通过单基因给药myostatin抑制剂长期增强骨骼肌质量和强度

摘要

肌肉增强策略已被提出用于许多神经肌肉疾病，包括肌肉营养不良和与年龄相关的肌肉疾病，并显示出构建或再生更强壮、更健康的肌肉的良好结果(1). 这些策略主要集中在营养因子的使用上，如诱导肌细胞前体增殖和肌纤维肥大的胰岛素样生长因子-1(2). 最近，人们注意到抑制肌肉生长抑制素的潜在益处，导致肌肉生长抑素缺乏牛的肌肉表型加倍(三——5)和肌抑制素基因敲除小鼠(6,7). 肌生长抑制素是一种转化生长因子-β（TGF-β）家族成员，在调节骨骼肌质量中起关键作用(8,9). 肌生长抑制素似乎具有两个不同的作用：调节发育过程中形成的肌纤维数量和调节肌肉的出生后生长。许多肌肉疾病的各种药理学方法正在探索生后肌肉生长的调节。抗肌生长抑制素的中和抗体在营养不良患者中的应用前景看好中密度纤维板老鼠(10)然而，关于老年动物分娩时增强肌肉的功效，已有不同的报道(11). 此外，最近的数据表明，使用脱乙酰酶抑制剂治疗的肌营养不良小鼠的肌肉质量增强和形态恢复。由此产生的肌肉增强归因于卵泡抑素蛋白的增加，该蛋白在一定程度上抑制了肌抑素的活性(12). 曲古菌素A（TSA）治疗需要每天服用，在可能存在非靶向效应的老年动物中未进行评估。

能够调节肌抑素活性的肌抑素结合蛋白的鉴定为产后肌肉增强提供了潜在的新方法，并扩大了基因治疗被视为抑制肌抑素活动的方法的潜力。卵泡抑素（FS）已被证明与一些TGF-β家族成员结合，并可作为一种有效的肌抑素拮抗剂发挥作用。通过转基因方法在肌肉中过度表达卵泡抑素已被证明可以促进肌肉生长体内(13)缺乏卵泡抑素会导致出生时肌肉质量下降(14). 最近的数据还表明，卵泡抑素能够通过独立于肌抑素信号级联的途径控制肌肉质量。在这些研究中，肌肉生长抑制素基因敲除小鼠与携带卵泡抑制素转基因小鼠杂交。与仅因缺乏肌抑制素而观察到的肌质量加倍相比，由此产生的小鼠的肌质量增加了四倍，证实了卵泡抑制素在肌肉质量调节中的作用不仅仅限于抑制肌抑制酶(15). 除了卵泡抑制素外，还发现了另外两种参与肌抑制素调节的蛋白质。卵泡抑素相关基因（FLRG）与卵泡抑素极为相似，并被证明能抑制激活素和多种骨形态发生蛋白在体外(16,17). 生长和分化因子相关血清蛋白-1（GASP-1）是一种蛋白质，已被发现含有与蛋白酶抑制剂蛋白相关的多个结构域，以及与卵泡抑素中的10-半胱氨酸重复序列同源的结构域。GASP-1被证明直接与成熟的肌抑制素和肌抑制蛋白前肽结合，并抑制肌抑制酶的活性(18). 尽管重组蛋白注射或肌生长抑制素阻断抗体是可行的策略，但表达这些肌生长抑素抑制剂基因的基因治疗可能因多种原因而被证明是一种更有效的治疗途径，包括缺乏对抗体治疗的潜在免疫反应以及需要多次注射。

在此，我们报告称，出生后一次性肌肉注射编码肌抑制素抑制蛋白的腺相关病毒（AAV）可长期改善野生型动物的肌肉大小和力量。肌生长抑制素抑制剂蛋白在营养不良中的递送中密度纤维板即使给6.5个月大的动物服用，动物也能逆转肌肉病理学并提高力量。具体而言，我们在这里显示，卵泡抑素-344对肌肉大小和功能的影响最大，并且在雄性或雌性治疗动物中耐受性良好，对心脏病理学或生殖能力没有不良影响。

结果和讨论

AAV介导的肌肉基因传递提供了一种系统，可在靶组织中生成高水平蛋白质，或通过血液循环将分泌产物输送至偏远部位(19). 我们克隆了已知的分泌型肌抑制素抑制基因，包括生长和分化因子相关血清蛋白-1（GASP-1）(18)，卵泡抑素相关基因（FLRG）(17)和follistatin-344（FS）(13)进入AAV血清1型，显示出较高的肌肉转导能力。卵泡抑素有两种亚型由选择性剪接产生。FS-344变异体经过肽裂解生成FS-315亚型，另一个FS-317变异体在肽裂解后生成FS-288亚型。我们使用了人类FS-344变异体，该变异体专门产生血清循环FS-315亚型FS，并包含一个C末端酸性区域(20). 我们选择FS-344（FS），因为缺乏C末端的另一种FS-317亚型优先定位于卵巢滤泡液，并通过硫酸肝素蛋白聚糖表现出较高的组织结合亲和力，这可能会影响生殖能力并与其他非靶点结合(21). FS-288代表卵泡抑素的膜结合形式(22)是垂体促卵泡激素的有效抑制剂(23)，存在于卵巢的卵泡液和睾丸中，并对卵巢的颗粒细胞具有高亲和力。

