《美国肾脏病杂志》。2008年3月；19(3): 469–476.
Nek8调节多囊藻毒素-1和2的表达和定位
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Eisei Sohara公司
*肾科和†马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布里格姆女子医院医学部遗传科
英罗
*肾科和†马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布里格姆女子医院医学部遗传科
张晶晶
*肾科和†马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布里格姆女子医院医学部遗传科
丹妮尔·曼宁
*肾科和†马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布里格姆女子医院医学部遗传科
大卫·R·拜尔
*肾科和†马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布里格姆女子医院医学部遗传科
荆州
*肾科和†马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布里格姆女子医院医学部遗传科
*肾科和†马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布里格姆女子医院医学部遗传科
通信：周静博士，哈佛医学院，布莱根妇女医院522室，哈佛医学院，4 Blackfan Circle，Boston，MA 02115。电话：617-525-5860；传真：617-525-5861；电子邮件：ude.dravrah.hwb.scir@uohz 2006年9月10日收到；2007年8月29日接受。
- 补充资料
[补充数据]
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摘要
Nek8是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在杰克（青少年囊性肾）小鼠，一种常染色体隐性遗传青少年多囊肾病模型，但其功能尚不清楚。我们使用了杰克小鼠研究Nek8和其他多囊肾病相关蛋白之间的功能关系。在野生型小鼠的集合小管和集合管中，我们发现Nek8定位于初级纤毛的近端部分，在细胞质中检测到较弱。在杰克然而，在整个纤毛长度上都发现了Nek8突变体。免疫共沉淀实验表明Nek8与多囊蛋白-2相互作用，但与多囊蛋白酶-1没有相互作用，并且杰克突变并不影响这种相互作用。Western blot分析和实时逆转录酶PCR显示，多囊蛋白-1（PC1）和多囊蛋白-2（PC2）的蛋白和mRNA表达在杰克小鼠肾脏。这个杰克突变还导致PC2磷酸化蛋白异常，这与纤毛更长以及PC1和PC2的纤毛堆积有关。我们的数据表明，Nek8与多囊蛋白的信号转导途径相互作用，并可能控制这些纤毛蛋白的靶向性。Nek8功能障碍可能通过改变远端肾单位纤毛的结构和功能导致膀胱生成。
NIMA（在有丝分裂中从未出现，基因A）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶巢状曲霉这已被证明在有丝分裂的进展中起作用。NIMA缺陷导致细胞在G2期停滞，而NIMA过度表达导致有丝分裂事件提前发生。1,2NIMA相关激酶（Nek或Nrk）嗜热四膜虫Nrk-1和Nrk-2定位于基底体和纤毛并调节纤毛长度。三Fa2p是NIMA的同源物莱茵衣藻并已被证明在细胞周期进展和脱细胞过程中的微管切断中发挥作用。4最近发现Fa2p定位于纤毛近端衣原体和培养的肾上皮细胞，其激酶活性是爆燃所必需的。5
