钙²⁺-γ-氨基丁酸的诱导反弹增强作用酸介导电流需要激活钙²⁺/钙调素依赖性激酶II

摘要

兴奋性活动依赖性可塑性的许多特征突触被认为是学习和记忆的细胞基础根深蒂固的(1). 关于脊椎动物中的抑制性突触。直到最近才发现抑制性突触传递本身经历活动依赖性脊椎动物大脑的几个区域发生改变，即。，小脑浦肯野神经元(2–4)金鱼的Mauthner细胞(5)，小脑深部细胞核(6)，视皮层(7)和海马(8,9). 除了特征鲜明的活动依赖性可塑性兴奋性突触(1)，抑制性突触的可塑性也可能在学习、记忆和发展中发挥重要作用(10).

在小脑浦肯野神经元中，兴奋性物质的激活突触输入可以诱导γ-氨基丁酸（GABA）介导的抑制性突触电流被称为回弹增强的现象(三). 反弹增强是由细胞内瞬时升高触发的钙²⁺浓度(三)由于电压门控的激活钙²⁺通道(2,4)，但细胞内机制连接短寿命钙²⁺过渡到更长时间持续反弹增强尚不清楚。细胞内增加钙²⁺集中也是触发的重要步骤各种兴奋性突触的活动依赖性可塑性，例如海马CA1区的长期增强(1)和小脑平行纤维突触的长期抑制（LTD）(11,12). 这些Ca²⁺信号显示可以触发各种蛋白激酶级联并可能最终导致向上或突触后谷氨酸受体的下调(13–15). 自蛋白质磷酸化是调节配体门控离子通道的功能(16)，蛋白激酶级联可能也对抑制性突触的反弹增强起关键作用。

本研究旨在检查是否出现反弹增强包括钙²⁺/钙调素依赖性蛋白激酶II（CaM-KII）信号转导途径。我们使用了各种药理学具有不同行动模式的代理来阻止此级联，以及将激活的CaM-KII直接注射到浦肯野神经元。我们的结果强烈建议反弹增强涉及CaM-KII介导的蛋白质磷酸化。

材料和方法

制备了200μm厚的小脑矢状切片10至14日龄大鼠的寄生虫(17,18). 这个切片保存在含氧标准盐水中（成分见下文）在34°C下使用。全电池接线灯记录方法(19)是用于记录通过a×40直接可视化的浦肯野神经元立式显微镜中的浸水物镜（蔡司Axioskop）(17,18). 密封电阻大于10 GΩ，使用电阻为2-3兆欧。在所有实验中，串联电阻的补偿为执行(2)使用EPC-7放大器的标准程序（列表电子，达姆施塔特，F.R.G.）。标准内部溶液含80 mM CsCl，2 mM MgCl₂，80 mM铯d日-葡萄糖酸盐、1 mM EGTA、4 mM NaATP、0.4 mM NaGTP和10 mM肝素（pH 7.3，用CsOH调节）。实验室是用含有125 mM NaCl、2.5 mM KCl、，2 mM氯化钙₂，1 mM氯化镁₂，1.25毫米不₂人事军官₄，26 mM氯化钠_三和20 mM葡萄糖（pH 7.4，用95%O起泡₂/5%一氧化碳₂). 实验在室温下进行（22–24°C），但含有磷酸酶抑制剂calyculin a的除外（参见图。​图4），4)，在32°C下进行。

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图4

蛋白磷酸酶抑制剂的作用，花萼蛋白A对GABA诱导的小脑全细胞电流反应的影响浦肯野神经元。(A类)诱导的全细胞膜电流通过前（左栏）和后（右栏）的浸浴GABA（5μM）柱）5分钟灌注含花萼蛋白a（1μM）的盐水(上部)或仅包含车辆的车辆(下部). (B类)峰值振幅的变化GABA诱导的萼蛋白A处理的Purkinje神经元电流（固体符号，n个=8）和控制（开放符号，n个=7）组。数据点以平均值±表示SEM。电流振幅相对于平均值进行了标准化在浴前8分钟记录化合物（水平巴）。

