钙依赖性的特异性转换与突触素结合的磷脂酰肌醇

摘要

突触传递的一个中心事件是释放神经活动区突触小泡的神经递质突触前神经末梢。此过程与神经到达后细胞内钙的增加脉冲，触发突触囊泡融合的激活机械(1，2). 具有吸引力的钙传感器候选人调节性胞吐是synaptotagmin（tagmin）的成员家族，由高度保守的整合膜蛋白组成广泛分布于神经元和非神经元组织(三，4). 在神经和神经内分泌系统，tagmin定位于突触小泡和分泌颗粒(4). 大多数蛋白质是细胞质，包含两个与蛋白激酶C、磷脂酶A2、，rabbhillin，以及最近在脂质激酶中的作用(5–7). 第一个两个结构域（C2A），其三维结构最近已解决(8，9)结合钙和酸性磷脂形成三元钙的浓度依赖性和特异性复合物类似于神经递质释放(10–12). 此外C2A结构域结合突触前膜蛋白syntaxin(13)，在中钙依赖方式(14，15). 第二个C2同源结构域（C2B）已证明与可溶性N个-乙基马来酰亚胺融合蛋白（NSF）附着蛋白（β-SNAP）(16)和肌醇聚磷酸盐（InsPP）(17)并负责钙依赖tagmin二聚(18，19). 此外，tagmin与β-SNAP能够招募NSF(20)并聚集一个大粒子含有α-SNAP和SNAP受体蛋白，可能是参与神经末端的对接和融合过程(16).除了生物化学数据，哺乳动物的遗传证据(21),果蝇属(22，23)、和秀丽隐杆线虫(24)强烈地表明tagmin是同步的主要钙传感器神经元释放神经递质。

虽然蛋白质在胞吐中的主要作用是无可争辩的，几种实验方法表明，脂质，尤其是磷脂酰肌醇的高磷酸化代谢产物，也起到在这一过程中的基本作用。嗜铬细胞瘤和嗜铬细胞瘤PC12细胞，钙刺激的分泌被PIns-4,5-二磷酸盐（PIns-4.5-P₂)游泳池磷脂特异性磷脂酶(25)或使用抗PIns-4,5-P₂抗体(26). 此外，三种细胞溶质蛋白参与磷酸肌醇代谢(27)，即PIns转移蛋白(28),PIns 4-激酶(29)和PIns-4P 5-激酶(26)是必需的钙依赖性分泌，但其分子基础多磷酰肌醇参与这一过程尚不清楚。

这里我们提供了生物化学证据，证明钙敏和聚磷酰肌醇，并观察到tagmin 1的C2B域显示与PIns-4,5-P型₂，其天然异构体PIns-3,4-二磷酸（PIns-3,4-P₂)和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIns-3,4,5-P_三). 生理钙离子浓度改变了这种相互作用的特异性，因此表明tagmin与聚磷酰肌醇的复合物构成一种可能用于调节胞吐的双峰钙传感器。

