美国国家科学院院刊。2007年12月26日;104(52): 20932–20937.
遇见无论有无扩增T790米中的突变表皮生长因子受体获得性耐药吉非替尼或埃洛替尼的突变型肺肿瘤
,一 ,b条 ,c(c) ,日期:,e(电子) ,(f) ,克 ,克 ,克,小时 ,克,我 ,j个 ,一 ,k ,c(c) ,我 ,米 ,j个 ,a、,克 ,n个 ,c(c) ,e(电子) ,a、,克 ,o个和a、,日期:,e、,第页
格雷戈里·里利
d日内科实体肿瘤科胸科肿瘤服务,
e(电子)康奈尔大学威尔医学院医学部,纽约,NY 10021;
卢旺(Lu Wang)
克纽约州纽约市10021,纪念斯隆-凯特琳癌症中心病理学系;
Dhananjay Chitale公司
克纽约州纽约市10021,纪念斯隆-凯特琳癌症中心病理学系;
诺里科·莫托伊
克纪念斯隆-凯特琳癌症中心病理学系,纽约,邮编10021;
小时日本癌症研究基金会病理学系,3-10-6 Ariake,Koto-ku,Tokyo 135-8550,日本;
Janos Szoke公司
克纽约州纽约市10021,纪念斯隆-凯特琳癌症中心病理学系;
我匈牙利布达佩斯国立肿瘤研究所分子病理学系,Rath Gy.u.7-9,1122;
阿迪·加兹达尔
我德克萨斯大学西南医学中心哈蒙肿瘤治疗研究中心,德克萨斯州达拉斯75390;
哈维山口
米纽约大学医学中心心胸外科,纽约州纽约市10016;和
威廉·杰拉尔德
一人类肿瘤学和病理学计划,
克纽约州纽约市10021,纪念斯隆-凯特琳癌症中心病理学系;
黄石峰
n个国立卫生研究院分子与基因组医学部,台湾苗栗350
文森特·米勒
e(电子)康奈尔大学威尔医学院医学部,纽约,NY 10021;
马克·拉塔尼
一人类肿瘤学和病理学计划,
克纽约州纽约市10021,纪念斯隆-凯特琳癌症中心病理学系;
池新阳
o个国立台湾大学医院肿瘤科和国立台湾大学医学院临床医学研究生院,台北100,台湾;
鲍威廉
一人类肿瘤学和病理学计划,
d日内科实体肿瘤科胸科肿瘤服务,
e(电子)康奈尔大学威尔医学院医学部,纽约,NY 10021;
一人类肿瘤学和病理学计划,
b条神经外科,
j个外科胸外科服务,
d日内科实体肿瘤科胸科肿瘤服务,
(f)基因组核心实验室,
克纽约州纽约市10021,纪念斯隆-凯特琳癌症中心病理学系;
c(c)医学院内科
o个国立台湾大学医院肿瘤科和国立台湾大学医学院临床医学研究生院,台北100,台湾;
e(电子)康奈尔大学威尔医学院医学部,纽约,NY 10021;
小时日本癌症研究基金会病理学系,3-10-6 Ariake,Koto-ku,Tokyo 135-8550,日本;
我匈牙利布达佩斯国立肿瘤研究所分子病理学系,Rath Gy.u.7-9,1122;
k台湾桃园333长庚纪念医院血液肿瘤科;
我德克萨斯大学西南医学中心哈蒙肿瘤治疗研究中心,德克萨斯州达拉斯75390;
米纽约大学医学中心心胸外科,纽约州纽约市10016;和
n个台湾苗栗350国立卫生研究院分子与基因组医学部
由Harold E.Varmus传达,纪念斯隆-凯特琳癌症中心,纽约州纽约市,2007年11月2日。
作者贡献:J.B.、C.B.、A.V.、W.G.、M.L.和W.P.设计研究;J.B.、C.B.、J.-Y.S.、A.V.、L.W.、D.C.、N.M.、J.S.、S.B.、M.B.、W.G.、S.-F.H.、M.L.、C.-H.Y.和W.P.进行了研究;G.R.、W.-C.C.、C.-J.Y.、A.G.、H.I.P.、V.R.、P.-C.Y.和V.M.贡献了新的试剂/分析工具;J.B.、C.B.、J.-Y.S.、A.V.、J.S.、W.G.、M.L.、C.-H.Y.和W.P.分析数据;J.B.和W.P.撰写了这篇论文。
- 补充资料
支持信息
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摘要
