Fearon及其同事的开创性工作提出结直肠癌（DCC）中缺失的200-kDa型跨膜受体是一种假定的肿瘤抑制因子(12). 尽管这在肿瘤调节中的作用仍存在争议(11,22)，许多报告描述了DCC的不同功能。现在越来越多的人关注新生激素，这是一种DCC同源物，目前对其知之甚少(8).
新生蛋白显示出一个与NCAM蛋白家族成员同源的大外结构域和一个没有已知特定基序的细胞内结构域。由于DCC和新生素之间的同源性，后者最初被报道为多功能netrin-1蛋白的受体(17,35). Serafini及其同事发现Netrin-1是一种可溶线索，在神经系统发育过程中，它是引导许多轴突和神经元的关键(33,34). 由于netrin-1和DCC突变小鼠的类似神经系统缺陷(17,33)，DCC被认为是参与netrin-1在神经元导航中的作用的主要受体。尽管缺乏确凿证据，但有人认为新生激素也可能与这种导向作用有关。Netrin-1和Netrin家族成员不仅对神经元导航很重要，而且对大脑以外的区域也很重要(6)包括细胞内粘附、形态发生、细胞存活和血管生成。新基因已被证明在调节netrin在形态发生中的部分作用中发挥作用，特别是在乳房发育期间(35)和肌管形成(16).
然而，netrin-1作为新生激素配体的倾向最近受到了挑战(9,18,19,32)现在有人认为，它充其量是新生激素的低亲和力配体。相反，新生素似乎是排斥导向分子（RGM）的高亲和力受体。RGM实际上由三个家庭成员组成，即RGMa、RGMb和RGMc(18). 新基因被提议调节RGMa的轴突导向功能(32)RGM/新生蛋白对在神经元分化中起作用(18). 除了在神经元导航和分化中的作用外，RGM/新生蛋白对还调节细胞存活。事实上，DCC和新生素都被证明属于所谓的依赖性受体家族(19,21,24). 当与配体分离时，这些受体具有诱导细胞死亡的功能，而配体的存在阻止了这种促凋亡活性。这样的受体就产生了依赖于各自配体的细胞状态(三,25)并可能通过将肿瘤生长限制在配体可利用的范围内，从而起到抑癌作用(1,20). 未结合受体的促凋亡作用也可能参与神经系统的发育：鸡胚中RGM的下调或新生素的过度表达与发育中的神经管中的大量细胞死亡有关(19).
新生素下游促进形态发生、神经元引导、分化或细胞死亡的分子机制尚不清楚。通过与其DCC同源物的类比，人们认为在缺乏RGM的情况下，新生素被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶裂解，暴露出促凋亡结构域，而该结构域又与促凋亡蛋白相互作用(14,19). 另一方面，在配体存在的情况下，新生素会激活经典的阳性通路。事实上，RGM/新生蛋白对最近被证明能激活小GTPase RhoA，并且它在神经元导航中的作用需要RhoA的激活(9). 在对新生素的细胞内结构域进行双杂交筛选时，我们观察到，获得的大部分假定相互作用物是通常位于细胞核内和/或参与转录调控的蛋白质。因此，我们研究了新生素的功能是否与Notch或淀粉样β前体蛋白（APP）受体类似，在这里，我们提供证据支持新生素通过γ-分泌酶裂解，导致新生素胞内结构域（NeICD）的释放它输入/输出到细胞核并调节基因转录。
材料和方法
细胞系、转染程序和试剂。
人胚胎肾HEK293T细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和小鼠乳腺癌67NR细胞在Dulbecco改良基本培养基（DMEM）加10%血清和50μg/ml庆大霉素培养。根据制造商的说明，使用FuGENE 6试剂（罗氏诊断公司）进行HEK293T细胞的瞬时转染。γ-分泌酶抑制剂N个-[N个-（3,5-二氟苯基乙酰基）-我-丙氨酸]-(S公司)-苯甘氨酸t吨-丁酯（DAPT）和蛋白酶体抑制剂Z-Leu-Leu-al（MG132）购自Sigma，分别在2μM和1μM下使用。核出口抑制剂钩端霉素B（LMB）购自LC实验室，使用浓度为1μM。Lactacystin从Cayman购买，用量为10μM。α-分泌酶/TACE/ADAM17抑制剂TAPI-1购自Calbiochem并在10μM下使用。在指定的时间用药物或等量的二甲基亚砜或乙醇载体进行治疗。从Apotech Corp.获得重组人RGMa（200 ng/ml）。将小鼠胚胎脑在DMEM-F12中冲洗，手动解离，并在37°C下与DMEM-F12中的指定药物一起孵育6小时。
双杂交分析。
