化疗后大肠癌干细胞在异种肿瘤中富集

CoCSC高表达ALDH1A1型

在寻找额外的CoCSC标记物时，我们以前使用了一种可以识别造血和神经干细胞群体的工具：ALDH酶活性[30].使用Aldefluo™试剂和ALDH1特异性抑制剂二乙氨基苯甲醛（DEAB）[34]，ESA的一大亚群⁺CD44细胞⁺来自UM-C4和UM-C6肿瘤细胞的细胞被测定具有高ALDH活性(图3A)[30]在其他患者来源的异种结直肠癌细胞系中也进行了类似的观察(图S2)。此外，当ESA⁺CD44细胞⁺细胞根据ALDH活性进行细分，并通过FACS、ALDH进行分离⁺在所有被调查的病例中，细胞都是致瘤的[30]值得注意的是，ESA严格规定了致瘤性⁺CD44细胞⁺ALDH公司⁺UM-C4大肠肿瘤细胞系(图3B)。尽管肿瘤可能来自ESA⁺CD44细胞⁺ALDH公司⁻取自UM-C6、OMP-C5和OMP-C8肿瘤细胞系的细胞[30]，ALDH⁺TG ESA子集⁺CD44细胞⁺迄今为止，所有研究的异种结直肠癌细胞系中都存在细胞（n=6）。相反，CD44亚群⁻具有高ALDH活性的细胞也存在于所有肿瘤系中，但这些细胞在移植时不能产生肿瘤。

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图3

ALDH1酶活性界定了CoCSC的一个亚群。

A类)人类ESA的表型特征⁺UM-C4肿瘤细胞的ALDH1酶活性。Gates为致瘤性研究划分了由FACS分离的肿瘤亚群，其中B类)CD44的生长动力学⁺ALDH公司⁺（红色圆圈），CD44⁺ALDH公司⁻（橙色框）和CD44⁻ALDH公司⁺绘制（绿色三角形）人口。测量结果仅反映出有可触及肿瘤的小鼠。n=3个独立实验的数据代表。C类)Taqman qRT-PCR数据显示ALDH1A1型(1A1号机组),ALDH3A1型(3A1号机组)和ALDH5A1(第51章)来自2个患者来源的异种结直肠癌细胞系（UM-C4和UM-C6）的致瘤（TG；黑色）细胞与非致瘤（NTG；白色）细胞（n≥2）。数据反映平均值±SEM，与GUSB公司并相对于每个基因的UM-C4 NTG表达进行显示。

ALDH酶的一个子集可以氧化细胞毒性CPA代谢物4-HC/醛磷酰胺，从而使其失活[23],[35]细胞质ALDH1和ALDH3的存在，尤其与A549肺癌细胞系中CPA抵抗相关[20],[21].ALDH1（由编码ALDH1A1型)比其相关家族成员ALDH3和SSDH分解代谢4-HC/醛磷酰胺的效率高10倍以上：由ALDH3A1型和阿尔德5a1基因，分别[24]在UM-C4和UM-C6肿瘤的Taqman™qRT-PCR分析中，ALDH1A1型通常表示为高于ALDH3A1型和ALDH5A1型.ALDH1A1型CoCSC的基因表达是NTG细胞的2.8倍，尽管CoCSC中的基因表达略有升高ALDH3A1型CoCSC与NTG人群中的表达(图3C)，它的信息几乎无法在两个肿瘤线上检测到。此外，鉴于阿尔德5a1在UM-C4肿瘤的TG细胞与NTG细胞中略有升高（约1.5倍），其在UM-C6肿瘤的这些群体中的表达相似(图3C)。优先表达ALDH1A1型TG细胞支持在人类ESA中观察到的酶活性测量⁺CD44细胞⁺亚群，其中大多数细胞具有高度的DEAB敏感性，ALDH1活性。当结合ALDH1与ALDH3和SSDH在灭活CPA中间产物方面的10倍的熟练度时[24]有人可能会将这些结果解释为，CoCSC对CPA的抗性可能主要由ALDH1酶活性介导。

ALDH1A1型,MYC公司、和马来西亚令吉富含CPA治疗后残留的TG细胞

自ALDH1A1型TG和NTG细胞中的基因表达增加，具有CoCSC表型的细胞中ALDH1酶活性异常高，这种活性可能介导对CPA的耐药性，我们接下来问ESA的频率⁺CD44细胞⁺ALDH公司⁺与给药载体相比，接受CPA的小鼠UM-C4、UM-C6和OMP-C8肿瘤中的细胞升高。就像CD166中观察到的表型增加一样⁺单元格(图1E,S1B和S1C)、ALDH⁺欧空局亚群⁺CD44细胞⁺CPA治疗组小鼠的细胞数始终高于对照组小鼠（分别为67.6±6.3%和56.8±6.8%；n=5，P（P）<0.012（成对）t吨-测试）(图4A).

