多巴胺D1受体通过TrkB受体诱导纹状体信号转导神经元^*

摘要

多巴胺是多巴胺能神经元释放的主要神经递质，调节神经元活动(1–三)并影响与运动活动相关的关键生理功能，奖励和认知(4,5). 多巴胺似乎也会发挥多种发展作用。在外侧神经节隆起，多巴胺受体调节祖细胞的细胞周期(6). 多巴胺调节神经元的分化和成熟，如轴突延伸和生长锥的发育(7–9).然而，这些发育活动的分子机制还没有尚未定义。

多巴胺受体分为D1类（D1和D5）和D2类（D2，D3和D4）受体(10).D1样受体的激活增强L型钙离子（Ca²⁺)通道活性和增加细胞内钙²⁺浓度(11–13).多巴胺受体是G蛋白偶联受体（GPCR）^三监管该信号导致循环3′-5′AMP（cAMP）积累因为与异源三聚体G蛋白亚基偶联(14,15). 许多GPCR可以反式受体酪氨酸激酶。这表明多巴胺受体可以通过利用其他生物的反式激活来更广泛地调节营养效应受体。

神经营养素，如脑源性神经营养因子（BDNF）和神经营养素-3广泛表达于大脑皮层、小脑和海马体并对中枢神经系统中的许多神经元群体(16). 除了神经营养素与Trk受体结合，Trk受体可以被使用GPCR的配体反式激活(17,18). Trk的激活受体被证明是神经保护和神经元迁移的原因(19,20).

在本文中，我们报告D1受体刺激可导致大鼠纹状体神经元TrkB受体活性的反式激活在里面体外和体内D1受体的激活导致初级纹状体钙内流和TrkB表面表达的调节文化。我们的结果表明D1受体通过以下途径调节其信号传导TrkB的反式激活，暗示纹状体神经元的发育可以取决于交易激励机制。

实验程序

初级文化-从胚胎中解剖出纹状体组织Sprague-Dawley大鼠（胚胎第18-19天，Charles RiverLaboratories，Inc.，Wilmington，MA）并与0.01%胰蛋白酶分离解决方案。神经元的密度为～1.0×10⁶含有10%的Dulbecco改良Eagle培养基中的细胞/ml胎牛血清，在无血清条件下生长5-6天，as如前所述(21).将胶质细胞接种在含有10%的Dulbecco改良Eagle培养基中胎牛血清，并在10%血清条件下生长。在天在里面体外（DIV）5或6，用多巴胺激动剂处理培养物：SKF38393（1μ米)，喹吡罗（1μ米; Sigma-Aldrich公司公司），离子霉素（10μ米; 加州圣地亚哥Calbiochem）或BDNF（5纳克/毫升，Peprotech公司，新泽西州落基山）。多巴胺激动剂之前处理后，将培养物与多巴胺D1受体预孵育拮抗剂SCH23390（1μ米; Sigma）或K-252a（100 n米;钙生物化学）、TrkB-Fc（10μg；Chemicon，Temecula，CA）、BAPTA（10μ米)或BAPTA-AM（10μ米，Calbiochem）。所有动物实验按照纽约大学医学院实验动物资源指南医学。

表面生物素化分析-培养物用1μ米SKF38393培养3小时，然后用1 mg/ml培养含有1米米氯化钙₂和1米米氯化镁₂持续30分钟在冰上(18). 细胞裂解与固定化链球菌亲和素琼脂糖（ImmunoPure；穿孔）在4°C下过夜。用2%十二烷基硫酸钠洗脱生物素化蛋白100°C下的缓冲液，并处理用于Western印迹分析。