根据制造商的说明使用了双混合系统Matchmaker II（Clontech）。作为诱饵，我们将pCDNA3-Neogenin扩增的Neogenin-IC编码序列（1127-1323位）通过SmaI位点插入质粒pGBKT7。酿酒酵母AH109细胞与pGBKT7-Neogenin IC构建物和人胎脑cDNA文库共转化。酵母细胞在不存在亮氨酸、色氨酸和组氨酸以及存在α-Gal和5mM 3-氨基-1,2,4-三唑的条件下生长。通过DNA测序进一步分析推测的候选相互作用体。
质粒构建物。
前面描述了全长人新生素表达结构pCDNA3-neogenin(19). Flag-Tip60构造是C.N.Robson（英国泰恩河畔纽卡斯尔大学）赠送的一份礼物。绿色荧光蛋白（GFP）-新生蛋白构建物是通过将相应的编码序列插入pEGP-C1（Clontech），分别通过ApaI-KpnI和XhoI-HindIII位点，通过以pCDNA3-neogenin为模板的PCR扩增得到的。采用相同的方法，分别通过PstI-HendIII和EcoRI-HindIII位点将Gal4-neogenin构建物插入质粒pMst。pMst是pM（Clontech）的修改版本，是T.Sudhof赠送的一份礼物。使用QuikChange定点突变系统（Stratagene）创建R1129A/R1130A、K1138A/R1139A和L1455A新基因突变。我们使用的引物序列可根据要求提供。通过PCR扩增和克隆新生素片段（位置1至1144）和Gal4（位置1到147）到pCDNA3，分多步生成Neo-Gal4构建体。Neo-Gal4-IC是通过将新基因片段插入Neo-Gal 4的1145至1462位置生成的：生成的质粒编码全长新基因，Gal4 DNA结合域插入1144至1145位置之间的IC域中（可根据要求提供更多策略细节）。以GFP-NeICD L1455A为模板，通过PCR扩增获得Flag-NeICD L14.55A结构，并通过NotI-KpnI位点插入p3X-Flag（Sigma）。
免疫印迹和免疫沉淀。
抗新生素胞内结构域（C-20）和抗层粘连蛋白A/C（346）的抗体从圣克鲁斯购买。抗β-肌动蛋白（C4）抗体购自Chemicon。在含有50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM EDTA和0.5%NP-40的溶液中，在蛋白酶抑制剂存在的情况下，对共转染的293T细胞进行共免疫沉淀，共转染细胞使用抗Flag M2抗体和蛋白a-Sepharose（Sigma）拉下Flag-Tip60。用抗Neogenin IC检测Neogenin-IC与Tip60的相互作用。
亚细胞分离。
收集细胞并将其重新悬浮在CLB缓冲液中5分钟（10 mM HEPES、10 mM NaCl、1 mM KH2人事军官4，5 mM NaHCO三，5 mM乙二胺四乙酸二钠，1 mM氯化钙2，0.5 mM氯化镁2)添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）、磷酸酶抑制剂鸡尾液（Sigma）和1 mM曲古抑菌素A（Calbiochem）。使用Dounce研磨机进行40次冲程，然后在4000×克5分钟。将上清液调节为0.5%NP-40，并用作膜和胞浆部分。将核颗粒重新悬浮在TSE（10 mM Tris，300 mM蔗糖，1 mM EDTA，0.1%NP-40[pH7.5]）中，再加上蛋白酶和磷酸酶抑制剂以及曲古抑菌素A，并进行25次均质。离心后，将纯核颗粒重新悬浮在Laemmli缓冲液中，并进行超声波处理以获得核提取物。
细胞成像。
将HEK293T细胞接种到细胞培养载玻片上并转染GFP构建物，用4%甲醛固定。细胞核用DAPI（4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚）染色。用Mowiol贴装后，使用Axiovert 200 M外荧光蔡司显微镜观察细胞。
基因报告分析。
质粒pGLuc，编码在Gal4上游激活序列（UAS）控制下的萤火虫萤光素酶报告基因，和质粒pCMV-Renilla，编码雷尼利亚荧光素酶报告基因在巨细胞病毒启动子的控制下，由T.Sudhof提供。HEK293T细胞与每个pMst构建物、等量的pGLuc和1/50的pCMV-Renilla共同转染。根据制造商（Promega）的说明，在转染后48小时，使用双核糖核酸酶报告试验测定转录活性。
