新陈代谢和应激的许多方面肝脏和O（运行）-GlcNAc起着营养传感器的作用，我们测试了FoxO1是否O（运行）-GlcNAc在肝脏中被修饰。显示FLAG-taggedFao大鼠肝癌细胞中表达的FoxO1使用反-O（运行）-GlcNAc抗体、CTD110.6和末端GlcNAc-特异性凝集素，琥珀酸化小麦胚芽凝集素(). 特异性得到了GlcNAc竞赛的确认O（运行）-GlcNAc水平用O（运行）-GlcNAcase抑制剂，PUGNAc公司。来自大鼠肝脏的内源性FoxO1免疫沉淀显示为O（运行）-使用末端GlcNAc-特异性修饰GlcNAc半乳糖基转移酶探针() (37).接下来我们询问FoxO1的GlcNAcylation是否受到高血糖的调节在糖尿病模型中。使用O（运行）-GlcNAc特异性抗体（CTD110.6），我们发现STZ诱导的糖尿病大鼠肝脏FoxO1重GlcNAcylated(和补充图S1）。抗体减少游离GlcNAc的反应性进一步证明了抗体的特异性。捐赠者用于GlcNA酰化的糖是UDP-GlcNAc，是己糖胺的产物生物合成途径（HBP）。葡萄糖升高可增加通过HBP的流量导致UDP-GlcNAc增加(14)，OGT活动依赖于(13). 我们因此，在对照组和STZ糖尿病大鼠中测量了UDP-GlcNAc水平肝脏中发现糖核苷酸增加(; 55.5± 2.5与88.6±12.3 pmol/mg肝脏，第页<0.05（学生）t吨测试）。这些数据表明HBP可能作为通过调节OGT活性来调节转录因子的营养传感器，例如FoxO1。STZ糖尿病大鼠的FoxO1瞄准了Pepck和G6pc，与之前的报告一致()(38). 此外，我们测量了高脂肪饮食糖尿病小鼠FoxO1a的GlcNAcylation，发现与STZ诱导的糖尿病大鼠相似的增加().
FoxO1是O（运行）-GlcNA酰化。 A类，Fao细胞感染Ad-FLAG-OxO1。FLAG-FoxO1免疫沉淀(IP（IP）)并且被弄脏了(IB公司)与抗O-GlcNAc抗体CTD110.6或末端GlcNAc-结合凝集素琥珀酰化小麦胚芽凝集素。特异性经GlcNAc竞争和抗体或凝集素增加证实处理后的反应性O（运行）-GlcNA酶抑制剂PUGNAc。B类，放射自显影显示内源性FoxO1免疫沉淀自大鼠肝脏并标记有[三H] UDP-半乳糖使用GlcNAc特异性半乳糖基转移酶。英国标准协会，牛血清白蛋白。
O（运行）-糖尿病患者FoxO1的GlcNAcylation升高。
A类，FoxO1从对照组和STZ诱导的糖尿病中免疫沉淀大鼠肝脏，用抗O-GlcNAc抗体（CTD110.6）进行印迹。特异性经GlcNAc竞赛确认。B类，UDP-GlcNAc水平为用毛细管法测定对照组和STZ诱导的糖尿病大鼠肝脏电泳(年轴）并根据密度测定法绘制分析来自C类(x个轴）。C类，RT-PCR分析佩普克和G6个表达显示mRNA表达升高STZ诱导的糖尿病。这个短跑表示平均值。D类，FoxO1是从对照组和高脂肪饮食小鼠中免疫沉淀的并用抗O-GlcNAc抗体（CTD110.6）进行印迹。密度测定分析显示FoxO1的GlcNAcylation升高。IB公司，免疫印迹。
FoxO转录因子整合营养和激素问询处-为了证实高血糖升高FoxO1，我们采用了肝癌细胞培养模型。说明了这一点在增加葡萄糖浓度的情况下培养Fao肝细胞导致剂量依赖性增加O（运行）-检测到的FLAG-FoxO1上的GlcNAc水平通过CTD110.6抗体。有趣的是，添加100 n米胰岛素1小时下调O（运行）-GlcNAc专门针对FoxO1，但确实不减少总细胞数O（运行）-GlcNAc水平()或更改O（运行）-GlcNAcase活性(). 我们接下来分析了O（运行）-胰岛素敏感性突变体FoxO1的GlcNAc水平（T24A、S256A、S319A，称为“3A”）。AKT磷酸化缺乏站点的结果要高得多O（运行）-GlcNAc水平(). 进一步解决两者之间的相互作用O（运行）-GlcNAc和O（运行）-磷酸盐，我们雇佣在体外OGT和AKT分析。体外GlcNA酰化GST-FoxO1对随后的在体外AKT磷酸化在Ser256(). 此外，在体外AKT磷酸化GST-FoxO1未影响后续在体外GlcNA酰化()，建议这些网站不是直接互惠的。测试GlcNAcylation和磷酸化在功能上是相互作用的，我们检测了高糖或PUGNAc（O（运行）-GlcNAcase抑制剂）改变FoxO定位。