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图4

在CPA治疗后，ALDH1活性高的CoCSC更常见。

A类)ALDH比率⁺人类ESA中的肿瘤细胞⁺CD44细胞⁺来自车辆治疗对照组或CPA治疗小鼠的肿瘤人群。数据反映了使用3种不同异种结直肠癌细胞系（UM-C4、UM-C6和OMP-C8）和n≥5只小鼠进行的5项独立实验的配对平均值。B类)使用从（V）载体或CPA治疗的UM-C4肿瘤中分离的TG和NTG群体的标记基因的Taqman qRT-PCR数据。数据表示平均值±SEM（n≥2）。C类)分别对溶媒和CPA治疗小鼠的ALDH1或c-Myc的冷冻或福尔马林固定石蜡包埋肿瘤进行免疫荧光或免疫过氧化物酶染色。黑条=100µm。

许多基因产物被认为对结肠正常发育至关重要，并在结肠肿瘤中广泛表达[36]——[39]从纯度>99%的载体和CPA治疗的UM-C4肿瘤中分离出TG和NTG群体后，通过Taqman™qRT-PCR测定了许多与结直肠癌相关的基因的表达。TG和NTG细胞中差异表达的基因不仅包括ALDH1A1型，如上所述(图3C)，也包括c-Myb(马来西亚令吉)和c-Myc(MYC公司;图4B)。相反，与分化和间充质表型相关的基因[40],[41]例如Vimentin(VIM公司)，在NTG细胞中表达更高。

与残余肿瘤细胞表达高水平致瘤性相关标志物（如CD166）的频率升高一致，CoCSC相关转录物与NTG相关转录物的相对表达，如ALDH1A1型和振动在CPA治疗的对照组UM-C4肿瘤中，这两种方法的差异更大(图4B)。与ALDH1可能在介导CPA抵抗中发挥作用的假设一致，ALDH1A1型具有CoCSC表型的残留细胞中的基因表达进一步升高，但ALDH3A1型和ALDH5A1型不是(图4B&第3章)。此外，先前确定的基因在结肠隐窝底部的上皮干/祖细胞室和肿瘤组织中高度表达(例如MYB&MYC公司)在残留肿瘤CoCSC中的表达高于代表肿瘤主体的NTG细胞群，但这些细胞是由CoCSC生成的，似乎更容易受到CPA诱导的细胞毒性。在CPA治疗后的其他异种肿瘤细胞系中也观察到类似的表达模式，包括UM-C6(图S3).

最后，通过免疫荧光和IHC，CPA治疗的对照肿瘤与车用治疗的对照瘤的基因表达差异与蛋白质表达进一步相关。例如，细胞内ALDH1和核c-Myc水平在CPA治疗的肿瘤中更为普遍(图4C)。有趣的是，在CPA治疗的肿瘤中，ALDH1染色似乎定位于顶端表面，在那里可能被假设为在CPA代谢物进入细胞时拦截其。相反，对照组肿瘤中ALDH1蛋白水平较低且更弥漫。同样，c-Myc明显更集中于CPA治疗小鼠的大肠肿瘤细胞核，这与TG细胞的增加频率一致，并且升高了MYC公司在这个有弹性的人群中表达。

CoCSC对化疗的耐药性并非CPA特有

为了确定CoCSC是否对其他重要的化疗药物也表现出耐药性，我们检测了伊立替康的影响(也称为。SN-38）。实验开始后，荷瘤小鼠每周注射15 mg/kg伊立替康。在大约1周的轻微延迟后，伊立替康阻止了肿瘤生长(图5A)。在化疗开始两周后肿瘤收获后，通过流式细胞术评估剩余CoCSC的百分比。在伊立替康治疗的肿瘤中，与对照小鼠相比，具有CoCSC表型的肿瘤细胞百分比增加了61%(图5B)。接下来，ESA的内在致瘤性⁺CD44细胞⁺CD166型⁺来自载体或伊立替康治疗小鼠的细胞在连续移植环境中进行了测试，而这些细胞没有表型分类为CoCSC。在这些移植的对照组或伊立替康治疗的肿瘤中，观察到CoCSC的摄取率类似，表型分类为“其他”的细胞不会引发肿瘤（数据未显示）。服用伊立替康的小鼠残余肿瘤中CoCSC表型细胞的频率增加，以及具有其他表型的细胞对移植疾病的无能，这些共同表明CoCSC也优先对伊立替肯耐药。