在人类肺腺癌中表皮生长因子受体突变是一种第二位点点突变,在790位(T790M)用蛋氨酸替代苏氨酸,与大约一半的EGFR激酶抑制剂吉非替尼和埃洛替尼获得性耐药相关。为了确定其他有助于疾病进展的潜在机制,我们使用基于阵列的比较基因组杂交(aCGH)来比较表皮生长因子受体来自未治疗患者和获得性耐药患者的突变肿瘤。在三个表现出针对获得性抗性集的重复拷贝数改变(CNA)的基因座中,一个含有遇见原癌基因。总体而言,对来自多个独立患者队列的肿瘤样本的分析表明遇见43例获得性耐药患者中有9例(21%)在肿瘤中扩增,而62例未治疗患者中只有两例(3%)(P(P)=0.007,Fisher精确检验)。在9名患者的10个耐药肿瘤中遇见放大,4也包含表皮生长因子受体T790米突变。我们还发现表皮生长因子受体突变型肺腺癌细胞系NCI-H820遇见除了药物敏感外,还进行了扩增表皮生长因子受体突变和T790米更改。生长抑制研究表明,这些细胞对厄洛替尼和一种不可逆EGFR抑制剂(CL-387785)都具有耐药性,但对一种对MET具有强大活性的多激酶抑制剂(XL880)敏感。综合起来,这些数据表明遇见放大独立于表皮生长因子受体T790米突变,MET可能是一些对吉非替尼或埃洛替尼获得性耐药患者的临床相关治疗靶点。
关键词:肺腺癌,XL880
在一定比例的肺腺癌中发现表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶结构域外显子的体细胞突变(1). 近90%的突变发生在第19外显子中消除四种氨基酸的多核苷酸框内缺失(LREA),或发生在858位以精氨酸替代亮氨酸的单一错义突变(L858R)。这两种遗传病变都与肺腺癌对选择性EGFR激酶抑制剂吉非替尼(Iressa)和埃洛替尼(Tarceva)的敏感性增加有关(2–4). 多个前瞻性试验表明,对于肿瘤中含有这些突变的患者,有效率约为75%(5).
不幸的是,肺癌对药物敏感表皮生长因子受体最初对吉非替尼或埃洛替尼产生反应的突变最终发展为获得性耐药性(6,7). 在大约一半的病例中,疾病进展后获得的肿瘤细胞在EGFR激酶结构域中含有第二位点突变(8–12). 最常见(>90%)的病变涉及第20外显子2369核苷酸的C→T改变,它在790位(T790M)取代了苏氨酸。在缺乏或存在EGFR抑制剂的情况下,有助于对EGFR抑制剂产生耐药性的其他机制T790米突变,还有待确定。
为了确定对吉非替尼或埃洛替尼产生耐药性的肺癌是否表现出可能在疾病进展中起作用的额外和/或特异性基因改变,我们进行了高分辨率基因组分析(aCGH)来自12名患者的组织样本,这些患者的肿瘤最初有反应,但随后在服用这些药物时发生了进展。我们将这些结果与来自肺腺癌基因组分析的结果进行了比较表皮生长因子受体从38名从未接受过激酶抑制剂治疗的患者中切除的突变。在两组之间CNA重复出现差异的三个基因组位点中,我们重点关注一个包含MET酪氨酸激酶编码基因的位点。使用几种分子和细胞技术,我们验证了aCGH的发现,然后将我们的研究扩展到其他表皮生长因子受体突变肿瘤。我们还检测了可用的MET蛋白的活性表皮生长因子受体突变型肺腺癌细胞系和一个细胞系(NCI-H820)的药物反应研究发现含有表皮生长因子受体药物敏感突变(外显子19缺失)表皮生长因子受体耐药突变(T790米)、和遇见放大。
结果
EGFR激酶抑制剂获得性耐药患者肺腺癌的癌基因特征。
我们从12例肺腺癌患者中获得了12个肿瘤DNA样本,其中包括表皮生长因子受体长期使用吉非替尼或厄洛替尼治疗后的突变和疾病进展。然后,我们使用60肽寡核苷酸阵列平台(安捷伦)对DNA进行aCGH。我们分析了阵列扫描图像的荧光比率,以使用循环二进制分割算法的版本识别拷贝数的统计显著变化(13). 大规模基因组事件的总体模式与以往人类肺癌的高分辨率基因组图谱一致(14,15) (上部).