ChIP克隆。
HEK293T细胞（1×108细胞）转染Flag-NeICD L1455A构建物。48小时后，在室温下将细胞固定在磷酸盐缓冲液中2.5 mg/ml二甲基己二酸二甲酯（Fluka）中30分钟，然后在室温下用0.8%甲醛在磷酸盐缓冲溶液中固定10分钟。在室温下向125 mM中添加甘氨酸5分钟，阻止固定。在4°C下离心细胞，并将颗粒重新悬浮在超声缓冲液中（10 mM Tris[pH8.0]，1 mM EDTA，0.5 mM EGTA+蛋白酶抑制剂）。使用布兰森细胞破碎器在冰上对染色质进行超声波处理。离心去除碎片后，将裂解液调节为10 mM Tris（pH 8.0）、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、150 mM NaCl、0.1%Triton X-100和蛋白酶抑制剂，并与抗Flag M2抗体孵育过夜。将裂解液与μMACS蛋白G微球（Miltenyi Biotech）结合并培养1 h。允许裂解液和微球流过MACS柱，并用含有100 mM Tris（pH 8.0）、500 mM LiCl、1%NP-40和1%脱氧胆酸的溶液冲洗四次。然后在50 mM NaHCO中洗脱染色质免疫沉淀（ChIP）产物三-1%十二烷基硫酸钠缓冲液。添加10微克RNase A和0.3 M NaCl进行洗脱，并通过在67°C下培养4小时恢复交联。使用QiaQuick柱（Qiagen）进一步纯化DNA，经MboI消化，并克隆到BamHI消化的小牛肠碱性磷酸酶脱磷酸化载体pUC19中。利用加州大学圣克鲁斯分校基因组浏览器的BLAT搜索功能，对获得的克隆进行测序并在人类基因组上定位(http://genome.ucsc.edu).
定量逆转录PCR（Q-RT-PCR）。
在使用NucleoSpin RNA II装置（Macherey Nagel）提取RNA并根据制造商的说明使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）进行逆转录后，根据制造商的指示使用LightCycler技术进行定量PCR。用于GRHL1扩增的引物为5′-GCAAAAAAAAGGCAAGTGTC-3′和5′-AGGAAGCAGTGCACTTTA-3′，用于CCM2扩增的引子为5′-AGAGACCTACGGAAG-3′和5’-ACCACCACATCAGATT-3′，以及用于β2-微球蛋白为5′-ACCCCACATGAAAAAAGATGA-3′和5′-ATCTTCAACCTCCATGATG-3′。使用ΔΔ进行量化C类T型方法。
定量ChIP分析。
基于实时PCR的定量ChIP分析基本上是作为ChIP克隆进行的，但使用1×107转染全长neogenin或2×10的HEK293T细胞7MCF-7细胞。在免疫沉淀之前，从每个样品中取出一等分（10%输入）的超声染色质，反向交联，用核糖核酸酶A和蛋白酶K处理，然后纯化。其余样品与4μg对照山羊免疫球蛋白g（IgG）或山羊抗NeICD（C-20）孵育过夜。使用μMACS系统纯化后，对ChIP产物进行反向交联，RNase A和蛋白酶K处理，使用QiaQuick柱纯化，并通过实时PCR（LightCycler）进行分析。用ΔΔ计算GRHL1或CCM2启动子序列在用对照或抗新生激素抗体免疫沉淀的染色质中的富集C类T型方法使用稀释的10%输入样品作为参考，使用未经处理的样品和对照IgG作为校准品。用于GRHL1启动子的引物为5′-CACAGGCACAGAAACATAAAAATG-3′和5′-TGTCTTCCAAGTGTGGAGC-3′，用于CCM2启动子的启动子为5′-GCACATAGTGACCTTCCAAC-3′和5'-AAGCAATCCTCCATCTCAGC-3′。
结果
新生蛋白被γ-分泌酶裂解，并与参与基因转录激活的蛋白质相互作用。
在寻找新生激素相互作用物的过程中，我们对NeICD的N端半部分（氨基酸[aa]1127至1323）进行了双杂交筛选（最初选择该结构域是因为它被认为参与细胞死亡诱导）(19)（图。). 当我们确定位于细胞核中并在基因转录激活中发挥作用的假定伴侣时，我们感到困惑（图。). 其中一个候选者是TIP60组蛋白乙酰转移酶(5)进一步分析，并通过共免疫沉淀证实其与新生激素的相互作用。在HEK293T细胞中强制表达后，标记TIP60的免疫沉淀拉下新生素的胞内结构域（图。).