免疫沉淀和Western Blot分析-的级别通过免疫印迹分析测定磷酸化TrkB、TrkB、磷酸化酪氨酸使用与前面描述的方法类似的方法(22). 蛋白质样品免疫沉淀是从培养细胞或纹状体组织中制备的用放射免疫沉淀分析缓冲液（10m）溶解米三氯化氢，pH值7.5，150 m米氯化钠，1米米EDTA，1%Triton X-100，0.1%脱氧胆酸盐，0.1%十二烷基硫酸钠）。对于免疫沉淀，蛋白裂解物为用2μg Trk抗体培养（Santa Cruz Biotechnology，Inc.，SantaCruz，CA）或TrkB抗体（Cell Signaling Technology，Danvers，MA）过夜温度为4°C。产生的免疫复合物与蛋白质沉淀A-琼脂糖珠（Amersham Biosciences）。用2%十二烷基硫酸钠变性后样品通过SDS-PAGE分离并电泳转移至聚乙烯基氟化物膜（Immobilon-P®，Millipore，Bedford，MA）。用Trk抗体（1:1000；Santa Cruz）探测细胞膜，磷酸酪氨酸抗体（1:1000；Upstate Biotechnology Inc.，Lake Placid，NY）、TrkB抗体（1:1000；细胞信号）、磷酸-MAPK抗体（1:100）、，MAPK抗体（1:1000）、磷酸-ARMS抗体（1:500）、ARMS抗体（1:2000）(23)，磷酸化Akt抗体（1:1000）、Akt抗体（1:1000；细胞信号）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）抗体（1:1000；Chemicon），GAD67（67 kDa的谷氨酸脱羧酶）抗体（1:500；Santa Cruz），胶质纤维酸性蛋白抗体（1:1000；Chemicon）或肌动蛋白抗体（1:5000；Chemicon）。扩展后清洗后，用结合辣根过氧化物酶的抗兔/鼠免疫球蛋白，然后进行化学发光反应（ECL试剂盒；Amersham Biosciences）。这个用密度计定量分析谱带强度。

磷酸化TrkB抗体的特异性由肽证实竞争分析(23). 对于在竞争中，我们将磷酸化TrkB抗体与5倍过量的TrkB肽（LQNLAKSPVTLDIC）或磷酸化TrkB肽（LQNLAKSPVT（采购订单_三H（H）₂)LDIC）在500μl PBS和在4°C下培养过夜，然后我们将其用于西药吸墨纸。

免疫细胞化学-细胞用4%固定PBS中的多聚甲醛或PBS中4%多聚甲醛+0.1%戊二醛20分钟，然后用PBS清洗三次10分钟。固定培养物在4°C下与磷酸化TrkB抗体（1:1000）孵育过夜，多巴胺D1受体抗体（1:300；Chemicon）或TrkB抗体（N末端，1:300; Upstate），并在室温下与Alexa孵育1小时Fluor®568山羊抗兔IgG二级抗体（1:400），AlexaFluor®488山羊抗兔IgG二级抗体（1:200），驴抗山羊IgG-Cy3抗体（1:400；分子探针，尤金，OR）或山羊抗鼠IgG-生物素抗体（1:400；加利福尼亚州伯林盖姆向量实验室）。根据小鼠IgG生物素抗体，将细胞与亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（VECTASTAIN®Elite ABC试剂盒，Vector Laboratories）。用二氨基联苯胺进行染色（50 m内0.5 mg/ml米Tris，pH值7.5）H（H）₂O（运行）₂免疫反应神经元的图像为用尼康荧光显微镜（ECLIPSE E800）采集并分析使用AxioVision（德国哥廷根卡尔蔡司）。

小鼠多巴胺D1受体转染-表达式小鼠D1受体（mD1R）载体在哺乳动物中的表达被克隆载体pcDNA3.1/V5-His©TOPO©TA表达试剂盒（Invitrogen）。氚标记多巴胺结合检测D1受体的表达下面描述的分析。

将人TrkB转染的HEK293（HEK293-TrkB）细胞制备为如前所述(24)和在密度为4×10的12孔板中生长⁵细胞/孔。用mD1R质粒和磷酸钙转染细胞方法。24小时后，用化学试剂挑战培养细胞以上。通过培养HEK293-TrkB评估多巴胺结合试验在4°C的Tris缓冲液（50 m）中培养60分钟米Tris，pH 7.4，120米米氯化钠，1米米EDTA、5 g葡萄糖和2米米氯化钙₂)含20 n米 ^三H-多巴胺（Amersham Biosciences）和1μ米多巴胺（西格玛）。对细胞进行裂解，并将其放射性含量计算为如前所述(21).