染色体改变复发表皮生长因子受体EGFR酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药患者的突变型肺腺癌(n个=12)或来自未治疗患者(n个= 38). 显示的是数据分割后CNA样本的百分比(年轴)沿x个染色体顺序中的轴。灰色区域表示对数定义的染色体增益和损耗计数2比率±0.2。拷贝数变化超过2倍的放大或删除,由日志定义2比率±1.0分别用亮红色和亮绿色线表示。星号表示在获得性耐药队列中发生在一个以上样本中的扩增。
获得性耐药患者与未经治疗的切除患者肿瘤样本中确定的特异性复发CNA表皮生长因子受体突变肿瘤。
接下来,我们将获得性耐药肿瘤的结果与38个突变株的单独aCGH分析结果进行了比较表皮生长因子受体从未接受过激酶抑制剂治疗的患者切除的肺腺癌。使用44K安捷伦芯片分析未治疗肿瘤的DNA(16). 这些样本中反复出现的基因组增益和损耗与获得的抗性集极为相似( 下部).
模式居中后,两组的比较(在44K探针的每个位置;参见材料和方法)揭示了获得性耐药患者样本特有的复发性CNA的三个主要位点( 上部和). 7p11-12的一个位点包括表皮生长因子受体与未经处理组相比,在12个肿瘤样本中有3个样本(第5、6和10a号)中扩增。这些结果与以下概念一致:表皮生长因子受体获得性耐药患者肿瘤中经常发生突变和扩增(11). 在两个样本(编号6和10a)中发现了第二个位点,其间隔为7q31.2[支持信息(SI)图4]. 基因编码遇见位于该区间,编码一个受体酪氨酸激酶,与动物和人类癌症的发展、维持和进展有关(参考文献综述)。17). 第三个CNA发生在5p15.2-15.3,在两个样本中发现(编号5和10a);该区域的候选基因尚待确定(). 我们没有观察到任何基因缺失在治疗组或未治疗组中显著过度表达。
表1。
12个拷贝数发生显著变化的基因组位点表皮生长因子受体获得性耐药患者突变肿瘤标本与38例比较表皮生长因子受体未经治疗患者的突变肿瘤样本
细胞带 | 最大持续功率 | 中国核协会 | 高于阈值,否。 | RefSeq基因,无。 | 目标基因 |
---|
第15.2页至第15.3页 | 8.2–14.6 | >8 | 2 | 7 | 未知 |
第7页11–12 | 53.8–55.5 | >8 | 三 | 4 | 表皮生长因子受体 |
第7季度31.2 | 114.8–116.4 | >12 | 2 | 6 | 遇见 |
获得性耐药患者肿瘤细胞7号染色体的基因组增益。
接下来,我们在所有样本中以更高的分辨率检查了7号染色体上感兴趣区域的单个aCGH图谱。11个样本显示7号染色体广泛扩增,包括表皮生长因子受体(未显示数据)。样本5、6和10a在包括表皮生长因子受体,并且样品6和10a在基因座处具有额外的聚焦放大,包括遇见(SI图4). 这些样品中没有一个具有编码肝细胞生长因子(HGF)的基因的局部扩增,HGF是MET的配体,位于7q21.1。另一个来自10号患者(10b,转移淋巴结)的肿瘤样本也显示了两个部位的局部放大表皮生长因子受体和遇见.
