材料和方法
果蝇菌株和培养
所有菌株在标准培养基上保持在22–25°C。在解剖和热休克之前,给苍蝇喂湿酵母糊1-2天。卡内基蛋白陷阱库中的库存(Buszczak等人,2007年)在中列出.克隆分析的股票是通过重组到上面w;新FRT82B(布卢明顿库存)。卡箍1HCHPZ00451页,划线器KG04161号、和tmod(tmod)PZ00848页由伯克利果蝇基因组项目产生(Bellen等人,2004年)。卡箍1HCHd00634号,Fer1HCH公司1958年1月,拉布11d04643号,拉布11电子03152,划线器c00019号,划线器f02351电话,tmod(tmod)电话00674、和tmod(tmod)f04997年是从哈佛Exelixis收藏中获得的(Thibault等人,2004年)。拉布11E(至)3(Jankovics等人,2001年)和划线器1 FRT82B型(Bilder和Perrimon,2000年)如前所述。有关这些等位基因和本研究中使用的其他基因库的更多详细信息,请访问FlyBase(http://flybase.bio.indiana.edu/)。
表1
| 基因 | 线路 | 相关蜂窝组件 | 时态类 | 雄性镰刀菌 |
---|
1 | tmod(tmod) | CC00416号 | 皮质细胞骨架 | 组织的 | Y(Y) |
2 | 第1部分 | CC01981号 | 质膜微管相关复合物 | 早期 | Y(Y) |
三 | 蒸汽发生器 | CA06683号 | MT相关复合物 | 早期 | Y(Y) |
4 | 划线器 | CA07683号 | 质膜、隔膜连接、细胞质 | 早期 | Y(Y) |
5 | Crc公司 | CA06507号 | 内质网腔 | 中间 | Y(Y) |
6 | Pdi公司 | CA06526号 | 内质网腔 | 中间 | Y(Y) |
7 | l(1)G0320 | CA06684号 | 易位子复合体 | 中间 | Y(Y) |
8 | 秒63 | CA06603号 | 易位子复合体 | 中间 | Y(Y) |
9 | 第61节α | CC00735号 | 易位子复合体 | 中间 | Y(Y) |
10 | 冲浪4 | CC01684号 | ER膜 | 中间 | Y(Y) |
11 | Rtnl1号机组 | CA06523号 | 平滑ER小管 | 中间 | N个 |
12 | Tsp42Ee类 | CC01420号 | 内膜 | 中间 | N个 |
13 | 第94章 | 川B04973 | ER、MT细胞骨架、蛋白酶体 | 迟到 | N个 |
14 | tral公司 | CA06517号 | ER出口站点 | 迟到 | N个 |
15 | Vha16型 | 电话:06708 | 亚细胞小泡、缝隙连接 | 中间 | N个 |
16 | Fer1HCH公司 | CA06503号 | 分泌囊 | 中间 | N个 |
17 | 拉布11 | CA07717号 | 再循环内体 | 中间 | N个 |
18 | Cp1型 | CC01377号 | 溶酶体 | 中间 | N个 |
19 | Sap-r公司 | CA07241号 | 溶酶体 | 迟到 | N个 |
20 | CG12163号 | CC00625号 | 溶酶体 | 迟到 | N个 |
表2
阿勒 | 纯合表型 | 生育率 | 融合体表型 |
---|
tmod(tmod)电话00674 | 致命的 | 肥沃的 | 正常 |
tmod(tmod)f04997年 | 致命的 | 肥沃的 | 正常 |
tmod(tmod)PZ00848页 | 致命的 | 肥沃的 | 正常 |
划线器1 | 致命的 | 肥沃的 | 正常 |
划线器c00019号 | 致命的 | 肥沃的 | 正常 |