多巴胺D1受体激动剂和拮抗剂对新生儿的挑战纳特群岛-Sprague-Dawley大鼠（4天大；Charles River Laboratories，Inc.）被安置在12小时的明暗循环中，免费获得食物水。不同组的大鼠在颈部皮下注射颈部的(25)带有SKF38393（西格玛；1 mg/kg）、SCH23390（西格马；1 mg/kg/kg）或对照药物（0.25%蒸馏盐水中的抗坏血酸）。SKF38393和SCH23390溶于含有0.25%抗坏血酸的蒸馏盐水。这些动物的脑组织用于免疫沉淀和免疫印迹，立即采集斩首后在冰上解剖。通过外围管理，这些化合物穿透血脑屏障并影响脑内的神经化学物质大脑(26). 这个多巴胺和环腺苷酸调节蛋白的磷酸化水平（相对分子量32000；DARPP32）在纹状体组织中增加SKF38393给药大鼠和SCH38393用药大鼠中的含量降低大鼠（数据未显示）。

统计分析-所有值都显示为平均值±S.D.采用单向法分析药理作用采用Bonferroni检验或Mann-Whitney检验进行方差分析U型评估免疫印迹差异的测试。概率低于0.05的水平被认为具有统计学意义。

结果

来自黑质的多巴胺能输入在纹状体(22,27,28). 据报道多巴胺D1受体信号转导调节神经元形态和表达纹状体神经元发育中的功能标记(7,8). 我们分离出纹状体大鼠胚胎第18天胚胎的初级神经元及其受累评估发育中神经元的神经营养信号。

TrkB是BDNF和神经营养素4的受体，在纹状体中表达神经元(29). 在纹状体，BDNF/TrkB信号在增殖、分化和中棘神经元的发育(30–33).为了确定纹状体神经元中TrkB受体的身份和状态，我们使用针对TrkB C末端肽的磷酸特异性抗体。第一，我们通过肽证实了抗磷酸化TrkB抗体的特异性竞争分析（参见图。2O（运行）). HEK293-TrkB细胞的Western blot分析(24)导致激活BDNF处理后的TrkB蛋白。该信号在预孵育后被阻断含有磷酸化TrkB肽而不含有非磷酸化TrkB肽。

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图2。

D1受体激动剂诱导磷酸化TrkB受体的免疫反应性在大鼠纹状体神经元中。 A–N，纹状体培养物经对照（PBS）处理，SKF38393(SKF公司)或37°C时的BDNFDIV5.一些培养皿用K-252a或SCH23390预培养(SCH公司)SKF38393孵育前。培养物固定并用免疫染色磷酸化TrkB抗体(红色)和多巴胺D1受体抗体(绿色). 注意，87例患者中检测到磷酸化TrkB免疫反应D1受体阳性神经元的±11%（数据未显示）。O（运行）,用HEK293-TrkB细胞检测磷酸化TrkB抗体的特异性。为了评估磷酸化TrkB抗体的特异性，细胞裂解物（每个30μg）从用对照（PBS）或BDNF（10 ng/ml）处理的HEK293-TrkB细胞中获得用磷酸化TrkB抗体和用磷酸化或非磷酸化的TrkB预孵育肽竞争对手。工作分解结构，Western blotting。

确定多巴胺受体是否激活Trk受体刺激纹状体神经元，我们从胚胎大鼠纹状体并用D1受体激动剂SKF38393处理或D2受体激动剂喹吡罗(34,35). 神经元培养在DIV6上进行检测，并与在BDNF。SKF38393治疗增加了磷酸化Trk水平(图1A类)和磷酸化TrkB(图1B类)纹状体神经元。然而，D2受体激动剂喹吡罗不能刺激TrkB的磷酸化(图。1B类). D1受体特异性拮抗剂的预处理SCH23390或酪氨酸激酶抑制剂K-252a阻断TrkB的增加SKF38393磷酸化(图。1B类).