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图5

伊立替康治疗后，CoCSC表型细胞也得到富集。

A类)随机化后，使治疗组在400 mm时正常化^三在第43天，开始每周给药一次载体（绿色盒子）或15 mg/kg伊立替康（红色三角形），每周测量两次肿瘤。显示了代表平均值±SEM的生长曲线。B） 人体ESA百分比⁺CD44细胞⁺CD166型⁺显示了残留肿瘤中的CoCSC表型细胞。数据反映每个治疗组n≥4只小鼠。

CPA抵抗是ALDH1活性高的细胞所特有的

看到ESA⁺CD44细胞⁺肿瘤细胞具有高ALDH活性，ESA的频率⁺CD44细胞⁺ALDH公司⁺CPA治疗的小鼠肿瘤中的细胞增多，并且ALDH1A1型CPA抗性CoCSC中的基因表达升高，因此我们试图确定对CPA的抗性是否由ALDH1酶活性介导。因为ALDH1特异性抑制剂DEAB高度不稳定体内 [42],在体外建立了支持TG大肠肿瘤细胞扩增的培养条件。值得注意的是，最能建立集落的细胞的细胞表型在体外是ESA⁺CD44细胞⁺CD166型⁺（也是CoCSC的），而FACS纯化CD44⁻单元格无法执行此操作（数据现已显示）。为了验证该培养系统支持TG细胞的维持，我们对ESA进行了分类⁺CD44细胞⁺CD166型⁺CoCSC限制稀释到含有丝裂霉素C处理的3T3或MEF饲养细胞作为支架的平板中，具体取决于使用的肿瘤细胞系：UM-C4或UM-C6。在这些条件下，CoCSC的集落形成频率与移植时观察到的TG细胞频率大致相似（～1∶86±33；UM-C4为7，1∶52±5；对于UM-C6，n=3）。在重新植入小鼠体内之前，菌落培养14天，无需传代。细胞不仅维持了ESA、CD44和CD166的表达在体外文化(图6A和B)但产生类似亲代肿瘤的异质性肿瘤的能力也得到了保护(图6C)。验证肿瘤中的肿瘤起始细胞来源于单个在体外集落均类似于亲代肿瘤，来源于单个细胞，UM-C4细胞用携带GFP-荧光素酶的慢病毒转导，生成肿瘤，从ESA获得单个集落⁺CD44细胞⁺CD166型⁺将细胞移植到小鼠体内。从单个集落中获得这些肿瘤后，通过FACS分离具有CoCSC表型的细胞或具有不同表型的所有其他肿瘤细胞，并进行致瘤性和克隆性研究。输入2000个FACS纯化细胞后，CoCSC表型细胞的摄取率为100%，而具有所有其他表型的人类细胞仅产生1个肿瘤（在10只移植小鼠中）；可能是由罕见的CoCSC污染造成的(图6D)。值得注意的是，肿瘤异质性可能是由单个细胞引起的，因为慢病毒转导研究表明，两种ESA⁺CD44细胞⁻(即。NTG）和ESA⁺CD44细胞⁺CD166型⁺(即。CoCSC）细胞具有相同的慢病毒插入位点(图6D插图），但只有CoCSC能够传播肿瘤。这些来源于单个肿瘤的连续移植肿瘤的表型和组织学分析在体外菌落，表明在短期内保持了产生类似于父母UM-C4肿瘤的腺癌的能力在体外在这些条件下培养(图6E&F).

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图6

体外CoCSC的维护和扩建。

人类ESA⁺CD44细胞⁺CD166型⁺将细胞以限制性稀释进行铺板，并在无血清维持条件下培养14天。然后分析结直肠肿瘤集落A类)IHC的ESA表达，或B类)流式细胞术检测ESA、CD44和CD166的表达。C类)单个集落衍生肿瘤的细胞表型，显示人类ESA⁺表达CD44和CD166的细胞亚群。D类)肿瘤生长曲线显示了2000个CoCSC表型细胞或具有所有其他表型（other）的同等数量的细胞，这些细胞是从在体外克隆衍生肿瘤（肿瘤/注射动物）。插图显示通过逆转录聚合酶链反应获得的慢病毒插入带1)人类异种移植瘤细胞，2)欧洲航天局⁺CD44细胞⁺CD166型⁺（CoCSC）单元或三)欧洲航天局⁺CD44细胞⁻（其他）由FACS分离的细胞。连续移植CoCSC的单细胞源性肿瘤的表型和形态学分析表明E类)表型和F类)异种结直肠癌的组织学组成维持在以下时间在体外限制稀释的文化。黑条=100µm。