NeICD与包括TIP60在内的核蛋白相互作用。（A） 新生蛋白的结构图，显示由细胞外部分的Ig样和纤维连接蛋白III样结构域、跨膜结构域（TM和Transmemb.）和细胞内结构域（IC）组成的蛋白质结构。图中还显示了用作双杂交屏幕诱饵的碎片。（B） 新生蛋白aa 1127至1323与酵母中的TIP60相互作用。如材料和方法中所述，在选择性培养基中培养与TIP60共转化的AH109酵母细胞，将其融合到Gal4的反式激活域和Gal4 DNA结合域（空载体）或融合到新生蛋白aa 1127至1323。（C） 双杂交屏幕显示了新生素aa 1127至1323的一些假定相互作用物，已知其显示核活性。（D） 在与新生素表达载体和标记TIP60表达结构共同转染的HEK293T细胞中进行免疫共沉淀（IP）。抗Flag M2抗体用于下拉，这是通过新生蛋白免疫印迹（WB）显示的。
TIP60与APP胞内结构域形成复合物，是APP基因转录激活活性所必需的，这使其成为一个有趣的候选物。关于与核蛋白和/或参与转录调控的蛋白相互作用的跨膜受体的总体观点是，这些受体（例如Notch和APP）被分泌酶裂解后，释放出一个细胞内结构域，进而可以导入细胞核。因为DCC最近被证明是γ分泌酶的底物(30,36)然后我们研究了新生素是否也被分泌酶切割。作为第一种方法，在有或无DAPT（一种特异性γ-分泌酶抑制剂）和蛋白酶体抑制剂MG132的情况下培养的HEK293T细胞中表达新生素。使用新生素C末端表位通过免疫印迹分析产生的新生素片段。如图所示。在没有DAPT的情况下，检测到一个约45kDa的“γ”片段，并在DAPT处理后消失，这得益于一个更大分子的质谱片段（55kDa），因此它充当了γ-分泌酶的底物。我们称此片段为α片段，因为它与α分泌酶对新生蛋白的裂解有关。事实上，用10μM TAPI-1（α-分泌酶/TACE/ADAM17的一种特异性抑制剂）治疗24小时可以防止该片段的出现（参见补充材料中的图S1）。为了消除HEK293T细胞中过表达新生素的潜在偏见，我们随后评估了内源性表达的新生素是否经历了分泌酶的双重分裂。如图所示。在乳腺癌细胞系MCF-7和67NR中，以及在小鼠脑提取物中，新生素被γ-分泌酶裂解，导致出现包裹NeICD的片段。γ片段似乎非常不稳定，因为它只在蛋白酶体抑制剂MG132存在的情况下观察到。为了证实γ-片段被蛋白酶体快速降解，并避免MG132和γ-分泌酶之间可能的干扰，正如一些作者之前所建议的那样(10)，我们比较了转染或内源性新生素在MG132或另一种蛋白酶体抑制剂（10μM，持续6 h）存在下的切割情况。两种蛋白酶体抑制剂的情况类似（图。)第三种是环氧缩宫素（10μM，持续6小时）（数据未显示）。因此，根据上述结果以及已知的其他分泌酶叶受体（如Notch），新生素似乎被分泌酶裂解，如图所示。.