材料和方法

脂质体制备和结合测定。

脂质体（175μg每毫升脂质）由纯1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸胆碱（PC）或PC和1%（wt/wt）1-硬脂酰-2-花生四烯酸-锡-甘油-3-磷酸-d日-肌肉-肌醇（PIns）、PIns-4-磷酸盐（PIns-4-P）、PIns-4,5-P₂，1,2-二棕榈酰-锡-甘油-3-磷酸-d日-肌肉-肌醇-3,4-二磷酸（PIns-3,4-P₂),1,2-二棕榈酰-锡-甘油-3-磷酸-d日-肌肉-肌醇-3,4,5-三磷酸（PIns-3,4,5-P_三); 1μCi/ml（1 Ci=37 GBq）1,2-二棕榈酰-锡-甘油-3-磷酸-[甲基-^三H] 胆碱（66 Ci/mmol，Amersham）作为示踪剂加入。购买脂质来自Avanti Polar Lipids（PC和PIns），Boehringer Mannheim（PIns-4-P和PIns-4,5-P₂)或Matreya（宾夕法尼亚州Pleasant Gap；项目编号-3,4-P₂). 项目-3,4,5-P_三合成为之前描述过(30)其身份已被确认¹H-NMR和³¹核磁共振波谱。脂质通过缓缓流动氩气，溶解在200μl 100%乙醇中，然后在室温下保持真空30分钟。均质脂质然后将薄膜重新悬浮在20 mM Hepes·KOH（pH 7.6）、100 mM KCl中，和0.2 mM DTT（缓冲液A），剧烈搅拌10分钟，之后用氩气覆盖溶液顶部。制备脂质体要么通过超声波(12)然后进行脂质体纯化葡聚糖凝胶G-25 M（法玛西亚）或挤压(31). 大型骨料15000×离心消除克持续10分钟。纯化谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）-融合蛋白含有tagmin 1的细胞质结构域（aa 79–421；15μg）或仅GST（8μg）固定在20μl 50%谷胱甘肽-葡萄糖上珠子（Sigma）。然后用500μl含有1.0 mM游离镁的相同缓冲液²⁺和2 mM用2 mM EGTA缓冲EGTA或100μM游离钙。对于实验如图所示。​图2，2，PC脂质体（350μg脂质/ml）含有1%（wt/wt）的PIns-4,5-P₂和0.1μCi/ml的1-棕榈酰-2-[1-¹⁴C] 棕榈酰-锡-甘油-3-磷酸胆碱（55 mCi/mmol，Amersham）或1%（wt/wt）PIns-3,4,5-P_三和1μCi/ml1,2-二棕榈酰-锡-甘油-3-磷酸-[甲基-^三H] 胆碱（66 Ci/mmol，Amersham）按上述方法制备。两种脂质体以1:1的比例（最终脂质浓度175μg/ml）和游离钙²⁺浓度范围为1 nM在存在0.5 mM游离镁的情况下，达到300μM²⁺是通过添加适量的CaCl获得₂和氯化镁₂至缓冲液A中的2 mM EGTA。随后，100μl^三添加H标记的脂质体并孵育小球室温下摇晃30min。珠子是3000×离心克2分钟后洗三次含1.0 mM游离镁的缓冲液A的使用次数²⁺和相应游离钙量²⁺.结合脂质体为用0.3 ml 10%十二烷基硫酸钠溶解，并与然后通过闪烁计数测定颗粒。显示的数据是三个独立实验的平均值±SD。

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图2

PIns-4,5-P的钙依赖性₂和项目-3,4,5-P_三绑定到tagmin。GST-tagmin珠同时与两组PC脂质体孵育含有PIns-4,5-P₂或PIns-3,4,5-P_三在可变Ca²⁺浓度（○，PIns-4,5-P型₂; ▪, 项目-3,4,5-P_三).如前所述，测定与tagmin及其结构域结合的脂质体在图中。​图11.

胶束磷酰肌醇结合分析。

对于表观亲和常数和总亲和力的测定PIns-4,5-P的结合位点₂在tagmin上，1,2-二元醇-锡-甘油-3-磷酸-d日-肌肉[2-^三H（N）]肌醇-4,5-二磷酸（7 Ci/mmol；新英格兰核电）和未标记PIns-4,5-P型₂混合并用温和的水流干燥氩气。然后将脂质膜溶解在200μl的100%乙醇中微量溶剂在真空下被清除。PIns-4,5-P型₂以20的最终浓度溶解μM（20 Ci/mol），在含有0.8%（wt/vol）辛基的缓冲液A中β-d日-在2 mM EGTA和如上所述发出声音。对于图中所示的实验。​图44 C类和D类，天然tagmin（每个样品5μg）为牛大脑皮层OG膜提取物的免疫沉淀(16)用抗agmin单克隆抗体(32)共价耦合到蛋白质G-琼脂糖快速流动（Pharmacia）(33). 过夜后在4°C下孵育，用缓冲液A广泛清洗珠子含有0.5 M NaCl和0.8%OG，然后在缓冲液A中冲洗含0.8%OG。单体PIns-4,5-P₂在洗涤剂中将胶束与免疫纯化的天然tagmin混合或固定化GST标记蛋白（6μg）或对照珠，在4°C下培养30分钟存在2 mM EGTA，然后按照图所示进行分析。​图1。1。对于图。​图44D类，分析了珠子用SDS/PAGE和考马斯蓝染色R.通过孵化进行竞争实验饱和量为[^三H] PIns-4,5-P型₂（6μM）预混合增加肌醇1,2,3,4,5,6-六磷酸的浓度（InsP公司₆)在含有0.8%OG和2 mM EGTA在4°C下保持30分钟。用同样的方法清洗后缓冲液，测定放射性量和结果表示为在没有InsP公司₆.