划线器f02351电话 | 致命的 | 肥沃的 | 正常 |
划线器KG04161号 | 致命的 | 肥沃的 | 正常 |
Fer1HCH公司CA06503号 | 致命的 | 肥沃的 | 正常 |
Fer1HCH公司d00634号 | 致命的 | ND(无损检测) | 正常 |
Fer1HCH公司1958年1月 | 致命的 | ND(无损检测) | 正常 |
卡箍1HCHPZ00451页 | 致命的 | 肥沃的 | 正常 |
拉布11d04643号 | 致命的 | 不育的 | 有缺陷的 |
rab11电子03152 | 致命的 | 不育的 | 有缺陷的 |
拉布11E(至)3 | 致命的 | 不育的 | 有缺陷的 |
有丝分裂克隆诱导和育性测定
为了产生带有阴性标记的克隆,雄蝇携带对照和重组FRT82B型染色体交叉到hs-FLP;FRT82B Ubi-GFP/TM3型处女。收集这些杂交后代,在克隆诱导前喂湿酵母糊2-4天。在37°C的循环水浴中,通过两次45分钟的热冲击在成人体内诱导克隆。室温下一到六小时的恢复期将热休克治疗分开。热休克后,将苍蝇放入装有湿酵母糊的新鲜小瓶中,酵母糊每1-2天更换一次。为了使用显性不育技术产生克隆,基因型的雄性hs-FLP;FRT82B ovo公司第1天/TM3公司与携带对照和重组病毒的雌性杂交FRT82B型染色体。通过一小时的热休克处理在该杂交的成年后代中诱导克隆。然后将热休克的雌性交配到对照组(y,里506)男性和生育能力得分。非热休克雌性用作克隆诱导的对照。
免疫染色和荧光显微镜
如前所述,对卵巢进行固定和免疫染色(Kai和Spradling,2003年). 在以下稀释液中使用主要抗体:兔抗GFP(1:1000–1:5000;Torrey Pines);单克隆抗体1B1(抗Hts)(1:20–1:50;发育研究杂交瘤库,DSHB);防涂鸦(1:1000)(比尔德和佩里蒙,2000年); 抗Tropomodulin(1:1000;雨果·贝伦的礼物);防拖车挂接装置(1:1000)(Wilhelm等人,2005年); 抗Rab11(1:500)(Dollar等人,2002年); 反阿尔法光谱(1:500)(Dubreuil等人,1987年); 抗E-钙粘蛋白(1:40,DSHB);反犰狳(1:40,DSHB)。以1:200的浓度使用AlexaFluor-conjugated二级抗体(分子探针)。用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)标记细胞核。样品安装在Vectashield(Vector Laboratories)中。在徕卡SP2共焦显微镜上采集图像。
通过分别比较GFP通道和Hts通道对每条线的时间表达进行评分。通过测定至少有一个标记(GFP)的样本中的生殖细胞数量来进行生殖系干细胞分析−)种系干细胞占样本中种属总数的百分比。
结果
蛋白质捕获法鉴定候选融合体蛋白
为了鉴定融合体的新蛋白成分,我们筛选了卡内基蛋白陷阱文库(Buszczak等人,2007年). 每个文库菌株都含有一个不同的单一基因,该基因在其正常染色体位置与GFP融合。插入的GFP外显子的确切位置,以及融合RNA的结构通常是已知的。我们最初检测了活卵巢组织中GFP的表达,但最终证明固定材料的免疫荧光染色更敏感。我们选择了GFP在融合体中表达丰富的株系,即使其他细胞隔室也被标记,或者融合体表达仅限于一个发育期。为了验证表达和融合体相关,使用GFP和Hts特异性抗体进行了双标记免疫荧光实验。最终,在244个独特的蛋白陷阱系中,有20个(8.2%)被鉴定为富含镰刀菌素的表达(,)。