新生蛋白被γ-分泌酶裂解。（A） 新生素免疫印迹取自新生素转染的HEK293T细胞裂解液、MCF-7细胞或67NR细胞裂解液，或取自胚胎第13.5天小鼠胚胎的大脑，并用2μM DAPT和/或蛋白酶体抑制剂MG132（1μM）处理6小时。显示了被γ-分泌酶（γ）或α-分泌酶/ADM金属蛋白酶（α）切割的新生成素片段的位置，即该片段被TAPI-1处理所抑制（参见补充材料中的图S1）。（B） 用两种蛋白酶体抑制剂对新生素转染的HEK293T或MCF-7细胞进行处理，显示出相同的新生素特征（在10μM浓度下使用乳酸菌素[Lacta.]6 h）。（C） 根据我们的结果和有关其他分泌酶叶受体的文献，新生素分泌酶裂解的假设模型。
NeICD易位到细胞核。
然后，我们研究了与完整的NeICD相对应的片段是否可以易位到细胞核。作为第一种方法，我们在胞浆/细胞核分级后寻找MCF-7和67NR细胞中内源性表达的新生成素的位置。如图所示。虽然大多数新生素在膜/细胞溶质部分中被回收，但在核部分中也检测到45-kDa新生素片段。DAPT治疗与核提取物中检测到的新生素γ片段缺失有关，表明该片段与NeICD特异性对应。在这些条件下，α-产物积聚在膜/细胞溶质部分。因此，在γ-分泌酶裂解后，在细胞核中检测到NeICD。为了进一步阐明NeICD的核定位，我们研究了GFP标记的NeICD在HEK293T细胞中的表达。如图所示。在正常环境下，GFP标记的NeICD主要在胞浆中检测到。然而，当向培养物中添加核输出抑制剂LMB时，GFP-NeICD在细胞核中积累（图。). 因此，NeICD自然转移到细胞核，但也迅速出口。
NeICD显示了核定位。（A） 用2μM DAPT和/或蛋白酶体抑制剂MG132（1μM）处理或不处理MCF-7或67NR细胞6小时后，对细胞组分、细胞核（n）、膜和胞浆（M+c）进行新生蛋白免疫印迹（WB）；显示了两个曝光时间。请注意，较短的印迹显示可以更好地显示细胞溶质组分中γ和α产物之间的迁移差异。使用层粘连蛋白A/C免疫印迹作为核部分的对照，而使用β-肌动蛋白免疫印迹控制细胞溶质部分。（B） 转染GFP-NeICD的HEK293T细胞，与抑制剂LMB进一步孵育（1μM孵育1 h），并监测荧光定位。DAPI染色标记细胞核。
为了绘制负责NeICD进出口的域，我们首先分析了NeICD上半部分N端的位置（aa 1127至1323）（图。). 如图所示。，该片段组成性地位于细胞核内，而相应的C末端另一半（aa 1323至1462）组成性地在胞浆中检测到。有趣的是，在aa 1127到1323的片段的第一个氨基酸中，检测到一个富含碱性的结构域。由于核定位信号（NLS）通常是富含碱性氨基酸的基序(7)，我们删除了该区域，并观察到剩余片段（aa1153至1323）不再位于细胞核中。为了进一步证明在aa 1127到1153处存在NLS，我们直接突变了基本残基（RRTTSHKKR在AATTSHKK或RRTTSHKAA中突变），并评估了在LMB存在下NeICD的核定位。如图所示。，这两个突变体未能充分定位到细胞核，从本质上证明新生素显示位于aa 1127到1153的NLS。由于我们仅在LMB存在或C末端区域缺失的情况下观察到NeICD的核定位，我们推测NeICD C末端区域存在核输出信号（NES）。NES通常以富含疏水残基的序列为特征(38). 我们注意到在NeICD的C末端有一个富含亮氨酸的序列（L-[X]1-3-L-[X]2-3-L-X-X-I）并突变其中一个亮氨酸（L→A）。如图所示。NeICD L1455A随后被定位于细胞核，即使没有LMB。因此，neogenin被γ-分泌酶切割，γ-分泌酶释放一个片段，该片段通过位于其N末端的NLS易位到细胞核，并由于位于其C末端的NES而从细胞核输出。有趣的是，NLS和NES在物种之间似乎都是保守的（图。).