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图4

PIns-4,5-P的结合₂到重组和天然tagmin是饱和的，并与之竞争InsP公司₆. (一个)GST-tagmin（•）或GST单独培养（○）时浓度增加放射性PIns-4,5-P₂在洗涤剂（OG）胶束中存在2 mM EGTA。样品分析如图所示。​图1。1.(一个)标记分钟/PIns-4,5-P₂摩尔比作为函数胶束PIns-4,5-P₂浓度。虚线代表PIns-4,5-P₂特别与标记最小值。使用Triton X-100进行的平行实验[0.02%（重量/体积）]给出了相同的结果（未示出）。(B类)GST-tagmin是在可饱和量的PIns-4,5-P型₂（6μM）随着InsP公司₆在2 mM EGTA的存在下。(C类)免疫沉淀的天然tagmin（•）或抗tagmin抗体单独（○）与放射性孵育PIns-4,5-P型₂在2 mM存在下的洗涤剂胶束中EGTA。虚线表示PIns-4,5-P₂特别是与tagmin关联。(D类)SDS/PAGE配置文件免疫纯化天然tagmin用于C类。除此之外表观分子量为65 kDa的tagmin单体还可以看到抗SDS的tagmin二聚体(37).

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图1

Tagmin专门绑定到钙依赖性聚磷酸肌醇脂质体方式。GST-tagmin与含有纯PC或PC和不同的聚磷酰肌醇（如图所示）不存在（阴影条，2 mM EGTA）或存在钙离子（固体棒，100μM游离钙²⁺). 通过以下方法量化脂质结合放射性PC作为示踪剂的液体闪烁计数表示为所用总放射性的百分比。特定绑定为通过减去GST的非特异性脂质相互作用（2.4±0.7%）。两者都获得了类似的结果有大小不等的单层小泡脂质体的曲率不影响其结合。

结果和讨论

已知Tagmin能结合可溶性肌醇多磷酸盐（InsPP）InsP₄，督察₅、和InsP₆(17). 测试tagmin上的InsPP绑定站点是否也可以绑定相应的脂质磷脂酰肌醇，含有与tagmin I（残基79–421）与含有PC的脂质体孵育和不同的肌醇磷脂[1%（wt/wt）]游离镁的生理浓度²⁺（0.5–1毫米）。小型纯PC制成的单层囊泡在缺乏的情况下不能结合tagmin或存在钙(11，12). PIns或PIns-4-P的加入也不会导致脂质体与tagmin结合（100μM）或在没有游离钙的情况下（图。​（图11一个). 天然磷脂酰肌醇二磷酸盐，PIns-4,5-P₂或PIns-3,4-P₂，仅限适度增加tagmin与脂质体的相互作用无游离钙（图。​（图11一个). 然而，根据相同条件下，PIns-3,4,5-P_三大力推广脂质体与tagmin的结合（图。​（图11).

钙（100μM）改变这些相互作用的特异性。tagmin与PIns-3,4,5-P的结合_三-含有脂质体大大减少了，而tagmin现在可以有效地绑定到这两者PIns-4,5-P型₂和PIns-3,4-P₂-包含脂质体（图。​（图1）。1). 使用native获得了类似的结果从大脑皮层免疫纯化tagmin（未显示），因此表明使用GST标签获得的结论具有一般性有效性。

图。​图22显示了PIns-4,5-P型₂和PIns-3,4,5-P_三绑定到游离钙浓度。PIns-4,5-P项目₂和PIns-3,4,5-P蛋白_三并入单独的脂质体人口，标记为[¹⁴C] 或使用[^三H] PC示踪剂。每种囊泡类型与含tagmin的珠子在混合培养中被测定为游离钙浓度的作用。Tagmin失去容量绑定PIns-3,4,5-P_三约0.1至1μM自由钙。它获得绑定PIns-4,5-P的能力₂逐渐超过约1μM游离钙，具有最大结合力仅在100μM范围内达到。钙依赖性改变PIns-4,5-P的浓度₂或PIns-3,4,5-P_三在脂质体中（数据未显示）。然而，镁（0.5–1.0 mM）必修的。在缺乏镁的情况下²⁺，钙依赖性tagmin与PIns-4,5-P的结合₂-含脂质体钙依赖性降低PIns-3,4,5-P的相互作用_三使用tagmin（未显示数据）。