携带基因融合株的卵巢GFP表达。每个面板都显示了一个细菌库,如并染色GFP(绿色)和Hts(洋红色)。共同定位区域用白色表示。A、D和N中的插图是Hts(洋红)染色的梭形体和指示蛋白质的抗体(绿色)的图像。M中的插图是方框区域的放大图。所有图像都是z轴的投影,选择z轴可以包括生殖囊肿发育的多个阶段。表达式模式()是通过比较多个生殖道中分离的通道而不是从这些合并的投影中确定的(参见例如)。Scele棒:10μm。
我们鉴定了六种先前已知的定位于融合体的蛋白质,有力地支持了我们方法的有效性。这些蛋白质是:PAR-1、PDI、Sec61alpha、Rtnl1、TER94和Rab11(). 14条线路被困果蝇属在其他生物体中具有紧密同源物的蛋白质,但以前与融合体没有关联。我们使用特定抗体来验证GFP表达模式的准确性和这些株系样本中的融合子富集,包括肌钙蛋白(tmod),拖车挂接装置(tral)和涂鸦(,插图)。在每种情况下,GFP模式和抗体染色模式紧密对应。我们的结果表明,与之前已知的蛋白质相比,雌性融合体含有更大、更多样的蛋白质组。
融合体组成的发育变化
表达模式表明,在卵泡发育过程中,融合体的组成发生了变化。观察到四种常见的表达类型(). 原调节素蛋白代表一类,从GSC融合体(称为光谱体)到出芽卵室中的融合体残余物都有组成性表达(). PAR-1、Shaggy和Scribble这三种“早期”类蛋白质主要在光谱体和生长囊肿的融合体中表达(). 尽管Shaggy和Scribble在囊肿的其他部位仍然存在,但它们在16个细胞囊肿中急剧下调,在2a区之后的梭形体中不再被检测到。众所周知,当干细胞子代离开生态位时,类ER小泡的密度会增加(Lin等人,1994年). 早期融合体基因可能参与仅限于干细胞和生殖细胞发育初始阶段的过程。
第三类是“中间”蛋白,包括许多ER相关蛋白,在新完成的16个细胞囊肿中显示出融合体富集的峰值(). 当囊肿到达2b区时()这些蛋白质的水平下降了。最后一类“晚期”成分包括蛋白酶体成分TER94、溶酶体蛋白Sap-r和CG12163(组织蛋白酶F)(). 阶段特异性蛋白水解可能对融合体和环状管的发育很重要。最近的工作表明,必需的融合体蛋白Ovo-Hts被裂解产生主要的融合体成分和环管蛋白HtsRC,该蛋白仅在较老的囊肿中稳定(Petrella等人,2007年). 这些观察结果表明,与融合体的差异蛋白结合可能介导在2b区囊肿内发生的融合体大小和结构的改变。
雄性和雌性融合体的组成不同
为了比较男性和女性融合体的组织结构,我们分析了融合蛋白在果蝇属睾丸。与之前一样,通过比较GFP标记水平和Hts染色水平来确定融合体富集(和). 在雄性融合体中也存在原体素和早期蛋白质。这些基因在雄性生殖细胞发育过程中的时间表达模式与雌性生殖细胞中的表达模式密切相关。因此,在男性发育过程中,Tmod存在于梭形体中,而PAR-1的表达仅限于有丝分裂生殖细胞的梭形体(). 这些结果强调了雄性和雌性生殖系囊肿形成的类似过程。
携带基因融合的菌株中睾丸GFP的表达。每块面板显示睾丸尖端,前部位于左侧。(A-F)合并图像,显示睾丸被标记为指示的捕获基因(绿色)和Hts(洋红色)。(A′-C′,E′-F′)GFP通道单独出现在相应的图中。(B-B′)PAR-1在早期的梭形体中表达,但在晚期的梭形体内不表达(箭头所示)。(C-C′)Fer1HCH在雄性融合体中没有富集(箭头)。(D-D′)CG12163(组织蛋白酶F)标记位于融合体附近的大细胞质点,通常位于融合体内的“孔”中(箭头,插图)。(E-E′)PDI与年轻的分支梭形体有关(箭头)。(F-F′)Rtnl1在雄性梭形体中没有特异性富集(箭头)。A-D中的比例尺:25μm。E-F中的比例尺:10μm。