NeICD显示NLS和NES，以规范其核定位。将HEK23T细胞转染到指定的构建物中，进一步培养或不培养抑制剂LMB（1μM，1 h），并监测荧光定位。DAPI染色标记细胞核。（A，顶部）代表以下面板中使用的新生素IC不同突变体的方案。（底部）与图中相同。但带有指示的缺失突变体。（B） 新生素NLS位于NeICD的N末端区域。数据与上述（A）相同，但具有指示的点突变。（C） NES是NeICD的C末端区域。数据与上文（A）所述相同，新生素IC L1455A突变。（D） 序列比对显示不同物种中NES和NLS的保存情况。智人,智人;小M,肌肉;褐鼠,褐家鼠;加卢斯,五倍子;十、热带,热带爪蟾;斑马鱼,达尼奥雷里奥.
NeICD触发基因转录。
为了监测该片段的作用，我们研究了NeICD是否能够反式激活基因转录。为了对此进行分析，将NeICD融合到Gal4 DNA结合域，在Gal4 UAS的控制下，HEK293T细胞被迫表达Gal4-NeICD和编码荧光素酶报告基因的构建物。如图所示。Gal4-NeICD能够对Gal4 UAS进行反式激活（仅是Gal4 DNA结合域的12倍以上），从而证明该片段具有基因反式激活活性。为了进一步证明该基因的反式激活活性取决于全长新生素的γ-分泌酶裂解，在全长新生素细胞内结构域中插入了Gal4 DNA结合域（图。). 然后，在Gal4 UAS的控制下，HEK293T细胞被迫表达Neo-Gal4ICD和编码报告基因的构建物，并用γ-分泌酶抑制剂进一步处理（或不处理）。如图所示。在没有DAPT治疗的情况下，Neo-Gal4ICD激活Gal4 UAS，而DAPT治疗强烈抑制了这种激活。因此，新生素被γ分泌酶裂解，释放出显示基因转录激活活性的NeICD。
NeICD显示出一种基因反式激活活性。（A） NeICD促进报告基因转录。如图（顶部）所示，将Gal4表达结构体或Gal4 DNA结合域与Gal4-lucerifase报告质粒共转染到HEK293T细胞中，并记录发光信号。相对荧光素酶活性指数显示为新生素构建物与对照Gal4载体之间的比率。指出了平均值的标准误差。（B） γ-分泌酶依赖的NeICD从全长新生成素中释放，促进报告基因转录。将Gal4 DNA结合域插入全长新生蛋白。将产生的构建物NeoGal4ICD与Gal4荧光素酶报告质粒共转染到HEK293T细胞中。将缺乏细胞内结构域的NeoGal4构建物用作对照。DAPT处理（2μM）24小时（C）与上述相同（A），使用NeICD-Gal4的指定缺失突变体。（D） 表示NeICD不同功能域的方案。A.U.，任意单位。
该活动位于NeICD的C末端后半部分（aa 1324至1462），因为删除该区域足以完全废除该活动（图。). 在同一线路中，仅此C末端区域的表达（融合到Gal4 DNA结合域）足以对Gal4 UAS进行反式作用（图。). 有趣的是，位于aa 1324至1462的NeICD比NeICD表现出更强的活性，这表明NeICD的N末端区域也包含抑制结构域。
为了正式证明该裂解片段与DNA复合物相关并触发/增强特定基因转录，使用NeICD L1455A进行ChIPs下拉（选择L1455A-突变株进行免疫沉淀以增加细胞核中的NeICD水平）。从下拉框中提取DNA并进一步克隆载体，证明NeICD与DNA形成复合物。少量克隆DNA的DNA测序（这里的目的不是描述新的靶基因，而是证明NeICD调节其中一些基因的转录）揭示了可能受新生激素信号调节的假定靶基因列表（图。). 接下来，我们评估了这些基因中的一些是否受新生激素信号调节。两个候选基因GRHL1和CCM2是根据它们相对于新生素的相对已知作用和表达状态来选择的（CCM2编码有丝分裂原活化蛋白激酶[MAPK]的支架[37]，一种参与DCC/新生素信号传导的激酶[13]GRHL1是神经系统发育过程中涉及的转录因子）。然后，我们通过Q-RT-PCR评估HEK293T细胞中GRHL1和CCM2 mRNA的存在，这些细胞被迫表达全长新生素，并与RGMa进一步孵育或不孵育。如图所示。，虽然新生素表达本身不能增加GRHL1和CCM2水平，但RGMa处理引发GRHL1和CCM2的时间依赖性表达增加。有趣的是，DAPT处理抑制了这种增加的表达，因此表明RGMa通过新基因的γ-分泌酶裂解触发基因转录。为了进一步分析内源性新生素是否会产生同样的作用，将RGMa添加到MCF-7细胞中，如图所示。，RGMa确实会触发GRHL1 mRNA的增加，这种上调被DAPT抑制。