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图1。

D1受体激动剂对大鼠纹状体Trk受体磷酸化的影响文化。对照组（PBS）处理纹状体神经元培养物，38393瑞典克朗(SKF公司;1 μ米，10–180分钟），喹吡唑(昆;1 μ米，180分钟）和BDNF（5 ng/ml，3分钟）DIV6上为°C。一些菜肴用K-252a预孵育(K-252a公司+SKF公司)或SCH23390(SCH公司+SKF公司)先前SKF38393孵育。A类，免疫沉淀后(知识产权)用Trk抗体对细胞裂解物进行SDS-PAGE和Western吸墨剂(工作分解结构)磷酸酪氨酸(第页)和Trk.典型免疫印迹(IB公司)如图所示。蛋白质水平由独立井(n个= 4).^*,第页< 0.05. 这个酒吧注明S.D。B类，一些细胞裂解物免疫沉淀法也进行Western印迹。代表免疫印迹显示。请注意，SKF38393治疗增加了生长相关蛋白43（生长锥标志物）的免疫反应性此区域性（未显示数据）。

我们还检测了Trk信号分子的激活，如Akt、，MAPK、磷脂酶Cγ和ARMS(36,37). 与……孵育后SKF38393持续3小时，几个信号分子的磷酸化水平，如磷脂酶Cγ和MAPK增加通过SCH23390或K-252a预处理抑制(图1B类). NSE公司抗体被用作神经细胞标记物，谷氨酸脱羧酶为67kDa（GAD67）也被用作中等大小、棘状GABA能神经元的标记物纹状体内(28). 级别NSE和GAD67在我们的神经元培养物中都是恒定的。

纹状体中也观察到磷酸化TrkB免疫反应增强SKF38393刺激3h后的神经元(图2). 磷酸化TrkB在D1受体阳性神经元中检测到。磷酸化TrkB染色经SCH23390或K-252a治疗后减少。这些结果表明纹状体神经元中的TrkB受体被磷酸化多巴胺D1受体刺激，导致依赖TrkB的信令在体外.

确定D1受体激活的影响体内，我们在出生后的大鼠（出生后）皮下注射SKF38393第4天；图3). 额叶皮层代表腹侧被盖多巴胺能神经元的靶区区域。因此，对这些动物的额叶皮层和纹状体进行了解剖注射后，通过测量SKF38393的疗效多巴胺能靶区激活的磷酸化TrkB蛋白水平。在纹状体裂解物，磷酸化TrkB的增加通过注射后3h和6h免疫沉淀。无显著增加在额叶皮层观察到磷酸化TrkB水平。这些结果提示D1受体特异性TrkB反式激活发生在纹状体。我们还对出生后的大鼠（出生后第4天；图3B类). 三个小时注射后，发现磷酸化TrkB水平在SCH23390大鼠纹状体与对照同窝大鼠的比较。这个实验证实D1受体的激活可以调节TrkB活性纹状体。

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图3。

大鼠纹状体磷酸化TrkB水平的调节D1受体激动剂和拮抗剂。注射Littermate大鼠带控制载体（PBS；0.25%抗坏血酸-盐），SKF38393(A类和B类,SKF公司; 0.25%抗坏血酸盐中1 mg/kg）和SCH23390型(B类,SCH公司;0.25%抗坏血酸盐中1 mg/kg）出生后第4天。A类D1受体刺激对纹状体和额叶皮层上的时间点通过以下方法估算磷酸化TrkB。将显示重复的样本。B类，D1的影响纹状体给药3h后受体的激活和抑制通过测定磷酸化TrkB进行评估。将显示三个副本样本。代表性免疫印迹(IB公司)如图所示。的数量NIH图像显示纹状体中磷酸化TrkB免疫反应。请注意纹状体中的神经元（NSE）标记物没有显著降低在这个药理学范式中（数据未显示。对照：100±12.9%，SKF38393:100.7±7.1%，SCH23390:107.4±14.8%，平均值±S.D.）。n个= 4;^*,第页< 0.05. 这个酒吧注明S.D。知识产权，免疫沉淀。

为了确认TrkB受体在异源细胞系统中的激活，我们转染了D1受体cDNA构建物并评估了磷酸化在稳定转染的TrkB-HEK293细胞中通过SKF38393获得TrkB(图4B类).磷酸TrkB水平增加了SKF38393，减少了K252a或SCH23390的预培养，类似于原代神经元培养。

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图4。

质粒转染HEK293-TrkB细胞.A型，HEK293-TrkB用小鼠D1受体表达载体（mD1R）转染的细胞或对照细胞向量（模拟）。与……孵育60分钟后^三H-多巴胺(^三H-DA公司)-含有缓冲液，放射性含量为由独立井确定(n个= 4).^***.第页< 0.001. 这个酒吧注明S.D。B类，mD1R转染用对照（PBS）SKF38393处理HEK293-TrkB细胞(SKF公司; 1μ米或37°C下的BDNF（10 ng/ml，3分钟）。一些用K-252a预孵育培养皿((+)K252a公路)或SCH23390((+)SCH公司)SKF38393孵育前。细胞裂解物是进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。典型免疫印迹(IB公司)如图所示。