用扩增法测定耐药肿瘤细胞的比例遇见,我们评估了遇见双色荧光法测定每个细胞的基因拷贝数就地在一个肿瘤样本(6号)中进行杂交(FISH),我们有足够的活肿瘤细胞用于分析。用与7号染色体的着丝粒(CEP7;绿色)或与遇见(红色)。我们发现肿瘤样本由混合细胞组成。7号染色体均为多体。然而,尽管一些单元格显示了相同数量的CEP7和遇见(平均4-6份),其他人拥有更多的遇见比CEP7(SI图5). 再加上同一肿瘤样本的aCGH结果,这些数据表明6号患者的肿瘤细胞约有4-6个7号染色体拷贝,并且含有遇见在大约一半的细胞中。
确认遇见通过定量PCR和其他患者肿瘤样本分析的状态。
为了进一步证实aCGH研究的结果,我们接下来进行了定量“实时”PCR(qPCR),以确定遇见来自四个独立的肿瘤样本队列的DNA样本。作为控制基因,我们选择了一个[(MTHFR公司(5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶;位于1p36.3)]来自一个基因组区域,该基因组区域通过aCGH在任何样品中都没有显示CNA,并且不受生殖系拷贝数多态性的影响。
在第一组中,已经通过aCGH定量PCR分析的肿瘤样本证实了结果(,编号1-12)。然后,我们测试了来自我们自己的获得性耐药患者的另外四个肿瘤(第13–16号)和来自台湾的另外三种耐药肿瘤(,编号17–19)。总共,在19名患者的肿瘤样本中,有4名患者显示遇见放大(例如,相对于MTHFR公司> 1.5). 这里,我们选择了一个比率遇见:MTHFR公司>1.5定义遇见根据6号患者肿瘤细胞的FISH和aCGH分析的相应数据进行扩增(SI图5)和细胞系(见下文和).
表2。
表皮生长因子受体突变和遇见EGFR抑制剂获得性耐药患者肺腺癌细胞系和肿瘤标本的状况
病人 | 1°表皮生长因子受体突变 | T790米 | 遇见F.C.公司。 | 药物 | 持续时间,月 |
---|
裁判。 | 纳 | 纳 | 1 | 纳 | 纳 |
H820型 | 删除E746-E749 | Y(Y) | 2.7 | 纳 | 纳 |
第9页 | 删除E746-A750 | N个 | 0.8 | 纳 | 纳 |
1 | 戴尔L747-E749;A750磅 | Y(Y) | 不是amp。由aCGH提供 | 厄尔。 | 26 |
2 | 戴尔L747-P753 | N个 | 1.8 | 厄尔。 | 22 |
三 | 删除E746-A750 | N个 | 0.6* | 通用电气公司。 | 11 |
4 | 删除E746-A750 | N个 | 不是amp。由aCGH提供 | 通用电气公司。 | 9 |
5 | L858R型 | N个 | 0.8* | 通用电气公司。 | 17 |
6 | 删除E746-A750 | N个 | 1.8* | 厄尔。 | 9 |
7 | 删除E746-T751insA | N个 | 0.6* | 厄尔。 | 10 |
8 | 戴尔L747-S752insQ | N个 | 不是amp。由aCGH提供 | 厄尔。 | 32 |
9 | L858R型 | N个 | 不是放大器。由aCGH提供 | 地理位置。,厄尔。 | >25 |
10年 | 戴尔L747-T751;K754E型 | Y(Y) | 1.8* | 通用电气公司。 | 11 |
10亿 | 德尔L747-T751;K754E型 | N个 | 3.5* | 通用电气公司。 | 11 |
11 | L858R型 | Y(Y) | 不是amp。由aCGH提供 | 通用电气公司。 | 47 |
12 | L858R型 | N个 | 不是amp。由aCGH提供 | 通用电气公司。 | 15 |
13 | L858R型 | Y(Y) | 不是amp。由aCGH提供 | 厄尔。 | 17 |
14 | 删除E746-A750 | Y(Y) | 0.5 | 地理位置。,厄尔。 | 31 |
15 | 删除E746-A750 | N个 | 0.8 | 地理位置。,厄尔。 | 32 |
16 | 删除E746-A750 | N个 | 0.5 | 呃。 | 24 |
裁判。 | 纳 | 纳 | 1 | 纳 | 纳 |
H820型 | 删除E746-E749 | Y(Y) | 2.2 | 纳 | 纳 |
17 | 删除E746-A750 | Y(Y) | 1.1 | 厄尔。 | 6 |
18 | 删除E746-A750 | N个 | 1.1 | 通用电气公司。 | 5 |