迄今为止，已有11个Nek家族成员从小鼠或人类细胞中克隆出来，其中Nek2被认为是NIMA最接近的同源物，因此受到了最深入的研究。Nek2在中心体结构和功能与有丝分裂进程的协调中起着重要作用。这也是G2-M细胞周期转换时中心体分离所必需的。6,7Nek1是第一个被确认的家族成员，被发现在凯特小鼠，具有多效性效应，包括面部畸形、矮小、雄性不育、贫血、囊性脉络丛和进行性多囊肾病（PKD）。8,9另一名Nek家族成员Nek8被发现在杰克（幼年囊性肾）小鼠，发育为常染色体隐性遗传幼年PKD（ARJPKD）。10发现人类Nek8在原发性乳腺肿瘤中过度表达，表明Nek8与细胞增殖有关，NIMA家族其他成员也是如此。11然而，Nek1和Nek8的功能及其在PKD囊肿形成中的作用尚不清楚。
常染色体显性PKD（ADPKD）是PKD的主要形式，其发病率为1/400至1/1000。多囊蛋白-1（PC1）和多囊蛋白-2（PC2）是几乎所有ADPKD患者中突变的两个分子。PC1是一种完整的膜糖蛋白，约460kD，位于肾上皮的质膜和纤毛中。12–18PC2是PC1的功能性伴侣，是一种约110 kD的完整膜蛋白。PC2在内质网、质膜和纤毛中具有钙通道功能。17–21常染色体隐性PKD（ARPKD）相关蛋白也存在于肾上皮的纤毛中，如胱氨酸氯化钾（先天性多囊肾）小鼠模型，22北极星奥普克（橡树岭多囊肾）小鼠模型，23,24人ARPKD中的纤维囊蛋白。25,26
在本研究中，我们报告了Nek8蛋白位于小鼠肾小管初级纤毛的近端区域，并且与PC2位于相同的蛋白复合物中。Nek8的睫状体定位仅在集合管和集合管中观察到，在集合管中，囊肿在杰克老鼠。两者的转录第1页和第二页基因被上调。初级纤毛中PC1和PC2表达增加，PC2磷酸化异常杰克小鼠肾脏。这些数据表明，Nek8调节PC1和PC2的正常表达以及PC2的磷酸化。此外，Nek8控制或调节PC1和PC2的睫状体定位。Nek8突变导致多囊蛋白的异常转录和定位，最终导致杰克小鼠肾脏。
结果
Nek8位于肾小管初级纤毛近端
用亲和纯化的Nek8抗体对3月龄野生型小鼠肾脏进行免疫组化。10在肾组织中，Nek8与初级纤毛共定位(). Nek8的细胞内信号微弱。Nek8抗体与其抗原肽的预孵育可以阻断Nek8的纤毛和细胞内信号，而纤毛标记物的信号保持不变(). 高倍免疫组织化学图像显示Nek8在初级纤毛上的定位局限于近端(，C至E）。
Nek8定位于肾小管初级纤毛近端体内（A）抗Nek8抗体（绿色）肾小管的免疫荧光显示其纤毛定位和与纤毛标记物乙酰化-α-微管蛋白（红色）的共定位。箭头表示Nek8信号。（B） Nek8抗体与其抗原预孵育可以阻断Nek8的纤毛和细胞质信号，而纤毛标记物的信号仍然存在。（C至E）两个纤毛的放大图像显示Nek8定位于初级纤毛的近段，与乙酰化-α-微管蛋白的信号重叠。
近端小管初级纤毛中无Nek8
为了研究Nek8的睫状体定位特征，我们用Nek8和莲花凝集素（LTL），一种近端小管标记物或双花扁豆凝集素（DBA），一种集管和集管标记物。Nek8的细胞质信号在代表近端小管的LTL阳性小管中最为明显(，A至C）。然而，在这些小管中未检测到纤毛Nek8。相反，在DBA阳性小管中可以看到Nek8的纤毛定位，这些小管代表收集小管和收集导管，其中细胞溶质信号较弱(、D和G）。Nek8在髓质集合管中也可见纤毛定位(). 为了研究睫状体Nek8的表达与囊肿形成之间是否存在相关性杰克小鼠肾脏组织染色杰克DBA和LTL小鼠(、I和J）。大多数囊肿位于杰克小鼠DBA染色阳性，没有一个囊肿用LTL染色，这表明集合小管和集合管中的纤毛Nek8参与了杰克老鼠。
纤毛Nek8仅见于集管和集管。（A至C）Nek8（红色）的纤毛定位仅在阴性的小管中观察到莲花凝集素（LTL）是一种近端小管标记物，尽管在LTL阳性小管（绿色）中胞浆信号明显。箭头表示Nek8的睫状体信号。（D至F）Nek8（红色）的纤毛定位仅在阳性的小管中观察到双花扁豆凝集素（DBA）是一种集合小管标记物（绿色），表明纤毛Nek8仅在集合小管至集合管的纤毛中表达。皮质（G）和髓质（H）DBA阳性（绿色）小管Nek8染色（红色）的放大免疫荧光图像。肾切片LTL（I）和DBA（J）染色（绿色）杰克鼠标。囊肿杰克小鼠只被DBA染色。蓝色DAPI染色显示细胞核。
Nek8蛋白复合物含有PC2