Tagmin包含两个C2结构域，与钙和酸性同源蛋白激酶C的磷脂结合结构域(5，34). 越多N末端C2结构域（C2A）结合1,2-二元醇-锡-甘油-3-磷酸-我-丝氨酸（PS）[25%（wt/wt）]以钙依赖的方式K（K）_d日3-6μM(11，12). C端子C2越多结构域（C2B）结合InsPP(17，35). 含有细菌的珠子tagmin表达的GST-C2A或GST-C2B结构域与含有1%（wt/wt）PIns-4,5-P的脂质体₂或项目-3,4,5-P_三PIns-4,5-P₂和项目-3,4,5-P_三-脂质体的定向结合都发生在tagmin的C2B域，其效率类似或高于全长tagmin细胞质域（图。​（图3三 B类和C类). 而C2B结构域与PIns-3,4,5-P的相互作用_三减少了通过钙，对于整个细胞质域具有PIns-4,5-P的C2B域₂即使在缺钙，钙只会微弱增强，这意味着建议的两个C2域之间的协作性(36). 而已知C2A结构域可将含有PS的脂质体结合在钙依赖方式(11，12)，C2B域绑定包含PS的弱钙非依赖性脂质体(17，36)还有这个在我们的研究中得到证实，进一步确立了我们报道了与聚磷酰肌醇的结合（图。​（图3三一个).

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图3

tagmin上的多聚磷酰肌醇结合位点本地化为C2B域。含tagmin的GST融合蛋白或其N端（C2A；aa 96–265；10μg）或C端（C2B；aa248–421; 10μg）结构域与含有PC的脂质体一起孵育和25%（wt/wt）PS(一个)，1%（重量/重量）PIns-4,5-P型₂(B类)，或1%（wt/wt）项目-3,4,5-P_三(C类)（阴影条，2 mM EGTA；实心棒，100μM游离Ca²⁺). 脂质体与tagmin和其域如图所示确定。​图11.

tagmin和C2B与PIns-4,5-P的相互作用₂和项目-3,4,5-P_三-含有脂质体具有竞争力被InsP抑制₆（未显示），表明所有三个化合物与C2B结构域中的同一位点结合。InsP公司₆不影响含PS的钙依赖性相互作用含有tagmin或其C2A结构域的脂质体（未显示）。总之C2B域似乎优先与聚磷酰肌醇；然而，C2A域可能有一些绑定活动。全钙敏感性似乎需要C2A和C2B域。

PIns-4,5-P单个分子的结合₂（作为与含有PIns-4,5-P的脂质体不同₂)到tagmin可以直接测量，因为有放射性标签PIns-4,5-P型₂.放射性标记PIns-4,5-P₂是使用大量过量的洗涤剂分散在OG胶束中，以确保至多有一个PIns-4,5-P分子₂每洗涤剂胶束。饱和时几乎正好为1摩尔PIns-4,5-P型₂每摩尔tagmin结合（图。​（图44一个)，带有明显的K（K）_d日约1μM。与tagmin的绑定不同至PIns-4,5-P₂包含在脂质双层囊泡中胶束PIns-4,5-P的结合₂单体独立于钙。对此的解释尚不清楚。督察₆竞争使用此绑定，使用K（K）_我约10μM（图。​（图44B类). 全长天然tagmin，免疫纯化自带有针对其第一个C2同源性的抗体的大脑皮层领域(32)（图。​（图44D类)，显示饱和和PIns-4,5-P的化学计量结合特性₂（图。​（图44C类)用重组蛋白进行了观察。InsP公司₆抑制胶束相互作用PIns-4,5-P型₂含有天然蛋白质的单体，但较少比用重组tagmin观察到的有效(K（K）_我≥100μM；未显示）。

据估计，InsPP的细胞内浓度较低微摩尔范围(38)，这不太可能干扰在里面活泼地tagmin与聚磷酰肌醇的结合此处描述。突触前注射高浓度InsPP导致神经递质释放的可逆阻滞(39). 我们以前认为这种抑制可能是由于β-SNAP与tagmin的C2B结构域的结合在体外(16). 新发现表明，InsPP可以还通过竞争tagmin与PIns-4,5-P型₂和/或PIns-3,4,5-P_三.