我们试图确定这些蛋白质在正常和营养不良小鼠中增加肌肉质量的功效。我们给药1×10¹¹每只动物的AAV1病毒颗粒编码FS、FLRG、GASP-1或GFP，双侧进入4周龄野生型C57BL/6小鼠的股四头肌和胫骨前肌。与GFP治疗的对照组相比，725天龄时，所有接受肌肉生长抑制素抑制剂治疗的动物的体重都有所增加，肌肉明显增强(图1 一和b条). 对单个肌肉重量的评估表明，所有经肌肉生长抑制素抑制剂治疗的动物的肌肉质量都有所增加，而经FS-治疗的动物增加最多。注射部位的后肢肌肉和远端肌肉（如三头肌）的肌肉质量增加。因此，这些抑制剂从肌肉注射部位分泌到循环中，增强远端部位的骨骼肌质量(图1c（c）). 增大的肌肉质量伴随着功能的改善，表现为后肢握力的增加(图1d日). 对心肌细胞的心脏质量或组织学外观没有影响，表明肌抑制素抑制对骨骼肌组织具有选择性（数据未显示）。有人担心FS会对性腺功能产生不利影响。我们发现用携带FS344转基因的AAV1（AAV1-FS，表1)此外，与对照组相比，我们在FS治疗组的性腺组织中未发现组织学/病理学改变（数据未显示）。

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图1。

肌肉生长抑制素抑制剂蛋白增加野生型C57BL/6小鼠的肌肉质量和力量。(一)与注射AAV1-GFP的对照组相比，725天龄时所有经肌肉生长抑制素抑制蛋白处理的小鼠的后肢总肌肉质量增加。(b条)注射AAV1-FS后，总体重显著增加（**，P（P）≤0.01）和AAV1-GASP-1注入（*，P（P）≤0.05）小鼠与725日龄AAV1-GFP对照组相比(n个= 10). (c（c）)注射表达肌抑制素抑制剂蛋白的AAV的小鼠个体后肢和前肢肌肉的质量增加(n个= 10). *,P（P）≤ 0.05. (d日)与AAV1-GFP对照组相比，所有经AAV1-FS治疗的小鼠后肢握力提高了2年以上(n个= 10). 误差条表示标准误差。

考虑到FS给药的强大效果，我们接下来测试了AAV1-FS在出生后以具有临床意义的范式给药的潜力，以增加肌肉质量和力量，并延缓中密度纤维板杜氏肌营养不良（DMD）小鼠模型。杜氏肌营养不良是一种X染色体连锁的隐性疾病，导致骨骼肌和心脏功能的损耗，最终导致死亡。最近，FS在中密度纤维板动物过度表达卵泡抑素基因的重复结构域。结果显示肌肉质量增加，病理学减弱，尽管结果仅记录到15周大(24). 在我们的研究中，中密度纤维板动物双侧股四头肌和胫骨前肌注射低（1×10¹⁰病毒颗粒）或高剂量（1×10¹¹病毒颗粒），并在尸检前随访5个月。在低剂量和高剂量治疗动物的血清中检测到循环FS水平增加，高剂量组血清检测到的FS水平最高（高剂量组为15.3±2.1 ng/ml；低剂量组为6.8±0.4 ng/ml，GFP对照组为0±0.1 ng/ml；n个=每组8人；P（P）< 0.01). 我们证明，与GFP治疗的对照组相比，AAV1-FS增加了体重，高剂量FS组增加最多（数据未显示）。与经AAV1-GFP治疗的动物相比，经AAV1-FS治疗的小鼠的肌肉尺寸显著增加(图2一)高剂量FS-处理的动物个体肌肉重量增加最大(图2b条). 效果并不局限于注射肌肉；他们也在远离直接靶肌肉的部位发现(图2b条). 与GFP治疗对照组相比，肌肉质量增加导致治疗动物后肢和前肢肌肉力量的剂量依赖性改善(图2c（c）). AAV1-FS注射肌肉和偏远部位的组织学和形态计量学分析显示肌纤维肥大，支持尸检时的大体观察(图3 a–c). 此外，AAV-FS治疗动物的肌纤维类型没有改变；然而，在接受高剂量AAV-FS治疗的动物中，胫骨前肌每平方毫米面积的总纤维较少(图3 d日和e（电子）). 令人惊讶的是，与GFP处理的对照组相比，FS-处理的小鼠的血清肌酸激酶显著降低(图4一). 这很有趣，因为尽管FS缺乏对潜在的肌营养不良蛋白缺乏的纠正，但它具有保护作用。确切的机制尚不清楚，但有人可能推测，增加单个纤维的强度使其不易受到正常活动压力的损害。卫星细胞参与生后肌抑制素抑制尚待完全解决；然而，我们没有看到FS治疗动物的肌肉卫星细胞标志物发生统计变化（数据未显示）。