融合体的推测内体成分表现出不同的行为。这些蛋白质都不存在于雄性梭形体中(,). 然而,在这两种蛋白质中观察到一种有趣的定位模式,即皂苷相关蛋白和CG12163(组织蛋白酶F)。虽然这两种蛋白都不存在于融合体本身,但它们都存在于与其直接相邻的大细胞质点中。其中一些点部分被融合体材料包围(,插图)。
雄性比雌性含有更少的内质网相关融合体成分。例如,ER管腔大小的伴侣蛋白PDI和Crc,以及转座子及其相关蛋白的成分都富集在雄性融合体中(,数据未显示),但其他ER蛋白没有。男性融合体中最显著的缺失是Rtnl1,这是一种平滑内质网小管的标记,在女性中具有高度的融合体特异性(比较和). 这些结果表明,虽然雄性梭状体可能含有功能性内质网成分,但它们缺乏蛋白质,而在雌性梭状体中,这些蛋白质只是被运输到卵母细胞,而这一过程在雄性中并不发生。
Tropomodulin对融合体的结构和功能是可有可无的
为了解决新鉴定的融合体基因在成人生殖细胞中的功能,我们利用FLP-FRT系统生成纯合突变克隆(和). 将每个基因的多个独立衍生的等位基因重组到FRT染色体上并进行测试。等位基因之间的表型一致可能是该基因的特征,而不是源于背景染色体损伤。此外,占主导地位的女性不育技术(周和佩里蒙,1996年)用于解决突变生殖细胞产生可育卵的能力()。
新融合体蛋白的生殖系克隆分析。的种系克隆tmod(tmod)PZ00848页(A-B),划线器1(C-D)或Fer1HCH公司d00634号(E-F)在诱导后16天显示。(A、C、E)融合体结构不受Tmod、Fer1HCH或Scrib种系损失的影响(比较突变囊肿中的圆圈融合体和指示野生型融合体的箭头)。Hts(洋红色),GFP(绿色)。克隆缺乏GFP表达。仅(A′,C′,E′)Hts通道。(B,D,F)在所有三种测试基因型中,卵泡发育正常。带有突变生殖系的10期卵泡显示,每个卵泡正好包含15个护理细胞(15N)和一个后卵母细胞(OOC)。DNA(蓝色),GFP(绿色)。A中的标尺:10μm,C中的标杆:50μm
我们选择了tmod(tmod)用于初步研究的基因,因为它编码一种膜骨架蛋白同源物,我们预期其功能类似于融合体中的Hts或Alpha-Spectrin。我们测试了三个致命的克隆tmod(tmod)不能相互补充或区域缺失的等位基因(和数据未显示)。从所有三个等位基因产生的克隆显示缺乏Tmod抗体染色(数据未显示),但在融合体结构中未显示任何缺陷(). 此外,tmod(tmod)突变生殖细胞囊肿含有15个完整的滋养细胞和一个卵母细胞()在卵子发生的所有后期,发育均正常。此外,所有三个测试tmod(tmod)等位基因产生纯合子生殖系克隆,可产生可育卵(). 因此,尽管它在红细胞膜骨架中是必需的(Chu等人,2003),Tmod对卵子发生是可有可无的。
融合体中不需要Scrib和Fer1HCH
这个乱涂乱画该基因编码一种蛋白质,其作用是维持上皮细胞的极性和完整性,在卵泡细胞中对这些目的至关重要(Bilder等人,2000年). Scribble表达对早期融合体的时间限制类似于另一种上皮极性基因PAR-1(Doerflinger等人,2003年). PAR-1的缺失不会干扰囊肿的形成,但需要稍后才能维持卵母细胞的测定(Cox等人,2001年). 我们分析了四种不同的划线器生殖系和体细胞克隆中的等位基因(,). 尽管所有测试的等位基因都显示了先前特征的卵泡细胞表型(Bilder等人,2000年),生殖细胞突变划线器发育成可生育的卵子(). 所有测试的生殖系克隆划线器等位基因引起含有正常融合体的囊肿()产生含有15个护理细胞和一个后定位卵母细胞的卵泡(). 因此,与卵泡细胞不同,卵泡细胞需要划线器为了防止肿瘤的形成,生殖细胞在没有生殖细胞的情况下正常发育。