检测CPA抵抗是否由ALDH1酶活性、UM-C4或UM-C6结直肠肿瘤细胞集落介导在体外在3-4天的过程中，在没有或包括不同浓度的ALDH1特异性抑制剂DEAB的情况下，暴露于生物活性CPA代谢物4-HC中4小时。在DEAB缺席的情况下，EC₅₀4-HC的浓度为～60µg/mL(图7A)。ALDH1活性的抑制导致对4-HC介导的细胞死亡的敏感性增加，如EC₅₀分别在30µM和100µM DEAB存在下，转移至43µg/mL和6µg/mL。与DEAB一样，全反式维甲酸（ATRA）已被证明可降低ALDH酶活性；然而，它是通过降低ALDH1和ALDH3蛋白水平来实现的[43]与DEAB一样，用1µM ATRA预处理使结直肠肿瘤集落对4-HC敏感（n＝3；P（P）<0.015) (图7B)。令人惊讶的是，ATRA预处理和同时接触DEAB可协同提高化疗敏感性（n=3；P（P） = 0.003). 优先ALDH1A1型CoCSC中的基因表达和大肠肿瘤细胞通过抑制ALDH1对4-HC的敏感性，共同强烈表明ALDH1酶活性介导CPA抵抗。

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图7

ALDH1酶抑制在体外使大肠肿瘤细胞对CPA敏感。

体外人类大肠肿瘤细胞暴露4小时后的细胞活性测定A类)不同浓度的4-HC和/或ALDH1特定抑制剂DEAB，或B类)在存在或不存在75µM DEAB和/或1µM ATRA的情况下，20µg/mL 4-HC。C） 在存在或不存在75µM DEAB的情况下，暴露于不同浓度的伊立替康7天后的细胞活力测量。所有数据均表示为三次测量的平均值±SEM，并与载体处理的对照进行归一化。所有数据均代表使用UM-C4或UM-C6肿瘤细胞的n≥2个独立实验*P<0.015**P=0.003。

上述观察结果提出了一个问题，即高ALDH1酶活性是否也会导致对伊立替康的耐药性。接下来，我们建立了大肠肿瘤细胞集落，并在75µM DEAB存在或不存在的情况下，将其暴露于伊立替康系列稀释液中一周；已知能有效抑制ALDH1活性的浓度。与4-HC相比，尽管存在DEAB，伊立替康的细胞毒性特征没有改变(图7C)表明CoCSC对伊立替康的固有抗性是通过ALDH1酶活性以外的机制发生的。值得注意的是，无论是DEAB还是等量的载体（95%乙醇的1∶200稀释）在延长培养（7天）期间均未显著降低增殖或存活率，这表明ALDH1活性仅在化疗环境中至关重要。

组织分解和细胞制备

将肿瘤组织切成微小碎片（～2 mm^三)，然后用300 u/mL胶原酶、100 u/mL透明质酸酶、0.5 mg/mL Dispase和100 u/mL DNAseI（均得自干细胞技术公司；不列颠哥伦比亚省温哥华市）在37°C/5%CO下酶消化1小时₂用间歇吸管分散细胞。然后通过70µm和40µm筛网依次过滤细胞，然后用过量的FACS缓冲液（1×Hanks缓冲盐溶液[HBSS]、2%热激活胎牛血清[FCS]和25 mM HEPES[pH 7.4]）清洗。在短时间接触氯化铵期间，对红细胞进行溶解，并用过量的FACS缓冲液再次清洗。

流式细胞术和细胞分选

所有分析和细胞分离均使用新分散的细胞悬浮液进行。抗体染色在4°C的FACS缓冲液中进行30分钟，密度为1×10⁷本研究中使用的抗体包括：抗小鼠H-2K^d日（SF1-1.1；BD Pharmingen）、抗小鼠CD45（30-F11；BioLegend）、抗人ESA（HEA-125；Miltenyi Biotec）、抗鼠/人CD44（IM7；eBioscience）、抗人类CD49f（GoH3；BD Pharmingen）和抗人CD166-PE（105902；研发系统）。Aldefluo™试剂从StemCell Technologies购买，并按照制造商说明使用。在所有实验中，细胞对小鼠谱系标记（mLin）染色阳性⁺; H-2K型^d日和鼠CD45）在使用Cy5.5PE标记的抗体的流式细胞术期间被排除。使用活性染料DAPI排除死细胞，使用双重区分门控排除细胞加倍和聚集。在注射用于致瘤性研究之前，通过连续流式细胞术分析确认FACS纯化细胞的细胞表型和活性。纯度通常大于99%。