19 | 德尔E746-A750 | N个 | 2.8 | 地理位置。,厄尔。 | 27 |
为了将这些发现扩展到另一个独立队列,我们对来自表皮生长因子受体24例获得性耐药台湾患者的突变肿瘤(SI表3,编号20–43)。匹配的预处理肿瘤DNA样本可用于比较。我们检测到遇见来自五名患者的肿瘤扩增。在其中四个样本中,遇见仅在处理后的样本中发现扩增,这表明选择具有遇见这些患者服用吉非替尼时出现扩增。注意,在这里,我们使用了更严格的标准遇见放大(遇见:MTHFR公司比率>5),因为样本是用独立的方案进行测试的(参见材料和方法和SI表3图例)的并发aCGH或FISH数据不可用。
两名患者(SI表3,编号30和32),遇见在治疗前获得的肿瘤样本中检测到扩增。其中一名患者(编号32),未经治疗的样本是经手术切除的肺部肿瘤。三年多后疾病复发,治疗后标本取自对吉非替尼初始反应15个月后的网膜。另一名患者(编号30)在CT引导下经肺活检确诊,并在吉非替尼上有部分影像学反应。当开始服用吉非替尼8个月后出现胸腔积液时,获得“获得性耐药”样本。这些结果可能是由于单个肿瘤的遗传异质性和/或单个患者的肿瘤异质性。观察到的放大遇见在某些肿瘤中,经TKIs治疗后,可归因于选择具有以下特征的细胞亚群遇见放大。
当综合来自多个独立队列的数据(使用qPCR、aCGH和/或FISH)时,我们发现遇见43例获得性耐药患者中有9例扩增,而62例未治疗患者中有2例扩增(P(P)=0.007,Fisher精确检验)。普通人表皮生长因子受体T790米43例获得性耐药患者中有20例(46.5%)出现耐药突变。有趣的是,10个肿瘤样本中有4个(来自9名患者)遇见放大包含了表皮生长因子受体T790米突变也是如此。因此,对吉非替尼或埃洛替尼获得性耐药的肿瘤可能表现为遇见在缺乏或存在第二位点耐药突变的情况下表皮生长因子受体. There was no correlation between increased copies of遇见和主要药物敏感类型表皮生长因子受体突变(第19外显子缺失vs.第21外显子点突变)或药物治疗持续时间(数据未显示)。
已建立的肺腺癌细胞系包含与药物敏感性相关的外显子19缺失、与药物耐药性相关的外显子20点突变以及遇见.
我们对遇见在肺腺癌细胞系中表皮生长因子受体突变。令人惊讶的是,我们发现一种细胞系-H820不仅含有药物敏感性(del E746-E749)和耐药性(T790米)表皮生长因子受体激酶域突变(数据未显示)遇见放大(). 与这些结果一致,我们使用FISH发现大多数H820细胞含有4–6个7号染色体拷贝(CEP7)和7–9个遇见(A类). 根据aCGH判断,7号染色体的大区域被不同程度地扩增,但在包含以下两种基因的位点上没有观察到特定的局部扩增表皮生长因子受体或遇见(未显示数据)。
遇见H820细胞对MET抑制剂XL880的状态和敏感性。(A类)H820细胞显示,通过双色FISH分析评估(见材料和方法),≈4–6个第7染色体拷贝(CEP7),在含有遇见。所示单元格代表整个人群。比例尺:10-μm。CEP7探头,绿色;遇见探头,红色;细胞核,蓝色(DAPI)。(B类)使用抗磷酸-(p)-MET(Y)对H820和PC-9细胞的裂解液进行免疫印迹1234/5)、抗毒性MET和抗肌动蛋白抗体。H820细胞含有外显子19缺失(E746-E749)T790米突变,并扩增no遇见而PC-9细胞含有外显子19缺失(E746-A750),没有T790米突变,没有遇见放大。(C类)不同浓度MET和EGFR抑制剂对H820和PC-9细胞的生长抑制曲线。误差条表示六个重复的一个标准偏差。
要确定遇见由于MET酶活性增加,我们使用替代激酶试验,用识别酪氨酸残基磷酸化MET(Y)的多克隆抗体探测H820细胞裂解物的免疫印迹1234/5). 这些磷酸化位点位于活化环中,指示激酶活化(B类). 用抗MET单克隆抗体免疫印迹法测定总MET蛋白。这两种抗体都识别酶的170-kDa前体形式和成熟的140-kDa-β亚单位。较小的蛋白质是较大前体蛋白水解裂解的产物,也包含酪氨酸激酶催化结构域(18). 我们将H820细胞的结果与PC-9细胞的结果进行了比较,PC-9细胞是一种含有外显子19缺失(E746-A750)的肺癌细胞系表皮生长因子受体但没有T790米突变和no遇见放大(). PC-9细胞提取物含有相对少量的总MET蛋白和磷酸化MET蛋白。相比之下,H820细胞提取物显示出更多的MET蛋白,其中大部分在Y时被磷酸化1234/5(B类).