这个铁蛋白1重链同系物(Fer1HCH公司)基因编码一种在铁储存中起作用的保守蛋白质复合体的重链(综述于Hentze等人,2004年). 在果蝇属,铁蛋白在血淋巴、中肠中积累和储存铁的特殊细胞中高表达,在包括卵巢在内的许多其他组织中低水平表达(Georgieva等人,2002年). Fer1HCH富含高尔基体和中肠内质网(Missirlis等人,2007年). 我们分析了该基因中的四个隐性致命插入(),所有这些都未能相互补充,或者该地区存在不足(数据未显示)。缺乏每个等位基因的生殖细胞具有正常的梭形体、囊肿结构和卵母细胞测定(). 使用卵圆D类生殖系克隆技术(). 因此,至少一些显著的细胞骨架、极性和膜相关的融合体蛋白不需要用于融合体形态或功能。
融合体结构、囊肿生成和GSC维护需要Rab11
细胞化过程中再循环的内体GTPase Rab11的功能(Riggs等人,2003年; Pellisier等人,2003年),Notch信号(Emery等人,2005年),钙粘蛋白回收(Langevin等人,2005年)和卵母细胞极化(Dollar等人,2002年;Jankovics等人,2001年). 我们检测了三种不同隐性致死的有丝分裂克隆拉布11等位基因,以便更好地了解融合体的再循环内体成分。所有等位基因都导致纯合克隆中融合体中Rab11的表达显著降低(). 与之前研究的基因相比,拉布11突变生殖细胞在克隆诱导后8天开始出现明显缺陷。突变囊肿的细胞数量减少。与野生型囊肿中发现的正常16个细胞不同,在克隆诱导后12天,生殖道2区的突变囊肿平均每个囊肿12.4个细胞(N=25)。此外,拉布11-缺陷囊肿比野生型更圆,不能正常移出生殖病院(). 它们的融合体通常在形态上有缺陷,分枝减少,融合体材料的圆形聚集体积聚(,箭头)。因此,拉布11是正常的融合体结构和囊肿形成所必需的。
Rab11是卵子发生(A)早期事件所必需的,在克隆诱导7天后解剖Germarium,并对GFP(绿色)和Rab11(洋红色)进行染色。(A′)仅Rab11通道。拉布11突变体克隆显示Rab11蛋白表达量减少(比较圆形突变体囊肿和指示野生型囊肿的箭头)比例尺:10μm。(B-C)保险丝盒拉布11突变克隆畸形。在克隆诱导12天后,将马赛克生殖细胞解剖,并对其进行克隆标记(绿色)、Alpha spectrin(C中的品红色)或Hts(D中的品黄色)染色。箭头指示突变囊肿中的融合体。(E) 生殖系干细胞半衰期减少拉布11突变体。含有标记GSC的种胚的百分比在克隆诱导后相对于时间绘制。所有三个测试的GSC克隆拉布11与野生型对照相比,等位基因(d04643,灰色;e03152,红色;E(至)3,蓝色)的半衰期缩短了约4倍(FRT82B型,黑色)和代表性等位基因tmod(tmod)(f04997,金色),划线器(c00019,粉红色),以及Fer1HCH公司(PZ00451,绿色)。
我们注意到拉布11突变体GSC经常丢失,所以我们测量了它们与野生型对照组和缺乏非必需融合体蛋白的GSC相比的半衰期。克隆诱导四天后rab11和对照组GSC的频率相似(). 然而,在接下来的两周内拉布11对于任何其他测试基因型,GSC的丢失速度大约是野生型GSC或纯合型GSC的四倍(). 卵巢比例下降拉布11突变型GSC是由于干细胞丢失,因为许多只有野生型GSC的卵巢继续含有下游突变囊肿和卵泡()。
rab11 GSC缺失与融合体膜减少相关
两种可能的机制可以解释拉布11突变体GSCs。鉴于Rab11在钙粘附素循环到质膜中的已知作用果蝇属(Langevin等人,2005年),将GSC固定在体细胞帽细胞上的粘附连接(Song等人,2002年)可能会受到影响(Bogard等人,2007年). 然而,我们观察到96%(n=25)的GSC-cap细胞边界处的E-cad数量没有明显变化,抗体染色可检测到这种变化拉布11在克隆诱导七天或更长时间后检查GSC(). 犰狳(Beta-catenin)的定位在拉布11GSC公司(). 因此,如果粘附改变是GSC丢失的原因,那么这种情况一定会突然发生,因为所有检查过的GSC都保留着与帽细胞的正常连接。