法奥具有基础AKT活性的细胞，尽管血清饥饿，其大多数FoxO1定位于细胞质中。FoxO不易位到细胞核增加25m米葡萄糖或PUGNAc治疗，而10μ米LY294002（PI3K抑制剂）确实会引起易位。符合，AKT介导的磷酸化似乎是在FoxO方面，GlcNAcylation占主导地位。另一个GST标记的FoxO亚型FoxO3（FKHRL1）也是一种在体外OGT目标(). A截断FoxO3（氨基酸1–525）的含量较少O（运行）-GlcNAc，显示在氨基酸526和673之间发现了一些位点。缺少的突变体三个AKT磷酸化位点（T32A、S253A、S315A，称为“TM”）标记为与包含羟基氨基酸，与AKT磷酸化的模型一致与GlcNAcylation不直接相互作用。
胰岛素可降低高糖升高的FoxO1-GlcNAcylation。
A类，FLAG-FoxO1免疫沉淀(IP（IP）)来自Fao细胞用胰岛素治疗1小时后，Western检测到GlcNAcylation使用CTD110.6抗体进行印迹。血糖升高，而胰岛素减少，FoxO1-GlcNAcylation。B类，胰岛素治疗不会减少Fao细胞中的总细胞GlcNAcylation。C类，胰岛素治疗可以不改变O（运行）-Fao细胞中的GlcNAcase活性。IB公司,免疫印迹法。
磷酸化和GlcNA酰化之间存在复杂的相互作用福克斯O1。 A类，AKT不敏感和组成核FoxO1突变体（T24A，S256A，S319A，称为3A）在Fao细胞中是高度GlcNAcylated的。B类，重组FoxO1为在体外然后进行GlcNAcylated随后在体外标记AKT，进行SDS-PAGE，并进行吸墨汁染色带有抗FoxO1 Ser（P）256，剥去，然后用抗O-GlcNAc抗体（CTD110.6）。Ser（P）的特异性256经碱性磷酸酶处理证实抗体阳性。C类,重组FoxO1在体外AKT磷酸化，然后体外O-标记GlcNAc，进行SDS-PAGE，并用抗O-GlcNAc抗体（CTD110.6），剥离，然后用抗FoxO1 Ser（P）256抗体。的特异性序号（P）256经碱性磷酸酶处理证实抗体阳性。体外AKT磷酸化不阻断在体外OGT公司FoxO1的标签。D类，Fao细胞感染了腺病毒表达FLAG标记的FoxO1。感染细胞24小时后血清饥饿RPMI+0.5%牛血清白蛋白4小时，然后按照指示进行治疗在RPMI+0.5%牛血清白蛋白中增加16小时。FoxO1被可视化使用抗FoxO1抗体。PUGNAc（一种O（运行）-GlcNAcase抑制剂）或25米米葡萄糖不会导致FoxO1核移位增加在测试条件下。E类，FoxO3亚型是在体外OGT基板。[三H] UDP-GlcNAc掺入通过考马斯G250染色后的放射自显影。截短的（氨基酸1–525）表格中包含的标签明显较少，表明大量的位点位于C末端区域。突变体FoxO3缺乏AKT磷酸化位点（T24A、S215A、S316A或“三重突变体”或TM）合并[三H] UDP-GlcNAc类似于截断形式，表明AKT磷酸化位点不是明显地体外O-GlcNAc标记。IB公司免疫印迹；重量，野生型。
O-GlcNAc调节FoxO1活性-调查O（运行）-FoxO1上的GlcNAc，我们首先询问葡萄糖是否可以激活FoxO1依赖性转录。HEK293细胞荧光素酶报告基因检测()演示在25米内隔夜孵化米葡萄糖增加FoxO1交易激活。免疫印迹显示FoxO1蛋白水平没有随着葡萄糖的增加而增加。AKT不敏感的FoxO1突变体也是由不依赖胰岛素信号的葡萄糖激活。为了进一步证明己糖生物合成途径可以通过一种机制调节FoxO1这与核定位不同，我们测试了FoxO1 3A的活化同时阻断UDP-GlcNAc合成中的速率限制步骤()使用谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶抑制剂，6-重氮-5-氧代诺留烯（DON）。DON将FoxO1激活减弱25米米葡萄糖()而添加葡萄糖胺谷氨酰胺之后的UDP-GlcNAc合成途径：果糖-6-磷酸酰胺转移酶，恢复FoxO1的激活，表明组成型核FoxO1被激活O（运行）-GlcNAc公司。添加葡萄糖胺向Fao细胞的培养基中添加FoxO1O（运行）-GlcNAc水平，而DON治疗可降低FoxO1糖基化(). 过表达OGT增强葡萄糖诱导的FoxO1转录激活()和GlcNAcylation().