多巴胺不仅能刺激神经元，也能刺激非神经元细胞(38,39). 我们的纹状体神经元培养系统中含有胶质细胞，约占细胞总数的10%（数据不包括如图所示）。因为出生后胶质细胞增多，所以这是值得怀疑的发育中神经元的TrkB磷酸化是否反映了对这些神经元的作用，或通过非神经元细胞对多巴胺。

为了解决胶质细胞在转录激活中的作用，我们比较了原代神经元培养物和原代培养物中全长TrkB的相对水平胶质细胞培养(图。5A类). 胶质细胞中未检测到全长TrkB裂解物。接下来，来自原代混合胶质细胞培养的条件培养基是使用对照组（PBS）、SKF38393或SCH23390治疗后收集至SKF38393或控制（PBS）。神经元培养物与从每个治疗中收集的胶质条件培养基，以及免疫沉淀法检测细胞裂解物中的磷酸化TrkB(图5B类). 没有影响在PBS或SKF38393调节介质。这些实验的结果表明SKF38393治疗后纹状体神经元中的TrkB激活未被介导通过胶质细胞。

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图5。

神经胶质细胞或培养细胞释放因子对TrkB的影响纹状体培养中的反式激活。 A类纹状体神经元或用对照组（-）或BDNF（+；10 ng/ml）处理胶质细胞培养物3分钟在DIV6上。对细胞裂解物（每个30μg）进行蛋白质印迹(工作分解结构). 代表性免疫印迹(IB公司)如图所示。B类,纹状体神经元培养物用来自纹状体的条件培养液处理胶质细胞培养(GCM公司)在DIV6上。对原代胶质细胞进行处理对照（PBS），SKF38393(SKF公司; 1 μ米，3小时），或SCH23390（1μ米，1小时）SKF38393之前(SCH公司+SKF公司). 培养3小时后，收集培养基用作纹状体神经元培养的胶质条件培养基。神经元用SKF38393处理后裂解细胞，每一个胶质细胞条件培养基或BDNF，然后免疫沉淀细胞样本(知识产权)抗TrkB抗体。显示了具有代表性的免疫印迹。C–I类，纹状体培养物用对照（PBS）处理，38393瑞典克朗(+SKF公司)DIV6上的K-252a和BDNF。一些文化是之前在37°C中用TrkB-Fc（10μg/ml，20分钟）预培养控制(G公司)，SKF38393(H（H）)或BDNF(我). 这个培养物固定并用抗磷酸TrkB抗体进行免疫染色。

D1受体刺激效应的另一个潜在解释是增加神经营养素的产生。神经营养素被合成为未成熟形态，作为成熟形态从神经元和非神经元细胞(40,41). 我们测试了SKF38393诱导的TrkB磷酸化是由神经营养因子的释放介导的通过在培养基中应用TrkB-Fc(图5，C–I类).TrkB-Fc含有TrkB的胞外结构域，在通过隔离BDNF防止天然TrkB活化(42). 在纹状体培养中，应用TrkB-Fc阻断磷酸化TrkB免疫反应性的增加通过外源性BDNF，但在SKF38393后未能抑制TrkB磷酸化处理(图5，H（H）和我). 这些结果证明TrkBD1受体刺激的磷酸化不是通过释放内源性神经营养素或来自胶质细胞的次级作用。

多巴胺受体可以调节细胞内钙离子浓度（钙²⁺)通过调节细胞外钙²⁺流入和细胞内钙²⁺水池(11–13).评估Ca²⁺TrkB磷酸化由D1受体激动剂(图6),我们用钙螯合剂BAPTA处理纹状体培养物膜透性螯合剂BAPTA-AM和钙离子载体离子霉素。这个应用离子霉素诱导TrkB磷酸化，方式类似于SKF38393。BAPTA或BAPTA-AM的应用取消了单用SKF38393观察到磷酸化TrkB水平。在这些实验中，我们没有发现BAPTA和BAPTA-AM。我们的数据表明钙²⁺受D1受体调节，钙增加²⁺可能参与SKF38393对TrkB受体的反式激活。