Rab11是融合体中小泡堆积所必需的,但不是粘附结合处E-cadherin积聚所必需的。(A-A′)拉布11在克隆诱导7天后,用E-cadherin抗体标记花叶病菌。E-钙粘蛋白(品红色)、GFP(绿色)。箭头表示E-cad定位到GSC/cap单元边界。(B-B′)拉布11克隆诱导9天后,用犰狳抗体标记花叶病菌。箭头表示Arm到GSC/cap单元格边界的定位。犰狳(洋红色),GFP(绿色)。比例尺:10μm(C-E)所示基因型GSC融合体(“分光体”)的电子显微照片。光谱体来自拉布11与对照组相比,突变体GSC包含的囊泡结构(D,E)数量大大减少(C.比例尺:1μm)。
再循环内体通过对膜配体和受体的作用,在细胞间信号传递中发挥关键作用。我们使用电子显微镜检查了马赛克种属中的GSC,以寻找膜运输中的缺陷,这些缺陷可能表明循环内体功能受到干扰。在两个不同无性系的种子花叶病毒中拉布11等位基因,我们在许多GSC的融合体膜中发现了独特的缺陷。这些梭状体中的管状软骨结构数量显著减少(),在对照种中未观察到的表型(). 这些观察结果表明,活性膜再循环是维持分光体正常膜含量所必需的。膜亏损的分光体可能无法支持维持GSC所需的信号。
讨论
动态融合体
先前对融合体的研究集中在其在种系囊肿形成、细胞同步、细胞骨架极化和卵母细胞确定中的关键作用上。对所有这些过程至关重要的事件发生时,融合体仍在区域1中生长。我们的研究支持这样的观点,即生长中的和完成的融合体在结构上不同。可能参与融合体细胞骨架和微管组织活动的蛋白质在早期表达,而与蛋白水解和卵母细胞测定相关的蛋白质开始在新完成的囊肿的融合体中富集。这表明,融合体在囊肿形成和生殖细胞发育的后续阶段发挥着不同的作用。
囊泡发育完成后,融合体中溶酶体蛋白酶(如Sap-r和组织蛋白酶F)的上调表明,发育调控的蛋白水解至少介导了融合体结构中的某些变化。首先,融合体和环状管的关键成分,如Hts蛋白亚型,是从一个大的前体以一种在囊肿完成后改变的方式进行蛋白质水解处理的(Petrella等人,2007年). 其次,融合体的部分降解,尤其是在环道附近,可能会打开这些细胞间桥梁,并允许特定的分子货物和细胞器开始流向卵母细胞。这一过程不仅可以清除阻塞环形管的蛋白质,还可以使微管马达进入融合体内稳定极化微管的底层核心(Grieder等人,2000年;Röper和Brown,2004年)。
融合体包含特定的内吞室
我们观察到融合体内多个囊泡室的蛋白质成分。这些标记包括内质网膜、溶酶体、分泌囊泡的跨膜和腔标记,以及内质体成分的再循环标记。融合体可能是早期生殖细胞内高尔基体后囊泡运输的一个位点,可能类似于上皮细胞的顶下隔室(Hoekstra等人,2004年). 高尔基体本身位于附近,但被排除在融合体之外(金,1970年; 数据未显示)。
我们的实验提出了两个可能的原因,即囊泡隔室对融合体的非随机定位。首先,这些小泡可能参与在生殖细胞发育过程中执行与融合体相关的功能。细胞周期同步需要完整的融合体,定位可能确保溶酶体、内吞和分泌事件在整个囊肿中同步。虽然新形成的16细胞囊肿中减数分裂前S期的开始可能是同步的,但随后的细胞周期事件似乎并没有紧密协调。同步性丢失的方式可能与囊肿完成后发生的融合体结构变化相对应。