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图2。

单次注射AAV1-FS可增加年轻人的肌肉质量和力量中密度纤维板老鼠。(一)注射AAV1-FS后，后肢肌肉总量增加中密度纤维板与注射AAV1-GFP的对照组相比，180天龄的动物。(b条)与AAV1-GFP对照组相比，在3周龄注射AAV1-FS的小鼠在180天龄时，个体后肢和前肢肌肉的质量增加(n个= 15). *,P（P）≤ 0.05. (c（c）)幼儿握力的提高与剂量有关中密度纤维板在3周龄时给小鼠注射AAV1-FS，持续180天(n个= 15). 红色，高剂量AAV1-FS；蓝色，低剂量AAV1-FS；绿色，AAV1-GFP控件。误差条表示标准误差。

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图3。

中密度纤维板在3周龄时用AAV1-FS治疗的小鼠，随后180天显示肌纤维肥大。(一)与AAV1-GFP对照组相比，注射AAV1-FS的胫骨前肌H&E染色显示肌纤维肥大。（原始放大倍数，×40.）(b条)与注射AAV1-GFP的对照组相比，注射AAV1-FS的小鼠胫骨前部（以孵化线表示）暗（慢开关氧化）、中间（快速抽搐氧化糖酵解）和轻（快速抽动糖酵化）肌纤维的平均直径显著增加。(P（P）< 0.001;n个= 5). (c（c）)与注射AAV1-GFP的对照组相比，注射AAV1-FS的小鼠三头肌中中间肌纤维和轻肌纤维的平均直径（以阴影线表示）显著增加。(P（P）< 0.001;n个= 5.) (d日)通过琥珀酸脱氢酶（SDH）染色测定的暗、中、光纤维的分布在高或低剂量的AAV1-FS处理后没有改变。(P（P）>各组间0.05；n个= 5.) (e（电子）)每无偏差0.14 mm计数的平均光纤数²考虑到肌纤维平均直径增加，AAV1-FS处理小鼠胫骨前部的计数框减少。(*,P（P）< 0.01;n个=5.）误差条代表标准误差。

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图4。

中密度纤维板经AAV1-FS治疗的小鼠显示肌肉损伤和衰老标记物减少中密度纤维板小鼠对FS治疗反应灵敏，功能受益。(一)与注射AAV1-GFP的对照组相比，注射AAV1-FS后3个月的血清肌酸激酶水平（单位/升）降低。(*,P（P）< 0.05;n个=10.）误差条表示标准误差。(b条)后肢握力显著增加(P（P）≤0.05）在老化275天及以上中密度纤维板210天龄时用AAV1-FS治疗的小鼠(n个= 15). 红色，高剂量AAV1-FS；绿色，AAV1-GFP控件。(c（c）)与注射GFP的对照组相比，在210天龄时注射FS后，老年腓肠肌的H&E染色显示病理学降低。（原始放大倍数，×40.）(d日)210天龄注射FS的动物的H&E染色膈膜显示晚期脂肪替代少于注射GFP的对照组。（原始放大倍数，×20.）

我们还评估了AAV1-FS增加肌肉力量的潜力中密度纤维板动物在老年时接受治疗。我们发现，在210天大时注射AAV1-FS，给药后约60天的肌肉力量增加，并且在本研究评估的560天内，肌肉力量的增加持续了很长时间(图4b条). 早在180天大时，在AAV1-FS治疗之前，未经治疗的患者的肌肉中就有明显的病理中密度纤维板动物，具有显著的肌内膜结缔组织增生和炎症(图4 c（c）和d日). 560日龄时腓肠肌和膈肌的病理学评估表明，经AAV1-FS治疗的动物坏死肌纤维和单核细胞浸润的局灶群明显减少。重要的是，AAV1-FS治疗的动物显著减少了肌内膜结缔组织增生的局部区域，这在GFP治疗的动物中很明显，表明FS-治疗的动物肌营养不良的标志性纤维化减少(图4c（c）). 膈膜的病理学也表明，与GFP治疗的动物相比，FS-治疗可以减少炎症和脂肪置换(图4d日). 此外，与对照组GFP治疗动物相比，AAV1-FS治疗组在此年龄段的肌肉纤维直径显著增加(图4 c（c）和d日). 这些结果表明，FS抑制肌肉生长抑制素对老年人有益中密度纤维板经历了多轮肌肉退化和再生的动物。转化为临床平行结果表明，AAV-介导的FS基因治疗对老年DMD患者可能具有潜力，而不依赖于替换缺失的基因，并且可能在类似IGF-1和微营养不良蛋白基因替换的联合治疗中发挥潜在作用(25).

这些结果表明，单次注射AAV1可通过FS-344抑制肌肉生长抑制素，可增强肌肉大小和力量，且耐受时间>2年。FS344的结果可能提供了一种比其他仅以肌抑制素为靶点的更有效的策略，因为其具有加性效应，例如卵泡抑制素参与多种信号通路，并且最近的发现表明内毒素血症模型的炎症减轻(15,26). FS具有显著的能力，能够长期改善老年动物的营养不良肌肉的总体和功能，因此，有必要考虑临床开发，以治疗肌肉骨骼疾病，包括老年DMD患者。

材料和方法

致谢。

脚注

工具书类