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图6。

细胞内钙²⁺TrkB中涉及监管D1受体激动剂的反式激活。治疗纹状体培养带控制，SKF38393(SKF公司)，离子霉素（10μ米)、和DIV6上的BDNF。一些培养物用SCH23390预培养(SCH公司+SKF公司)、BAPTA(BAPTA公司+SKF公司; 10μ米30分钟），或BAPTA-AM(BAPTA-AM公司+SKF公司; 10μ米30分钟）。之后免疫沉淀(知识产权)，对细胞裂解物进行SDS-PAGE磷酸酪氨酸的蛋白质印迹(第页)和TrkB。复制将显示示例。典型免疫印迹(IB公司)如图所示。这个蛋白质水平由独立的微孔测定(n个= 4).^*,第页< 0.05. 这个酒吧注明S.D。

据报道，TrkB表面表达受钙²⁺海马和皮层神经元内流(42–44).从我们的结果来看，细胞内钙与TrkB反式激活有关D1受体激动剂。确定表面TrkB的表达水平在用D1受体激动剂治疗后，我们使用细胞表面纹状体原代培养的生物素化检测(图7，A类和B类). 与SKF38393孵育3小时后，纹状体神经元接受NHS-LS-生物素治疗。之后用亲和素结合珠免疫沉淀，生物素化的TrkB更多在细胞表面检测到(图。7A类). D1受体拮抗剂的预处理，SCH23390降低了SKF38393诱导的生物素化TrkB水平。

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图7。

D1受体激动剂调节表面TrkB的表达。纹状体用对照载体SKF38393处理培养物(SKF公司)、和DIV6上的BDNF。一些培养物用SCH23390预培养(A类,SCH公司+SKF公司)，K-252a(A类)、BAPTA(B类,BAPTA公司+SKF公司)，或BAPTA-AM(B类,BAPTA-AM蛋白+SKF公司)SKF38393之前37°C。文化在冰上与生物素PBS孵育30分钟，然后用放射免疫沉淀分析缓冲液。一半的生物素化蛋白是用亲和素结合珠沉淀，然后进行SDS-PAGE和TrkB的蛋白质印迹。其他样品用于免疫沉淀(知识产权)使用TrkB。将显示重复的样本。典型免疫印迹(IB公司)如图所示。蛋白质水平由独立的微孔测定(n个= 4). NIH对表面生物素化TrkB水平的定量如图所示。^*,第页< 0.05. 这个酒吧注明S.D。C类–H（H），纹状体培养用DIV6上的控制（PBS）和SKF38393。一些培养物是预先培养的带SCH23390(SCH公司+SKF公司)、BAPTA(BAPTA公司+SKF公司)，或BAPTA-AM(调幅+SKF公司)第37页SKF38393之前为°C。培养物固定并用免疫染色兔对照IgG(C类)或TrkB（N末端）抗体(D–H型)没有洗涤剂。代表性图片有提供了。

BAPTA也有类似的抑制作用。预处理BAPTA还降低了TrkB表面表达水平。BAPTA-AM也显示抑制作用，但与对照组相比无显著差异SKF38393治疗(图。7B类). 除了生物素化试验，使用TrkB N末端抗体的免疫细胞化学表明SKF38393提高了TrkB表面的免疫反应性。诱导也是用SCH23390或BAPTA预孵育阻止。BAPTA-AM预处理抑制TrkB表面免疫反应，但程度与BAPTA不同(图7，C–H型).这些数据表明D1受体刺激增加Ca²⁺内流并诱导反式激活和细胞表面表达TrkB公司。

讨论

多巴胺D1受体与G_秒蛋白质和腺苷酸环化酶的激活。G蛋白偶联受体具有多种从内分泌调节到高级行为的功能。在中央神经系统，GPCR不仅能快速调节神经元功能神经递质，也作为慢神经调节剂(15). 呈现的结果这里表明多巴胺能够激活Trk受体与其他GPCR类似的时间过程，如腺苷和垂体腺苷酸环化酶激活多肽受体(17,18). TrkB的激活通过D1的GPCR信号传导发生时没有神经营养素的参与。这个表明多巴胺神经递质能够与神经营养素信号传导，负责神经元。Trk受体也调节离子的表达和活性通道和神经递质受体，因此可以调节突触强度和塑性(36).这些研究表明TrkB和多巴胺D1之间的相互调节受体信号可能有助于正常的脑功能。