NeICD作为基因转录的反式激活剂发挥作用。（A） 显示NeICD在其邻近区域内相互作用的不同基因（分析了25个以上克隆中的12个）。对NeICD进行ChIP，克隆免疫沉淀DNA并测序。（B） 在DAPT存在或不存在的情况下，对用RGMa处理或不处理3或6小时的模拟与新生成素转染的HEK293T细胞进行GRHL1和CCM2 Q-RT-PCR。新生素转染HEK293T细胞中的新生素/RGM信号调节CCM2和GRHL1 mRNA水平。对β进行归一化2-微球蛋白。CCM2或GRHL1水平以归一化新生蛋白样品与模拟转染样品之间的比率表示。（C） 与上述（B）相同，但在RGMa/DAPT处理的MCF7细胞中测定GRHL1mRNA水平。还对β进行了归一化2-微球蛋白，GRHL1水平表示为GRHL1和β的比值2-微球蛋白。
为了更正式地证明RGMa调节NeICD的核信号传导，进而直接增强GRHL1和CCM2的转录，而不是对RGMa/新生代蛋白替代信号传导的间接影响，我们研究了在GRHL1和CCM2启动子序列中是否可以检测到NeICD，以及在RGMa处理后是否可以增加这种检测。为此，使用抗NeICD抗体在HEK293T细胞或经RGMa处理或未经RGMa.处理的MCF-7细胞（表达内源性新生激素）中进行ChIP。然后通过GRHL1和CCM2启动子序列的定量PCR对NeICD与GRHL1及CCM2的启动子序列结合进行定量。如图所示。当使用对照抗体进行ChIP分析时，RGMa治疗未能增强NeICD结合，当抗NeICD抗体用于ChIP时，我们检测到NeICD与两个启动子序列的结合增加，以响应RGMa。总之，这些数据支持这样的观点，即NeICD的核易位和反式激活活动是RGM信号的一部分，RGM信号通过调节一组特定基因的转录而发生。
在RGMa刺激后，NeICD结合目标启动子。（A） 在新生素转染的HEK293T细胞中，当RGMa刺激时，NeICD结合GRHL1和CCM2启动子。从未经处理和RGMa处理的新生素转染的HEK293T细胞中分离出交叉连接染色质，并用NeICD特异性抗体或对照抗体沉淀。沉淀的染色质用作定量PCR的模板。（B） 内源性NeICD在RGMa刺激后结合GRHL1启动子。数据与上述（A）相同，但实验是用未经处理或经RGMa处理的MCF7细胞进行的。
讨论
我们在此提出，新生素在膜上被γ-分泌酶裂解，这是一种释放细胞内结构域的事件，该结构域迁移到细胞核以调节一组特定基因的转录。因此，在功能上，新生素类似于APP或Notch受体。有趣的是，已知Notch细胞内结构域可以招募组蛋白乙酰转移酶，但也可以招募转录调节因子RBP-J/CBF1，这是激活基因转录本身的因子(2). 如图所示，NeICD也与组蛋白乙酰转移酶相互作用，但NeICD/DNA复合物中激活转录的因子仍有待确定。
另一个令人困惑的问题是配体在这个新的新生激素信号级联中的作用。研究表明，配体的存在刺激Notch或Erbb-4受体的γ-分泌酶裂解(28,29). 其他受体（如生长激素受体）未显示出这种情况(10)或APP，尽管在后一种情况下，这是因为APP没有已知的功能配体。在这里，功能数据强烈支持配体（RGMa）在该信号传递中的起始作用：（i）新生素介导的靶基因转录在RGMa的存在下受到刺激，这是一种依赖于γ-分泌酶活性的机制，以及（ii）对RGMa作出反应，NeICD显示与靶基因启动子的结合增加。因此，很容易推测RGM控制着这种信号传递。然而，在这一阶段，我们尚未检测到依赖RGM存在的新生蛋白γ-分泌酶裂解的变化（未显示）。这可能表明配体影响下游效应（例如，核导入），也可能突显检测似乎受到严格调控的片段数量细微变化的技术困难（例如，蛋白酶体抑制剂MG132和乳胱氨酸蛋白酶用于检测图中所示的新生素γ片段。).