确定多囊蛋白是否在卵巢囊肿形成中起作用杰克在小鼠中，我们测试了Nek8蛋白与PC1或PC2的相互作用体内在3个月龄野生型和杰克老鼠。野生型小鼠肾脏裂解液中PC2免疫共沉淀Nek8()，表明Nek8与PC2处于相同的蛋白质复合物中体内PC2在来自杰克和野生型小鼠()表明Nek8-PC2相互作用在杰克鼠标。PC2与Nek8的相互作用通过Nek8抗体的联合免疫沉淀得到证实(、B和C）。Nek8抗体识别Nek8免疫沉淀物中的单一带(). 为了进一步验证PC2和Nek8之间的相互作用，我们使用慢病毒系统敲除了内髓集合管（IMCD）细胞中的PC2(，D至F）。表达PC2 shRNA的慢病毒颗粒感染IMCD细胞后，PC2蛋白显著下调，PC2抗体的Western分析显示(). Nek8抗体能够在载体感染的对照细胞中协同免疫沉淀PC2，但不能在PC2击倒细胞中协同沉淀()，尽管Nek8存在于两种细胞系中。此外，PC2仅能在对照细胞中协同免疫沉淀Nek8，但在PC2敲除细胞中不能协同免疫沉淀(). 有趣的是，Nek8不能在两种来源的组织裂解液中共同免疫沉淀PC1杰克或野生型小鼠(). 这些数据表明Nek8与PC2相互作用，但与PC1无关，Nek8的错义突变杰克小鼠不会破坏其与PC2的相互作用。PC1和PC2之间的相互作用存在于两者的组织裂解物中杰克和野生型小鼠（数据未显示）。
PC2和Nek8之间的相互作用。（A） 用PC2抗体免疫沉淀肾脏匀浆。顶部，野生型（WT）和突变型Nek8均由PC2共同免疫沉淀。底部，PC2存在于PC2中，但不存在于IgG免疫沉淀样品中。（B和C）用Nek8抗体共同免疫沉淀肾匀浆：（B）PC2在WT和Nek8中共同免疫沉淀杰克小鼠（箭头指向PC2）；（C） Nek8抗体在Nek8免疫沉淀物中仅检测到一条带（左，与B所示相同的印迹）。（D至F）使用基于慢病毒的PC2敲除系统内髓集合管（IMCD）细胞验证PC2-Nek8相互作用。（D） 选择嘌呤霉素后，感染IMCD的PC2带消失第二页击倒病毒。相反，PC2仍然存在于感染对照慢病毒的IMCD中。GAPDH用作加载控制。（E） 细胞裂解物与Nek8抗体的共免疫沉淀。在对照中，PC2与Nek8共免疫沉淀，但在PC2敲低的IMCD细胞中没有。IgG被用作免疫沉淀对照（顶部）。Nek8抗体可以在PC2击倒细胞和对照细胞中免疫沉淀（底部）。（F） 细胞裂解物与PC2抗体的共免疫沉淀。Nek8在对照组中与PC2共免疫沉淀，但在PC2敲低的IMCD细胞或IgG免疫沉淀中没有。（G） PC1没有与Nek8抗体共同免疫沉淀（顶部），尽管Nek8抗原可以自身免疫沉淀（底部）。左上方的通道显示PC1存在于来自杰克小鼠肾脏。（H） PC2蛋白的异常修饰见于杰克小鼠肾脏（开放箭头）。IgG被用作免疫沉淀的对照。
PC2磷酸化增加杰克老鼠
用PC2抗体进行免疫沉淀后，在杰克小鼠肾脏，但不在野生型小鼠肾脏中(). 西方分析证实在杰克小鼠，而非野生型小鼠()PC1表达水平增加(、B和C）。为了确定哪种蛋白质修饰是PC2这条额外带的原因，我们进行了去磷酸化分析(). 用蛋白磷酸酶1处理导致杰克样本，表明PC2在杰克老鼠。PC1和PC2表达的增加也见于15天龄小鼠的肾脏样本（补充图I）。
PC1上调和PC2异常磷酸化杰克小鼠肾脏。用PC2（A）或PC1（B和C）抗体对肾匀浆进行免疫印迹。（A） PC2蛋白的异常修饰见于杰克小鼠肾脏（开放箭头）与WT肾脏的比较。PC2过度表达的IMCD裂解物用作阳性对照（Ctl），暴露时间更短。（B和C）PC1蛋白水平在杰克小鼠肾脏（箭头），用PC1的N末端（B）和C末端（C）抗体检测。A至C的底部面板是通过膜的Ponceau染色显示的荷载控制装置。（D） 用蛋白磷酸酶1（PP1）进行脱磷分析。肾脏匀浆来自杰克用或不用PP1孵育小鼠肾脏。与PP1孵育的样品中PC2的异常修饰形式消失。（E和F）实时逆转录聚合酶链式反应分析第1页（一） 和第二页（J） ●●●●。以整个小鼠肾脏的总RNA为起始材料。第1页表达增加了9.8倍杰克老鼠(P（P）< 0.001,n个= 4).第二页表达增加了1.7倍杰克老鼠(P（P）< 0.03,n个= 4).