Staurosporine（Calbiochem）、calmidazolium（Calbicochem）、KN62（神谷加利福尼亚州千橡树生物医学）和花萼蛋白A（Wako生化公司，大阪）溶于二甲基亚砜（DMSO）中，添加到生理盐水并通过灌注在细胞外施用。决赛盐水中二甲基亚砜的浓度始终保持在0.1%以下。Staurosporine在细胞内应用（10μM，包括在内部补丁针溶液）注射到Purkinje神经元此外，小脑切片在0.1μM的培养液中培养60分钟含有staurosporine的沐浴液，以确保其对透析良好）远端树突。钙调素结合域将（CBD；Calbiochem）溶解在蒸馏水中（100 mM）并添加以使CBD的最终浓度为100微米。用于细胞内应用的内部溶液CaMK-II（见图。​图5）5)含130 mM CsCl，5 mM MgCl₂, 1mM氯化钙₂、11 mM EGTA、5 mM NaATP和5 mM Hepes（pH 7.3，用CsOH调整）。纯化的CaM-KII通过所述的自硫磷酸化(14). CaM-KII孵育1050 mM Hepes，pH 7.5/0.5 mM CaCl，5°C下的最小值₂/6毫米钙调蛋白/10 mM醋酸镁/0.4 mM腺苷5′-[γ-硫代]三磷酸/BSA（1 mg/ml）。自磷酸化CaM-KII保存在冰上，并在移液管溶液中以1:10的比例稀释就在使用之前。对于对照实验，CaM-KII是在添加到自硫磷酸化反应混合物。

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图5

细胞内注射活化剂的效果CaM-KII对GABA诱导的小脑全细胞电流反应的影响浦肯野神经元。(A类)诱导的全细胞膜电流通过浴浸GABA（5μM）7分钟（左柱）和17分钟后（右栏）浦肯野神经元全细胞记录的启动注入激活(上部)（200 nM）或热失活的(下部)（200 nM）CaM-KII。(B类)GABA诱导的平均峰值振幅变化注射活化CaM-KII（固体符号，n个=6）和热失活的酶（开放符号，n个= 5). 中给出的数据点平均值±SEM指示时间（It）除以GABA诱导电流峰值补片形成后5分钟达到（I5）。

结果

回弹电位被CaM-KII抑制剂阻断。

全电池接线灯录音(19)来自Purkinje10-14日龄大鼠小脑切片中的神经元(17,18).电压钳位浦肯野神经元表现出自发抑制高频率的突触后电流（IPSC）浸提外源GABA（2–5μM，10 s），电流为振幅为200至1000-pA(2,三). IPSC和激动剂诱导电流对荷包牡丹碱（10μM）敏感，表明它们是GABA_A类-受体介导的(2). 我们已报告(三)那个刺激兴奋性攀爬纤维诱导长时间IPSC和电流对外源性反应的反弹增强GABA。细胞内应用a加利福尼亚州²⁺螯合剂，双（2-氨基苯氧基）乙烷-N、 N、N′,N个′-四乙酸盐（巴普塔）(三). 此外，钙的活化²⁺频道依据Purkinje细胞的直接去极化导致GABA公司_A类具有时间过程和振幅的受体功能类似于攀爬纤维引起的回弹增强(三). 这个攀爬纤维引起的反弹增强阻断了随后的通过直接去极化诱导长时增强，以及反之亦然（M.K.和A.K.，未发表的观察结果）。这些结果强烈建议攀爬纤维刺激和直接去极化激活，通过细胞内钙²⁺浓度，普通细胞导致反弹增强的过程。因此，在目前研究中，我们使用去极化脉冲至−10 mV，持续500 ms来诱导回弹增强。这种去极化脉冲诱导树突钙²⁺Purkinje神经元内的短暂反应类似于通过攀爬纤维刺激(20).

该程序持续增强全细胞电流对浸提外源GABA（图。​（图1A1A类顶部). 电流振幅的增强包括初始瞬态分量（达到控制的200%值），然后是长时间（>40分钟）的平台状阶段（约150%的控制值）（图。​（图11B类，打开符号）。在本研究中，我们专门研究了持续的反弹增强成分。当staurosporine，一种强效但非选择性蛋白激酶抑制剂应用于浦肯野神经元细胞内外，调节去极化脉冲诱导GABA介导的振幅无长期变化电流，瞬态和较小的电势除外（图。​（图11A中间和B上部，实心符号）。这个钙的振幅²⁺去极化激活的电流staurosporine对脉搏几乎没有影响[2.05±0.71对照组nA（平均值±SD）(n个=9）和staurosporine处理细胞的1.74±0.70 nA(n个=5），在去极化脉冲开始后50 ms测量；P（P）>0.05，曼-惠特尼U型测试]。因此，我们得出结论，staurosporine抑制反弹通过干扰细胞进程来增强钙²⁺流入浦肯野神经元，可能是通过阻断一些蛋白激酶的磷酸化作用。