H820细胞对MET抑制剂的敏感性,但对EGFR抑制剂不敏感。
进一步探讨遇见放大表皮生长因子受体突变肿瘤细胞,我们使用基于荧光的生长抑制试验来测量H820细胞对厄洛替尼CL-387785[一种已知可克服T790M介导耐药性的不可逆EGFR抑制剂]的敏感性(10,19,20)]和XL880。第三种化合物在亚毫摩尔水平上消除MET和VEGFR2酪氨酸激酶活性,并抑制PDGFRβ、KIT、FLT3、TIE-2和RON激酶在体外低nM效力(21,22).
H820细胞对厄洛替尼相对不敏感,因为抑制50%细胞生长所需的药物浓度(IC50)约为10微摩尔(C顶部). IC50CL-387785也在微摩尔范围内(C顶部和中部). 相比之下,H820细胞在毫摩尔范围内对XL880表现出敏感性(C中间). 在这些浓度的XL880下,MET的激酶活性受到抑制,这是通过使用上述替代激酶分析检测来自XL880处理细胞的H820细胞裂解物来测量的(左侧). 相比之下,PC-9细胞对XL880不敏感,但对CL-387785更敏感(C底部). 这些结果表明,像XL880这样的MET抑制剂可能能够克服MET介导的对EGFR激酶抑制剂的耐药性,即使在含有T790米突变。
H820细胞中ERBB3信号传导依赖于MET状态。H820和PC-9细胞的裂解液,无论是未经处理的(仅DMSO对照;0μM)还是用0.3μM XL880或0.3μM CL-387785处理的,都通过使用抗磷酸-(p)-MET(Y1234/5),抗毒性MET,抗磷酸-(p)-ERBB3(Y1289),抗总ERBB3,抗磷酸-(p)-EGFR(Y1092)、抗总EGFR和抗肌动蛋白抗体。
H820细胞中ERBB3信号对MET的依赖性。
在这里描述的工作过程中,其他人报告说遇见扩增通过激活ERBB3信号导致肺癌对吉非替尼耐药(23). ERBB3是EGFR的异二聚体伴侣,在吉非替尼敏感的肺癌细胞系中调节磷脂酰肌醇3-激酶活性(24). 我们发现XL880处理强烈抑制H820细胞中ERBB3的磷酸化,但不抑制PC-9细胞中的ERBB3磷酸化。相反,CL-387785处理强烈抑制PC-9细胞中ERBB3的磷酸化,但不抑制H820细胞中的磷酸化().
为了确定XL880对H820细胞ERBB3磷酸化的抑制是否是由于MET激酶的抑制,我们转染了遇见-特异性siRNAs进入H820和PC-9细胞以抑制蛋白的表达。用MET siRNAs转染后,H820细胞提取物的免疫印迹法几乎无法检测到磷酸-MET和总-MET(SI图6). 与XL880的结果一致,H820细胞中的磷酸化ERBB3水平在用遇见siRNA。相反,我们在类似处理的PC-9细胞中观察到对磷酸-ERBB3状态没有影响,在用针对对照基因(GAPD)的siRNA处理的细胞中观察到对MET或ERBB3状态没有影响(SI图6). 因此,ERBB3信号似乎依赖于H820细胞中的MET蛋白,即使这些细胞含有MET蛋白表皮生长因子受体突变。
我们还测量了MET的siRNA敲除对H820细胞生长的影响。在多次实验中,用遇见siRNAs减少,而GAPD公司siRNA没有影响。然而遇见siRNA含量适中(在总细胞计数和生长抑制试验中,均在对照组的80%至90%之间;数据未显示),低于激酶抑制剂XL880的含量。因此,在H820细胞中,XL880可以抑制除MET外影响细胞活力的其他激酶。另外,XL880抑制激酶的效果与siRNA-介导的MET敲除的效果不同,因为后者可能会更缓慢地降低MET活性。
肿瘤样本遇见放大不足遇见突变。