致瘤性实验

以900 rpm×5 min的速度轻轻离心后，将细胞重新悬浮在每只小鼠50µL的FACS缓冲液中，并与Matrigel（BD Biosciences）混合1∶1，然后在小鼠全身麻醉时皮下注射到下腹部。每只小鼠只产生一个肿瘤。每天监测健康状况，每周使用数字卡尺测量肿瘤生长，持续4个月。当肿瘤超过1500毫米时，对动物实施安乐死^三或达到120天的时间点。肿瘤生长的统计分析仅包括那些可触及肿瘤的小鼠（平均值±扫描电镜）。

化疗方案

雌性小鼠植入mLin⁻欧洲航天局⁺CD44细胞⁺细胞（每只小鼠400个）。一旦可触及，每周对肿瘤进行两次测径，并根据其长度和宽度计算肿瘤体积，公式如下：V=（长度×[宽度]）²/2.肿瘤达到～400mm时^三，小鼠被随机分为对照组和治疗组，对照组接受载体（无菌水），治疗组接受CPA腹腔注射，剂量为38 mg/Kg，每周两次。伊立替康在PBS中稀释，并以15 mg/kg的剂量每周给药一次。

免疫组织化学

使用针对Ki-67（Vector Laboratories，目录号VP-RM04）和c-Myc（DAKO，目录号M3570）的单克隆抗体对福尔马林固定石蜡包埋组织进行免疫组织化学研究。简单地说，对4µm厚的石蜡切片进行脱蜡和水合处理。使用Biocare的脱粘室，在pH 9.0的0.1M Tris-Cl中进行抗原提取。然后用3%过氧化氢孵育切片以阻断内源性过氧化物酶活性，并在室温下用1∶50稀释的一级抗体孵育1小时，然后用ImmPRESS抗鼠或抗兔Ig（过氧化物酶）检测，然后用Vector®NovaRED™底物进行可视化（Vector Laboratories）。苏木精用于反染色。使用原位细胞死亡检测™试剂盒（Roche）进行TUNEL染色。对于ALDH1（Abcam）的免疫荧光染色，冷冻切片用−20°C冷甲醇固定10分钟，然后进行封闭步骤。切片在室温下用1 ug/ml的ALDH1孵育1小时，并用与Alexa Fluor 488结合的抗鼠抗体进行可视化。使用抗半抗原IgG作为阴性对照，并用含有抗褪色剂的长效金DAPI（Invitrogen）固定。

体外试验培养与细胞毒性研究

如上所述，在组织分解后，使用磁珠去除小鼠系细胞的细胞悬浮液，并在无血清Medi-D（3∶1低血糖DMEM:F-12培养基、B27补充剂、ITS-X、Pen/Strep【全部来自Invitrogen】中以每孔约20000个细胞的密度将其镀在96周Primaria（BD Bioscience）板中和0.5µg/mL氢化可的松[干细胞技术]），补充20 ng/mL bFGF和EGF、5 u/mL肝素和1×10⁶u/mL LIF。电镀后，在室温下以500 rpm轻轻旋转板材5分钟，以促进附着。培养时在体外在7天多的时间里，每周更换一次媒体。

对于细胞毒性研究，细胞在37°C/5%CO下培养3-4天₂/5%O₂，去除未附着的细胞，并用含有4-羟基环磷酰胺（4-HC；从杜克大学医学中心OM Colvin博士获得）、二乙氨基苯甲醛（DEAB；Sigma）、伊立替康或它们各自的载体的培养基代替培养基。在使用4-HC的研究中，细胞仅暴露4小时，之后去除培养基，用PBS洗涤细胞两次，并加入新鲜的medium-D。在涉及ATRA的实验中，细胞在暴露于DEAB和/或4-HC之前预先培养过夜。然后使用CellTitre-Glo（Promega）在4-HC研究治疗20小时后或添加伊立替康1周后评估细胞活力。

我们感谢S Benner博士深思熟虑的观察和批评，感谢斯坦福大学医学院的P Dalerba博士和R Cho博士的洞察力和评论，感谢G Wong博士的技术专长。我们还感谢杜克大学医学中心的OM Colvin博士和S Ludeman博士提供4-HC以及关于其使用的建设性建议。