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图1

staurosporine和CBD对GABA诱导的全细胞电流响应的反弹增强小脑浦肯野神经元。(A类)A条件去极化脉冲（500 ms，从−70 mV到−10 mV）诱导了长时间的反弹应用2μM引起的内向电流增强GABA公司(顶部). 注意增强的有效块葡萄孢菌素(中部)和中央商务区(底部). 前4分钟记录（左栏）条件化去极化脉冲后14min。GABA在顶部横条指示的时间段内使用每个记录道（10 s）。(B类)振幅的变化葡萄孢霉素对GABA诱导的Purkinje神经元电流的影响(上部)（实心符号，n个=6）和注入CBD(下部)（实心符号，n个=7）在调节脉冲。来自同一控制组的数据（开放符号，n个=9）在两个图中都有说明。数据点是平均值±SEM。电流振幅用相对于去极化前10分钟记录的平均值脉搏。

加利福尼亚州²⁺通过电压门控钙的流入²⁺通道可以激活浦肯野的各种细胞内过程神经元。例如，Ca²⁺可能绑定到钙调素然后钙²⁺/钙调素复合物随后可能激活多功能CaM-KII(21). 这种酶富含大脑不同部位的突触后密度(22,23)存在在小脑浦肯野神经元中也大量存在(24). 它有研究表明，CaM-KII可能在诱导另一种形式的突触可塑性，即海马CA1区谷氨酸能兴奋性突触(25–28)和发育中的大鼠视觉皮层(29). 测试是否我们检测到，回弹增强需要激活CaM-KII钙调素结合域（CBD）的作用CaM-KII肽抑制剂。CBD抑制钙²⁺/钙调素复合物的调节作用CaM-KII结构域，从而阻断该激酶的激活(30). 通过记录在细胞内应用CBD（100μM）贴片吸管有效地阻止了GABA介导的电流（图。​（图11A底部和B类下部，实心符号），其程度与星形孢菌素（图。​（图11 A中间和B类上部，实心符号）。钙的振幅²⁺去极化脉冲激活的电流不受CBD的影响对照组为[2.05±0.71 nA（平均值±SD）(n个=9）和1.94±0.47 nA（对于CBD处理的细胞）(n个= 7)]. 因此，这些数据强烈表明钙调素依赖性蛋白激酶的激活钙²⁺流入，可能是CaM KII，参与了反弹增强。

调节钙后不久发生CaM-KII激活瞬态。

为了进一步研究CaM-KII激活的机制在诱导反弹增强时，我们使用了钙调素拮抗剂卡米达唑和另一种选择性CaM-KII拮抗剂，KN62。因为这两种药剂都是膜可渗透的，所以它们可以通过细胞外灌注应用。

当卡咪唑啉在在浦肯野神经元去极化过程中阻止反弹增强（图。​（图2A2A类上部)以类似于神经元用staurosporine或CBD治疗（图。​（图1）。1). 另一方面，当卡米达唑开始使用5分钟后去极化脉冲，对浸提GABA的反应增强其时间过程与回弹增强过程中看到的时间过程相同控制组（图。​（图2A2A下部). 在这些实验中使用了低浓度（100 nM）的卡米达唑不影响钙的振幅²⁺电流[2.05±0.71 nA用于控制(n个=9）和2.33±0.86nA用于卡米达唑处理的细胞(n个= 5);P（P）>0.05，曼·惠特尼U型测试]。Calmidazolium对GABA诱导的电流和自发IPSC[101.3±10.8%和100.9±15.3%（平均值±SD，n个=6），分别相对使用卡咪唑啉之前的控制值，Mann–WhitneyU型测试]。因此，卡咪达唑铵对反弹增强不是由于GABA公司_A类受体功能或钙降低²⁺去极化过程中的内流，但最有可能抑制钙激活钙调素过程²⁺. The结果还表明，这一过程发生在去极化脉冲。

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图2

卡米达唑和KN62对反弹的影响Purkinje神经元对浸提GABA电流反应的增强。与图中所示的实验设计相同。​图11B类.(A类)在试验前和试验期间施用Calmidazolium（100 nM）调理去极化脉冲有效阻止回弹增强(上部)（实心符号，n个= 6). 对于这个图和下面的三个图，开放符号表示同一组控制数据如图所示。​图11B类，底部的粗水平条表示CaM-KII抑制剂的使用期限。应用去极化5分钟后开始使用的卡米达唑（CMZ，100 nM）脉冲对回弹增强没有影响(下部)（实心符号，n个= 6). (B类)KN62（3μM）在去极化脉冲之前和期间应用，可防止回弹增强的形成(上部)（固体圈子，n个= 7). KN62（3μM）对去极化脉冲后5min给出的回弹增强(下部)（实心符号，n个= 6).