获得功能突变遇见在散发型和遗传型人类肾乳头状癌中都发现了(25–27). 大多数突变位于编码受体激酶结构域的外显子(17). 在样品中遇见扩增和足够的DNA用于分析(样本2、6、10a、10b和H820细胞),我们测序了MET激酶域的编码区(外显子15-21),没有发现任何体细胞突变(数据未显示)。此外,我们在H820细胞中未发现MET激酶域(外显子3-14)以外的任何体细胞突变(数据未显示)。
讨论
在对EGFR抑制剂吉非替尼和埃洛替尼产生获得性耐药的患者中,约50%的肺腺癌中发现了EGFR激酶结构域790位的甲硫氨酸替代苏氨酸的突变(参考文献。8–12和本文)。这一知识已导致识别可克服T790M介导的耐药性的替代性EGFR抑制剂在体外也有可能出现在患者身上(19,20). 然而,其他机制也可能导致这些患者的疾病进展。
在这项研究中,我们使用了高分辨率全基因组分析表皮生长因子受体治疗前后的突变肿瘤样本表明遇见原癌基因作为对吉非替尼或埃洛替尼获得性耐药患者的额外治疗靶点。遇见编码一种异二聚体跨膜受体酪氨酸激酶,该激酶由结合到跨膜β链的胞外α-链二硫键组成(18,28). 受体与其配体肝细胞生长因子/分散因子结合,诱导受体二聚化,触发激活MET酪氨酸激酶活性的构象变化。MET激活可对细胞生长、存活、运动、侵袭和血管生成产生深远影响(17). MET信号的失调已被证明在许多恶性肿瘤中有助于肿瘤的发生。例如,激活突变与散发和遗传形式的人类乳头状肾癌有关(25–27). 此外,胃癌具有高水平遇见放大(29)和其他一些癌症表现出异常的转录上调遇见(30).
在我们对各种表皮生长因子受体我们发现了突变的肺腺癌样本遇见在43例获得性耐药患者中有9例(21%)扩增,而在62例未接触EGFR激酶抑制剂的患者中有2例(3%)扩增。在对371份原发性肺腺癌样本和242份匹配的正常对照进行的单独基因组分析中,遇见放大未被确定为重大复发性焦点事件(31). 因此,尽管遇见在肺癌中可以发现扩增(32,33)在从未用EGFR激酶抑制剂治疗过的肺腺癌中,这似乎是一种罕见的事件。
以下人员的在场遇见扩增与获得功能药敏相结合表皮生长因子受体突变一起可能导致细胞变化,从而增强对同时发生这两种变化的细胞的适应性。这个表皮生长因子受体T790M由于T790M的改变增强了EGFR激酶突变等位基因的致癌活性,因此抗性突变可以进一步增强此类肿瘤细胞的生长特性(34). 与此概念一致,40%的样本遇见在这项研究中的扩增包含了T790米突变。此外,我们发现现有的肺腺癌细胞系H820细胞含有表皮生长因子受体与药物敏感性相关的突变(E746-E749)表皮生长因子受体与耐药相关的突变(T790M),以及遇见放大。值得注意的是,这些细胞是从一名之前没有接受过吉非替尼或埃洛替尼治疗的患者身上分离出来的。因此,这些细胞可能并不代表“获得性抵抗”就其本身而言; 然而,它们的存在确实证明了所有这些遗传损伤都可能发生在同一个细胞内。
遇见扩增可通过激活ERBB3信号通路导致EGFR抑制剂耐药(23). 我们使用抑制MET激酶活性的小分子XL880和敲低MET表达的siRNA的数据表明,在H820细胞中,ERBB3信号高度依赖MET而非EGFR活性。H820细胞中EGFR、MET和ERBB3之间的相互作用似乎与在表皮生长因子受体吉非替尼耐药突变型肺腺癌细胞系(HCC827 GR)的筛选在体外(23). 在这些耐药细胞中,仅用MET抑制剂治疗并不影响ERBB3磷酸化。这种差异可能是由于细胞系的衍生方式差异很大。
最近,小分子MET抑制剂在I期试验中显示出作为抗癌治疗的前景(22). 我们的在体外数据表明,MET抑制剂XL880在抑制肺腺癌细胞活力方面更有效表皮生长因子受体T790米和遇见比可逆(厄洛替尼)或不可逆(CL-387785)EGFR抑制剂扩增。总的来说,这些发现表明XL880等化合物在治疗那些表皮生长因子受体突变型肺腺癌对现有EGFR抑制剂产生了获得性耐药性,这是由于遇见.