受体的表面表达水平在调节它们的信号和功能。杜等人。(43)报告说钙²⁺诱导TrkB向成熟细胞质膜转运海马神经元。目前的数据表明多巴胺D1受体激活不仅增加了TrkB磷酸化，而且增加了TrkB表面通过Ca表达²⁺纹状体神经元发育中的内流。这项工作的发现表明，GPCR引起的受体反式激活事件例如D1受体可能产生不同的生理功能和信号转导机制比直接结合配体受体。

多巴胺是一种主要的神经递质电生理和运动活动。多巴胺也与神经元通过其对轴突生长和生长锥的作用而发育。例如，多巴胺可以促进生长和过程的树状化胚胎纹状体神经元的生长锥(7,8,45,46). 其中许多影响已被归因于D1多巴胺受体活性。我们观察到促进神经元发育（增加神经突起延伸和生长锥数）如图所示）。这些研究表明D1受体对正常人至关重要纹状体神经元在发育过程中的发育。

Jung和Bennett(47)观察到急性可卡因治疗增加新生儿TrkB mRNA纹状体。可卡因对TrkB mRNA的诱导被SCH23390抑制D1受体的特异性拮抗剂。我们的结果显示TrkB蛋白水平的提高在体外(图1)或体内(图3)由D1受体特异性激动剂SKF38393。相反，我们发现TrkB被SCH23390抑制。急性刺激在形式上是可能的D1受体和随后的TrkB转录激活可能参与TrkB的长时间转录和/或翻译。

缺乏D1受体的小鼠表现出生长迟缓，但一般情况下大脑解剖正常。成年突变小鼠纹状体的大小与野生型相比减少了。这些突变小鼠表现出选择性电生理和行为改变(48,49). 这些研究表明发育中大脑中缺少D1受体可能会改变成人的神经传递和行为。在我们的实验中，TrkB和D1受体缺失小鼠纹状体磷酸化TrkB水平改变与野生型相比老鼠。⁴因此，敲除小鼠的多巴胺/多巴胺受体信号转导与野生小鼠不同类型动物。然而，初步分析使得很难确定多巴胺D1受体和TrkB信号转导之间的因果关系。我们的这里的结果表明多巴胺/D1受体信号可以促进BDNF/TrkB活性。已经观察到急性BDNF刺激增加D1R mRNA在体外，并且D1受体mRNA水平在TrkB空小鼠(50).总之，这些研究表明BDNF-TrkB和多巴胺-D1受体纹状体中的信号相互交织并参与神经元的发育通过调节神经营养反应性。然而，进一步的工作将需要充分阐明体内多巴胺对TrkB公司。

神经营养因子在发育过程中调节许多神经元功能以及成人生活和对神经元损伤的反应。因此，神经营养素与多种疾病的病理生理学有关神经退行性疾病和精神疾病神经精神障碍的治疗策略。多巴胺能系统已经对帕金森病进行了研究(22,51)和亨廷顿病(52). 这些相似之处表明神经营养素和多巴胺之间的信号失衡可能是在神经退行性疾病中很重要。

通过其他受体激活神经营养素信号通路系统为神经系统提供了另一种交流机制系统。例如，通过单胺类G起作用的抗抑郁药蛋白偶联受体可导致神经营养素信号增强(53). 结果与多巴胺D1受体提示多巴胺受体激动剂可能是具有神经营养作用的神经退行性疾病的治疗疾病。这种方法将涉及选择性靶向神经元表达特异性GPCR和营养因子受体。

致谢

笔记

^*这项工作得到了National的全部或部分支持卫生拨款研究所NS21072型; 和HD23315型（致M.V。C.）。这项工作也得到了核心基金的资助日本科学与技术的进化科学与技术研究技术机构（致H.N.和I.S.）以及一笔用于促进新泻大学研究项目的拨款（给H。编号）。这篇文章的出版费用部分由支付页面费用。因此，必须在此标记此物品“广告“根据《美国法典》第18卷第1734节只是为了表明这一事实。

脚注

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