接下来，我们研究了KN62的作用，KN62是一种特殊的可渗透膜CaM-KII抑制剂(31). 该化合物抑制钙²⁺/钙调素复合物对CaM-KII和从而阻断这种酶的激活(31). 适用于浴缸时Purkinje去极化之前和期间的溶液（3μM）神经元，KN62强烈抑制反弹增强（图。​（图2B2B上部)在某种程度上与观察到的相似用staurosporine、CBD或calmidazolium处理的神经元（图。​（图11和​和2A2A上部). 相比之下，当预处理去极化后5分钟开始使用KN62脉冲，回弹增强几乎与之相同在对照实验中注册（图。​（图2B2B类下部). 对照试验表明，KN62没有对GABA诱导电流振幅或自发IPSC（103.2±18.6%和102.0±16.7%，n个相对于控制值分别为5KN62应用之前）或Ca振幅²⁺去极化电压阶跃产生的电流[2.05±0.71nA用于控制(n个=9）和1.65±0.32nAKN62处理细胞(n个= 7);P（P）> 0.05,曼·惠特尼U型测试]。这些结果表明KN62阻断CaM-KII与钙²⁺/钙调素复合物。

CaM-KII抑制剂对自发性IPSC的影响。

数据目前为止的研究表明，CaM-KII的抑制作用很强抑制由浸提外源GABA。检查相同的治疗也会影响IPSC的反弹增强，我们为每个IPSC取平均值细胞测试连续发生200–400起自发事件事件发生前的IPSC和事件发生后15分钟的同等次数调节脉冲。对照实验显示IPSC振幅对其时间进程无明显影响（图。​（图3三A类，控制记录道）。这个从九个实验中计算出的平均增强值为152±10.4%（平均值±SEM）（图。​（图3三B类，控制巴）。相比之下，在浦肯野没有观察到IPSC的增强用staurosporine处理的神经元（106.3±7.5%，图。​图3三B类，staurosporine bar），CBD（105.6±10.7%，图。​图3三B类（CBD酒吧），以及接受卡米达唑治疗的患者（107.3±18.6%，图。​图3三B类，CMZ-棒前）或KN62（98.0±7.5%，图。​图3三 A类、KN62轨迹，以及B类,KN62-前杆）。然而，当卡米达唑或KN-62在去极化脉冲后5分钟应用IPSC的增强基本上具有相同的时间过程和程度与对照实验一样（152.5±12.1%和156.6±10.3%，图。​图3三B类、CMZ-后杆和KN62-后杆）。它是值得注意的是，IPSC的反弹增强受到抑制剂的影响CaM-KII信号转导途径的定量研究类似于观察到的电流响应增强由浸浴GABA生产。这强烈表明CaM-KII依赖性突触后GABA上调_A类受体功能是IPSC增强的基础。

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图3

staurosporine、CBD、calmidazolium和KN62关于自发IPSC的反弹增强。(A类)记录的平均记录道（每个记录道来自50个连续自发IPSC）来自对照组和分别为KN62治疗组。(左侧)控制。之前采集的平均轨迹（小振幅）和去极化脉冲后15分钟，平均IPSC增强。存在时使用相同协议记录的平均两条记录道KN62的(赖特)几乎完美叠加。注释无论是在控制期间还是在KN62在场的情况下受影响的IPSC进程。(B类)IPSC的平均变化以下实验操作引起的振幅：控制(n个=9），葡萄孢菌素(n个= 6),中央商务区(n个=7），在和之前施用卡咪唑啉在去极化期间出现（CMZ-before，n个= 6),去极化后5分钟开始服用卡米达唑（CMZ-after，n个=5），KN62适用于之前和期间去极化（KN62-前，n个=7）和KN62去极化后5分钟开始（KN62-之后，n个=6). 所示数值代表振幅的变化（平均值±SEM）调理后15分钟测量200–400个连续IPSC去极化脉冲相对于之前的控制值进行归一化去极化。