O（运行）-GlcNAc增加FoxO-依赖荧光素酶报告子通过HBP在HEK293细胞中转录。 A类，萤光素酶报告基因两种野生型的活性都因高糖而增加(重量)和3AFoxO1（所有面板绘制为相对荧光素酶活性归一化为β-半乳糖苷酶活性；误差线指示标准误差；*,第页<0.05（学生）t吨测试）。FoxO1蛋白水平不受影响。B类，UDP-GlcNAc合成途径示意图进入细胞的2-5%葡萄糖用于生产供体糖核苷酸。C类，添加50μ米大学教师，抑制UDP-GlcNAc合成中的速率限制酶（谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶，GFAT公司)，降低高葡萄糖激活荧光素酶活性。10米米氨基葡萄糖(GlcN公司)挽救FoxO1的激活。D、 O（运行）-GlcNAc水平用10μm处理后Fao细胞中的FLAG-FoxO1米氨基葡萄糖和50μ米大学教师。E类，OGT过度表达增加FoxO依赖性萤光素酶活性。如果，OGT过度表达增加FoxO-GlcNAcylation。CTD110.6抗体用于检测FLAG沉淀FoxO1。IP（IP）免疫沉淀；IB公司,免疫印迹法。
通过O（运行）-FoxO1上的GlcNAc靶基因，我们对Fao肝癌分离的mRNA进行RT-PCR分析在1米、5米或25米培养过夜的细胞米葡萄糖。mRNA水平过夜后，Pepck和G6pc呈剂量依赖性升高葡萄糖处理(). 接下来我们问其他FoxO1靶基因是否也升高，特别是那些参与氧化应激反应的，并发现过氧化氢酶和MnSOD表达增加(). 本RT-PCR用Ad-GFP或表达显性阴性FoxO1突变体（Δ256）(39). Ad-FoxO1Δ256感染细胞对葡萄糖无反应，表明葡萄糖传感是特异性增强FoxO1依赖性转录的糖异生和应激反应基因。为了确认过氧化氢酶和MnSOD的表达需要OGT，我们使用了具有loxP的MEFOGT基因侧翼的重组位点(19). mRNA表达高糖培养不会增加应激反应基因细胞被表达Cre的腺病毒感染的条件重组酶与腺-GFP对照相比可降低OGT(). 减少的25米处的信使核糖核酸表达米葡萄糖样本可能是由于对基础转录机制的影响(40,41). 此外，OGT发现Fao细胞中的过表达（通过腺病毒）增加了Pepck和G6pc表达与GFP对照组比较().