第二个原因是多个小泡隔室与融合体相关,这可能与后期融合体作为向卵母细胞输送物质的主要途径的作用有关。许多囊泡成分,特别是那些在后期富集的成分,可能只是在运输过程中。中心体(马霍瓦尔德和斯特拉斯海姆,1970年;Grieder等人,2000年;Bolívar等人,2001年),线粒体(考克斯和斯普拉德林,2003年)、和高尔基元素(考克斯和斯普拉德林,2003年)在2区囊肿中均沿融合体运输。我们的研究现在表明高尔基体后的内吞小室也在运输中,我们发现其中许多对卵子形成的完成并不重要。融合体内Fer1HCH的鉴定,一种参与铁储存和运输的保守蛋白质,通常支持这种解释。它可能会螯合铁,最终在卵母细胞内储存和使用,而不是在fusome中发挥作用。
融合体中膜骨架蛋白的组织
脊椎动物红细胞膜骨架的分子模型长期以来一直是思考融合体细胞骨架成分结构的起点。跨膜蛋白与质膜和膜骨架相结合,将两者连接在一起,使底层蛋白骨架形成质膜并提供刚性。同样的机制被认为可以控制高尔基元素的形状。因此,推测存在融合体骨架,单个囊泡元素可能以类似方式与这些蛋白质连接。编码膜骨架同源基因的基因突变引起的融合体完整性的急剧破坏鼓励了这种观点(Lin等人,1994年;de Cuevas和Spradling,1996年). 这里描述的研究是关于肌钙蛋白现在质疑这个模型。
Tropomodulin与Adducin一样,是一种肌动蛋白帽蛋白(韦伯等人,1994年). 当Adducin覆盖红细胞皮层细胞骨架中肌动蛋白丝的倒刺端时,原调节素定位并绑定尖端(在中查看贝内特和贝恩斯,2001年). 淘汰赛tmod(tmod)大大降低小鼠红细胞前体细胞的膜稳定性(Chu等人,2003年). 相比之下,我们发现融合体中Tmod的丢失不会导致融合体稳定性或其他方面的囊胚细胞和卵泡发育发生明显变化。
有几种方法可以使这些差异合理化。Tmod的作用可能不同于果蝇属和哺乳动物。也许除Tmod外的其他蛋白质调节着果蝇属另外,融合体中膜骨架蛋白的基本结构可能与哺乳动物红细胞中的不同。无论是什么原因,它可能不仅适用于融合体,也适用于上皮细胞的膜骨架。颠覆性tmod(tmod)抗Hts染色证明,卵泡内的细胞不会影响其膜骨架,也不会影响细胞活力。尽管它在生殖细胞和滤泡上皮中都是可有可无的,tmod(tmod)中的突变果蝇属是致命的,这表明这种蛋白质在其他组织中发挥着重要作用。
融合体结构中的性别二型性
我们的研究还表明,男性和女性融合体的组成差异显著。雌性融合体的所有已知早期成分也在雄性中发现,包括此处所述类别中新鉴定的蛋白质(Tmod、Scribble和Shaggy)。这可能反映了雄性和雌性融合体在同步膀胱细胞分裂期间形成的相似机制,以及它们的初始结构和分支模式的高度相似性。
雄性融合体也表达内质网特有的蛋白质。粗面内质网的标记物,如转座子组分Sec61alpha和Sec63,以及参与蛋白质折叠的内质网内质网蛋白,如PDI和Crc,都得到了丰富(). 然而,并非所有雌性梭形体内的ER-localized蛋白质都在雄性细胞器中发现。Rtnl1,一种与平滑内质网相关的蛋白质(罗珀,2007年)雄性梭形体中没有。Rtnl1在雌性融合体中高度富集,随后在卵母细胞中大量积累。拖车钩也是如此,它与Cup、Me31B和其他蛋白质一起参与翻译调节转运到卵母细胞的信使核糖核酸(Wilhelm等人,2005年). 突变克隆中Rtnl1的缺失对融合体结构或育性没有影响(罗珀,2007年). 男性囊肿细胞具有相同的命运,而女性囊肿细胞产生一个卵母细胞和十五个滋养细胞。男性和女性囊肿中梭形体的差异组成可能反映了这种基本差异。因此,我们认为,雌性体内的融合体成分很可能在雄性体内不存在,因为雄性体内似乎没有这种转运。这些蛋白质通常也不需要完成卵子的形成。
在雌性融合体中发现的内体和溶酶体蛋白也不存在于雄性细胞器中。这些成分在中晚期镰刀菌体中变得突出,并可能重塑镰刀菌体内的结构以激活定向运输。雄性梭形体中没有溶酶体成分,这可能确保它不会被咀嚼以暴露其下面的微管。相反,雄性可能会发生不同的修饰过程,因为我们观察到溶酶体蛋白酶在某些阶段非常靠近雄性融合体。