尽管分子机制的阐明还需要进一步研究，但我们很容易推测，配体依赖的核信号在新生蛋白的不同功能背景下是重要的。例如，这可能对RGM的指导活动很重要。然而，人们可能想知道位于神经元生长锥内的膜相关受体胞内结构域的核移位与RGM介导的轴突引导有多大关系。事实上，新生素会在生长锥水平被γ-分泌酶裂解，然后被转运到体细胞，在那里NeICD可以进入细胞核并触发特定基因转录和随后的翻译，然后再被转运回生长锥，在那里发生轴突导航。轴突导向中的新转录要求已经得到支持：例如，NFaT等转录因子在对netrin-1的反应中被激活，并且是netrin-1反应所必需的(15). 在这里，有趣的是，用NeICD拉下的几个靶基因在RGM介导的轴突引导中可能很重要。例如，CCM2似乎是MAPK的支架(37)，并且这种支架和MAPK激活的重要性已经在各种轴突导向系统中得到证明，包括netrin-1介导的轴突导向(4,13,27). 未来的研究应揭示NeICD的直接靶基因是否对RGM信号传导重要。
RGM/新基因相互作用的另一个假定作用是抑制新基因的促凋亡活性。这种依赖RGM的核信号可以拮抗新生素的产生信号。尽管我们在这一阶段还没有检测到具有明显抗凋亡作用的靶基因，但一个有趣的假设是RGM可以通过一个信号环抑制新生素介导的细胞死亡，该信号环将新生素带到细胞核，并可能涉及新生素介介导的抗凋亡基因转录。在这方面，令人感兴趣的是，新生素在其细胞内域中经历了两次拮抗性裂解。γ-分泌酶裂解似乎促进了推测为抗凋亡的核信号传导，即作为配体介导的，而caspase裂解促进了促凋亡活性neogenin(19). 有趣的是，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的裂解不仅通过前凋亡结构域的暴露促进凋亡(19)而且还将新生素的NLS结构域与新生素的反式激活结构域分离（图。). 理论上，这应该会杀死新生激素的基因反式激活活性。因此，对新生素介导的凋亡的参与不仅与暴露新生素促凋亡结构域促进凋亡有关，还与抑制NeICD介导的转录有关。
未来的研究可能会强调这种核信号在新生蛋白功能中的重要性。令人感兴趣的是，新基因NLS和NES似乎在新基因存在的不同物种中是保守的。同样，电子分析显示新生素的NLS和NES在DCC中也保守（未显示），因此表明这些受体中的核信号传递具有保守作用。我们的初步结果表明，DCC也与TIP60相互作用（未显示）。因此，尽管DCC和新生素的胞内结构域仅适度保守（37%）(26)，除了P1、P2和P3这三个特定域(23)考虑到Notch核信号通路是少数几个在进化过程中保持不变的信号通路之一，是控制细胞命运的关键(31)很容易推测，新生素/DCC核信号通路也是一个保守而重要的信号通路。