葡萄糖激活OGT依赖的FoxO1靶基因的表达方式。 A类，RT-PCR分析显示葡萄糖异生酶表达(G6个和佩普克)Fao肝癌中葡萄糖升高细胞（所有面板均相对表达标准化为18S rRNA误差条表示标准误差；*，第页<0.05和**，第页<0.005（按学生）t吨测试）。B类，RT-PCR分析显示活性氧解毒酶的表达(过氧化氢酶，MnSOD)被葡萄糖升高。感染表达显性阴性FoxO1（Δ256）的腺病毒可阻止高糖激活靶基因。C类，RT-PCR分析OGT公司–/弗洛克斯MEF显示OGT对高糖是必需的过氧化氢酶和MnSOD的活化。D类Fao细胞的RT-PCR分析OGT过度表达后显示Pepck和G6pc升高。E类，RT-PCR注射腺-OGT或GFP病毒7天后的小鼠肝脏分析。如果，重组GlcNAcylated电泳迁移率变化分析或裸GST-FoxO1和IRE-荧光素酶报告子的300碱基对片段质粒（用于)以及用溴化乙锭可视化。G公司，电泳迁移率偏移化验，如如果2μg GST+6μg OGT，2μgFoxO1或2μg FoxO1+6μg OGT。
为了测试OGT如何影响动物的基因表达，我们用腺OGT病毒和从肝脏。显示那个佩普克和G6个表达增加了～50%与腺性生长因子感染的对照小鼠相比考克斯7a1没有变化显著。这些数据与以前的报告一致(42)，建议，在对葡萄糖、FoxO1和O（运行）-GlcNAc参与了该能力调节糖异生和应激反应的转录基因。
为了更好地理解O（运行）-我们研究了GlcNAc调节FoxO1该转录因子的DNA结合特性。使用荧光素酶报告载体的FoxO-结合部分用于，我们表演了重组FoxO1的电泳迁移率变化分析。在以下方面没有差异裸鼠或GlcNAc-FoxO1之间以及FoxO和FoxO之间均发现DNA结合与OGT一起孵化(). 这些结果表明，除核定位或DNA结合，如转录招募通过葡萄糖介导FoxO1的活化。
鉴定人FoxO1中131个丝氨酸和苏氨酸残基中的哪一个可能是O（运行）-GlcNAcylated，我们使用了一种相对较新的技术，ETDMS/MSO（运行）-GlcNAc改性在常规情况下丢失，碰撞活化解离质谱法，但保留ETD(43). 因此，我们能够确定FoxO1残基Ser550、Thr648,序号654，以及Thr317或序列号318是GlcNA酰化(和补充图S3）。然后我们对其中几个位点进行了突变并进行了测试它们是否在荧光素酶报告基因测定中被葡萄糖激活。苏氨酸317突变为丙氨酸降低了转录激活高糖，而丝氨酸318突变没有影响(). 在在测试条件下，其他已鉴定位点的突变对FoxO1荧光素酶报告分析（补充图S4）。蛋白质印迹分析显示减少O（运行）-T317A突变体上的GlcNAc与野生型在25m内过夜培养后米葡萄糖().
FoxO1在多个位点被GlcNA酰化。 A类，示意图指示四个O（运行）-使用ETD MS/MS在人类FoxO1上绘制GlcNAc位点（阈值317，序列号550、Thr648、和序号656).B类，荧光素酶报告子分析的点突变FoxO1，表明Thr基因突变317丙氨酸减少活化25 m米葡萄糖（表示为相对活性归一化为β-半乳糖苷酶；误差线代表标准错误；*，第页<0.05（学生）t吨测试）。C类,用FLAG-FoxO1载体转染HEK293细胞，该载体含有进行SDS-PAGE并使用抗O-GlcNAc进行印迹的位点突变抗体（CTD110.6）。IP（IP）免疫沉淀；IB公司,免疫印迹。
讨论
高度丰富的翻译后修饰O（运行）-GlcNAc具有被提议作为营养传感器，因为供体糖UDP-GlcNAc接受来自多种代谢途径的输入，OGT活性取决于UDP-GlcNAc浓度(11).我们已经表明，高血糖升高了大鼠肝脏中的UDP-GlcNAc水平，导致FoxO1-GlcNAcylization增强并激活转录因子。早期工作表明O（运行）-GlcNAc富集于染色质(40)和处于活动状态多基因染色体中的基因转录位点。许多转录因子已被证明是GlcNAcylated的（审查见参考文献。12)和RNA聚合酶IIC-末端结构域以竞争方式被广泛GlcNAcylated磷酸化(41). 这个已经证明，修改通过潜在的改变稳定性、核定位、转录招募或DNA结合。对于Sp1，激活受以下因素调节O（运行）-GlcNAc和依赖于细胞类型或启动子通过DNA结合或其他机制(44,45). 另一种机制是哪一个O（运行）-GlcNAc通过细胞核调节转录因子本地化。胰腺神经D1在高浓度下转位到细胞核葡萄糖或抑制O（运行）-GlcNA酶(46). 然而，我们已经展示了组成性核突变体FoxO1（3A）也受葡萄糖调节通过己糖生物合成途径()，表明此外，还存在核内交易激活机制。这是可能的该机制涉及FoxO上游调节器的GlcNAcylation因为AKT和胰岛素受体底物1也被GlcNA酰化(47). 这个机制是然而，不太可能，因为一种非常特殊的羟基氨基酸的突变（阈值317但不是Ser318)我们已经证明了这一点GlcNAcylated可减少高血糖对FoxO1的刺激。事实上FoxO1蛋白的稳态水平在高糖条件下没有变化反对蛋白酶体对FoxO的调节FoxO无处不在(48)以及蛋白酶体功能被抑制O（运行）-GlcNAc公司(49). 另一种可能机制O（运行）-FoxO1的GlcNAc激活是通过介导招募基础转录因子，其中许多也是GlcNA酰化(50).Sp1反式激活域的GlcNAcylation抑制相互作用具有TATA结合相关因子（TAF110）(51).