讨论

目前的数据清楚地表明钙²⁺/钙调素依赖性激活CaM KII和随后的磷酸化是诱导反弹增强。我们的数据表明，这一过程在调理Ca后5分钟内完成²⁺电压门控钙激活产生的瞬态²⁺通道（图。​（图2）。2). 因此，保持回弹增强需要一些人的贡献钙²⁺/钙调素非依赖机制。生化数据表明，钙调素依赖性自磷酸化过程，CaM-KII不再需要钙调素维持其激酶活性(33,34). 因此，自磷酸化的CaM-KII可以激活更长时间比钙的寿命长²⁺/钙调素复杂。一种可能性是GABA_A类受体或相关蛋白质被持续活性的磷酸化CaM-KII的钙调素非依赖形式作为维持增强GABA的机制_A类受体功能。最近有报道称β1和γ2GABA亚基_A类受体被直接磷酸化CaMK-II公司(35,36). 通过使用纯化的主要融合蛋白GABA的细胞内结构域_A类受体亚单位，特异性已确定CaMK-II的磷酸化位点。因此，它是GABA持续磷酸化的可能性_A类受体CaM-KII是保持回弹增强的原因。另一种可能性是CaM-KII的磷酸化触发了持续修改GABA的细胞内级联_A类受体以钙调素非依赖性的方式发挥作用。在事实上，cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）的激活增强IPSCs和对外源性GABA的电流反应随时间变化类似于回弹增强(37). 虽然没有直接现有证据表明CaM-KII激活PKA浦肯野神经元，这可能是一个有趣的机制反弹增强。

GABA公司_A类受体功能由钙²⁺和脑中各种细胞类型的蛋白激酶和细胞表达系统(16). 在分子水平上，共识磷酸化位点在大的细胞内被确定各种GABA的领域_A类受体亚单位。例如，所有β亚基（β1-4）都有一个保守的磷酸化位点PKA公司(38,39). 此外，γ2的可选拼接版本亚单位，称为γ2L，包含一个一致的序列蛋白激酶C（PKC）磷酸化(40,41). 生化数据表明GABA_A类受体亚单位直接不仅被CaMK-II磷酸化(35,36)但PKA(42,43)、PKC(43)和cGMP依赖性蛋白激酶(36). 应该注意的是两个Ca²⁺升高和PKA激活降低GABA公司_A类受体在大多数天然细胞类型中的功能和迄今为止检查的细胞表达系统(16). 此外，还PKC依赖性磷酸化导致GABA诱导的电流(44). 小脑浦肯野神经元是迄今为止唯一的GABA的示例_A类-受体功能被上调两种钙²⁺升高和PKA激活。这表明要么Purkinje神经元拥有独特的GABA_A类受体以与其他细胞相反的方式进行调制类型或GABA_A类受体功能受一种受Ca影响的未知机制²⁺或PKA在不同类型的神经元中以不同的方式存在。最近，王等。(45)报告称GABA介导的电流脊髓背角和海马神经元通过细胞内应用的CaMK-IIα亚基(45). 这是在与我们目前对浦肯野神经元的研究结果一致。然而，PKA已被证明能抑制GABA介导的电流脊髓神经元(46)，与中发现的效果相反浦肯野神经元(37). CaMK-II和PKA的这种差异效应进一步表明GABA有不同的机制_A类不同细胞类型的受体调节。

我们发现，应用一种蛋白质抑制剂花萼蛋白A磷酸酶1和2A增强Purkinje中GABA介导的电流神经元（图。​（图4）。4). 这与在脊髓中获得的结果一致背角神经元(45). 这些结果表明GABA_A类内源性蛋白磷酸酶抑制受体。GABA的功能状态_A类受体可能依赖于CaM-KII磷酸化与通过蛋白磷酸酶1或2A进行去磷酸化。有趣的是，花萼甲素的应用会引起两者的抑郁α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）反应和平行纤维介导的兴奋性突触传递浦肯野神经元(13,47). 这些发现表明内源性蛋白磷酸酶可能具有不同的调节作用GABA的功能_A类和浦肯野的AMPA受体神经元。

除了GABA的反弹增强_A类-受体介导的抑制性输入，攀爬纤维刺激可诱导当这两种不同的兴奋性时，兴奋性平行纤维突触输入被联合激活，这一现象被认为是小脑运动学习的细胞基础(11,48).平行纤维突触上AMPA受体的下调是假定为LTD负责的机制(13,49,50). 两个PKC(51)和cGMP依赖性蛋白激酶(52)建议主要涉及LTD的引入。然而，没有到目前为止，CaM-KII参与了LTD。因此，这是可能的GABA的反弹增强_A类-受体介导的AMPA受体介导的兴奋的抑制和LTD通过以下途径介导不同的激酶系统，尽管在这两种情况下都是初始触发瞬态Ca²⁺攀爬纤维活性产生的流入(三,53).

致谢

脚注

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