材料和方法
纸巾采购。
肿瘤标本是通过纪念斯隆-凯特琳癌症中心、爱知癌症中心中心医院、纽约大学医学中心、长庚纪念医院和国立台湾大学医院的机构审查委员会批准的方案获得的。所有患者均给予知情同意。
突变分析。
从肿瘤标本中提取基因组DNA,并为表皮生长因子受体参考文献中公布了(外显子18-24)分析结果。4和35PCR-RFLP分析外显子19缺失和L858R型和T790米参考文献中发表了错义突变。9和36从独立的PCR分离株中至少两次确认所有突变,并通过目视检查在正向和反向方向上回顾序列追踪。底漆遇见序列如下所示SI表4.
aCGH分析。
使用标准技术从肿瘤样本中提取基因组DNA。所有样本均使用正常基因组DNA(Promega)作为参考。使用生物素试剂(Invitrogen)和Cy3-或Cy5-dUTP对DNA进行消化和随机引物标记。标记的DNA与Agilent 244K CGH阵列杂交用于获得的抗性样品,与44K CGH阵列杂交用于未处理的样品。有关其他详细信息,请参阅SI方法.
细胞系和活性测定。
NCI-H820细胞由A.Gazdar(德克萨斯大学西南医学中心)开发。PC-9细胞是M.Ono(日本福冈九州大学)赠送的礼物。细胞在添加FBS的RPMI中生长。根据制造商的说明,使用CellTiter-Blue细胞活性试剂盒(Promega)进行生长抑制试验。使用H820细胞进行的所有分析至少进行了三次独立的分析;对于PC-9细胞,所有分析都至少进行了两次独立的测试(参见SI方法). 完整的aCGH数据集可在http://cbio.mskcc.org/Public/Bean_etal_PNAS_2007.
术语。
EGFR使用两种编号系统。第一个表示信号序列中起始的蛋氨酸为氨基酸−24。此处使用的第二个表示蛋氨酸为氨基酸+1。MET也有两种mRNA转录物,不同之处在于框内缺失54 nt(28,37); 由于缺乏这54 nt的亚型似乎是最丰富的亚型(38),我们认为全长MET蛋白由1390(而非1408)aa组成。
免疫印迹法。
请参见方法和支持文本参考文献。4有关细胞裂解和免疫印迹试剂的详细信息。所有分析至少进行了三次独立实验。请参见SI方法获取所用抗体的列表。
鱼类。
FISH是根据既定方案进行的(参见SI方法).
小干扰RNA。
根据制造商的说明,使用了靶加SMARTpool MET上的siGenome(L-003156)和靶加siCONTROL GAPD池(D-001830)(Dharmacon)。所有siRNA转染均独立进行三次(参见SI方法).
致谢。
我们感谢K.Politi、C.Sawyers和H.E.V.的有益讨论;T.Mitsudomi(日本名古屋爱知癌症中心医院)提供DNA样本;Z.Zeng和M.Weiser(纪念斯隆-凯特琳癌症中心)为遇见用于FISH的BAC探针;Exelixis提供XL880;以及所有同意组织采集的患者和/或其家属。这项工作得到了德克萨斯大学肺癌卓越研究专业项目国家癌症研究所拨款P50CA75907(发给A.G.)、U01-CA84999(发给W.G.)和R21-CA115051(发给V.M.)的支持;台湾国家科学委员会授予NSC95-2314-B-002-113-MY3(给J.-Y.S.)和NSC95-2314-B-002-227-MY3;长庚医学研究基金资助CMRPG 350031(给W.C.C.);国家卫生研究院拨款96-A1-MG-PP-04-014(给S.F.H.);多丽丝·杜克慈善基金会(W.P.)、托马斯·拉布雷克基金会(W.G.和W.P;国家健康基金会K08-CA097980和R01-CA121210(发给W.P.);Jodi Spiegel Fisher癌症基金会(W.P.);Carmel Hill基金(W.P.);以及矿工家族的资金。
注:。
在本文描述的工作过程中,其他人在确定遇见作为候选抗性基因在体外阻力建模方法(23). 在那项研究中,遇见在对吉非替尼或埃洛替尼耐药的18例肺癌中,有4例(22%)检测到扩增。此处检测的两个样品。该研究还分析了10a和10b(即患者12);结果基本一致。
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