丝氨酸和苏氨酸残基的GlcNA酰化也被发现发生在磷酸化位点导致了“阴阳”假说哪里O（运行）-GlcNAc部分可能直接反对O（运行）-磷酸盐。我们现在知道这个模型过于简单。当三个AKTFoxO1的磷酸化位点发生突变O（运行）-GlcNAc水平被放大。福克斯O1O（运行）-高糖可升高GlcNAc水平随后可以通过用胰岛素处理细胞来减少。这些发现表明FoxO具有阴阳效应。然而，在体外标记实验表明磷酸化位点和GlcNAcylation不重叠。ETD MS/MS允许识别多个O（运行）-GlcNAc位点，其中一个与AKT磷酸化相邻现场。苏氨酸317突变降低FoxO中的高血糖激活荧光素酶分析，但确定其他位点的功能需要不同的分析和/或实验条件。如果GlcNAc站点也磷酸化，羟基氨基酸突变为丙氨酸将无法确定该突变的表型是否是由于缺乏磷酸化或GlcNA酰化。显而易见的是共享或不同站点的翻译后修改提供了细胞极大地扩展了分子多样性。
这种复杂的分子多样性可以使肝细胞感知和对多种刺激作出反应并对转录靶点的变化作出反应激活和特异性。这里我们显示葡萄糖上调mRNA的表达式佩普克和G6个通过增加FoxO1缺乏胰岛素。这可能会造成危险糖异生的正反馈回路，并证明糖异生(52)不是仅仅是胰岛素缺乏的影响，而是一种病理激活的途径(53). 有人问为什么，从进化的角度来看，一个有机体会上调吗高血糖条件下的葡萄糖生成(54)? 答案可能在于发现FoxO1的GlcNAcylation也激活活性氧物种解毒酶表达。鉴于葡萄糖代谢导致活性氧生成，直接控制这种应激的血糖反应途径对细胞有利。O（运行）-GlcNAc感官保护细胞免受压力(17,18,55)，可能通过激活保护基因的表达。因此，对病理学的调查作为药物靶点的糖异生激活也必须考虑增加氧化损伤是一种潜在的副作用。
除糖异生外，FoxO转录因子还调节细胞细胞周期、凋亡和寿命秀丽线虫除了他们在肝脏代谢中的作用。O（运行）-GlcNAc也与细胞周期有关进展(56)、凋亡、，和dauer地层秀丽线虫，表明可能还有其他由FoxO1的GlcNAcylation控制的过程。总之，这些数据表明一种新形式的FoxO1调节不仅与糖尿病相关，而且与广泛的细胞过程的阵列。
致谢
我们感谢高茹坂井、温翔、京秀公园、乍得斯劳森和其他哈特实验室成员进行有益的讨论和技术援助。道恩·陈和罗伯特·科尔在约翰·霍普金斯大学弥撒光谱核心通过质谱法确认免疫沉淀分析。我们感谢William Sellers使用pGEX-4T3-GST-FKHR。
笔记
*这项工作得到了美国国家科学院的全部或部分支持健康补助金DK61671（丹麦克朗）; 和HD13563型; （致G.W.H.）和GM37537型（对D.F.H.说）。这个这篇文章的出版费用部分由下列款项支付页面费用。因此，必须在此标记此物品“广告“根据《美国法典》第18卷第1734节只是为了表明这一事实。
本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充图S1–S4。
脚注
2使用的缩写是：FKHR，叉头转录因子FoxO1；O（运行）-GlcNAc公司，O（运行）-连接的β-N个-乙酰氨基葡萄糖；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；葡萄糖-6-磷酸酶；锰超氧化物歧化酶，锰超氧化物歧化酶；OGT、O-GlcNAc转移酶；GST、谷胱甘肽S公司-转移酶；DMEM，Dulbecco改良的Eagle介质；GFP，绿色荧光蛋白；小鼠胚胎成纤维细胞MEF；PUGNAc公司，O（运行）-（2-乙酰氨基-2-脱氧-d日-吡喃葡萄糖苷）氨基-N个-苯氨基甲酸酯；HA、血凝素；RT，反向转录；ETD，电子转移离解；MS/MS，串联质量光谱法；己糖生物合成途径；大学教师，6-重氮-5-氧代诺尔菌素；链脲佐菌素。
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