PIns-4,5-P的绑定₂和PIns-3,4,5-P_三到tagmin非常具体，如下所示(我)缺少tagmin与含有PIns和PIns-4-P的脂质体结合；(ii（ii）)PIns-4,5-P的饱和结合₂以1:1标记化学计量；(三)上述竞争性抑制可溶性肌醇衍生物InsP的结合反应₆;和(iv（四）)特异性的转换项目-3,4,5-P_三至PIns-4,5-P₂作为的函数游离钙离子。

当游离钙浓度从静止（基础）水平升高时（≤30 nM）至约0.1至10μM，tagmin将其PIns-3,4,5-P的特异性_三至PIns-4,5-P₂.已知许多具有不同功能的蛋白质含有C2结构域(5–7)或已知绑定InsPP(35)我们建议他们，也可能具有可切换的脂质结合特异性，尽管这种切换可能是由钙结合以外的机制引起的。

多聚磷酰肌醇与tagmin和钙依赖性开关在其特异性意义上的作用机制胞吐？一种PIns特异性转移蛋白，PIns 4-激酶（合成PIns-4-P），一种PIns-4_P 5-激酶（合成PIns-4,5-P型₂)和PIns-4,5-P₂或项目-3,4,5-P_三触发熔合需要钙(26，28，29). 此外，钙的浓度低于ATP依赖性需要胞吐阈值（1–10μM“启动”阶段(40). 游离钙会引发胞吐高于约20μM的阈值(41)，相同的范围tagmin绑定PS并已从绑定PIns-3,4,5-P切换_三至PIns-4,5-P₂（图。​（图2）。2). 我们的数据现在可以解释聚磷酰肌醇合成和钙的需求启动步骤。tagmin的C2B结构域可以与项目-3,4,5-P_三基础钙，代表休息（关闭）构造。钙在低微摩尔范围内增加，与停靠在活动区，但不在Ca附近²⁺-通道(42，43)，会从PIns-3,4,5-P中释放C2B域_三并触发绑定到PIns-4,5-P₂代表一种融合能力“on”构象。此开关（以及与PS的绑定）可以是在快速触发后发生的胞吐中起重要作用钙水平升高。对PIns特异性转移蛋白的需要启动期间的4-激酶和PIns-4-P5-激酶活性(26，28，29)因此可以解释为需要维护一个PIns-4,5-P型₂可用于绑定C2B域从PIns-3,4,5-P中释放_三.

这个模型如何适应突触囊泡循环？如果项目-3,4,5-P_三池位于突触小泡上PIns-4,5-P型₂池位于突触前膜活性区，然后在距离膜一定距离处的囊泡，感应钙的少量增加，可以在钙补充期间被动员起来波，从PIns-3,4,5-P切换_三到PIns-4,5-P型₂.这些小泡能够熔化在下一波中，他们将再次经历上升局部钙浓度，现在达到了更高的水平。这会为对接和融合创建一条装配线。

而神经末梢中突触小泡的融合率为游离钙浓度为200μM时最大值的一半，增加了约三个数量级幅度在20–300μM Ca之间²⁺浓度钙触发聚变的程度几乎完全独立于如果钙高于阈值约为20μM(41). 20μM游离钙²⁺一完全融合只需50毫秒，对于突触来说速度较慢，但速度很快适用于几乎所有其他类型的细胞。该阈值与C2A结构域结合PS所需的钙浓度(11，12)C2B从PIns-3,4,5-P切换_三到PIns-4,5-P型₂（图。​（图2）。2). 除了这些脂蛋白据报道，tagmin可以结合t-SNARE结合蛋白(14，15)在高钙范围内自我结合存在于生理水平(18，19). 所有这些相互作用可能同样有助于将融合“打开”作为对细胞内钙升高。关于监管的这一观点从tagmin的角度来看，胞吐仍有待证实与通常在对接和融合，如SNAP受体(33)、α-和β-SNAP(44)，美国国家科学基金会(20). 然而，已知tagmin的C2B域绑定Ca中的β-SNAP和NSF²⁺-独立时尚与组装与它们和α-SNAP和SNARE进行假定的对接和融合胞吐颗粒(16). 定义明确、重组需要在脂质体系统中进行钙依赖性融合反应以形成一个连贯的观点，其中可以更好地理解各种结合反应。

致谢

脚注

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