为了确定PC1和PC2蛋白的表达增加是由基因转录增加还是蛋白质降解减少引起的，我们对第1页和第二页基因。第1页mRNA水平杰克即使在GAPDH mRNA水平校正后，小鼠比野生型小鼠大9.8±0.15倍(P（P）< 0.001,n个= 4) ()，表明PC1表达增加是由第1页。这增加了第1页和第二页与之前的数据一致。27另一方面第二页在里面杰克与野生型小鼠相比，小鼠仅增加了1.9±0.5倍(P（P）< 0.03,n个= 4) (). 这些结果与PC1和PC2表达的Western blotting结果一致杰克小鼠肾脏。
Nek8、PC1和PC2的纤毛异常定位杰克小鼠肾脏
观察到PC1蛋白表达和PC2磷酸化水平增加杰克通过免疫组织化学方法，我们进一步研究了它们在小鼠肾脏中的表达和亚细胞定位。与之相反，它在野生型肾脏原发纤毛近端的表达受到限制(，A至C），Nek8表达贯穿初级纤毛的长度杰克老鼠(，D至F）。
PC1和PC2在原发纤毛中的异常表达杰克小鼠肾脏。（A至F）WT中Nek8的纤毛定位（A至C）和杰克（D至F）小鼠肾脏。Nek8（绿色）定位于WT小鼠肾脏初级纤毛的近端区域，并定位于杰克小鼠肾脏。（G至L）WT中PC1的纤毛定位（G至I）和杰克（J至L）小鼠肾脏。PC1（绿色）在WT小鼠肾脏的纤毛中未检测到，但在杰克小鼠肾脏。（M至R）WT中PC2（绿色）的纤毛定位（M至O）和杰克（P至R）小鼠肾脏。PC2在WT小鼠肾脏纤毛中未检测到，但在WT鼠肾脏的纤毛中明确表达杰克小鼠肾脏。（S） PC1在膀胱系上皮细胞质膜中的定位杰克小鼠肾脏。乙酰化-α-微管蛋白用作纤毛标记物（红色）。
虽然无法从3月龄野生型小鼠肾脏的初级纤毛中检测到PC1(，G to I），我们观察到3个月大鼠的睫状体显著表达杰克老鼠(，J至L）。PC1在肾脏质膜中的定位也被检测到杰克老鼠(). 我们和其他人之前已经证明，PC2在多种培养细胞系中定位于初级纤毛17–21还有肾脏。21令我们惊讶的是，在我们的实验条件下，使用管腔扩张良好的snap冷冻或灌注固定肾切片，我们没有在野生型小鼠肾小管上皮纤毛中检测到PC2(尽管Nek8在肾小管纤毛中很容易检测到(). 在杰克然而，小鼠的纤毛中很容易检测到PC2(，P至R）。与最近的报告一致，27纤毛杰克肾脏似乎也比野生型肾脏长(). 多囊蛋白睫状体定位增加杰克在15天大的小鼠中也观察到了小鼠（补充图I-d）。这些数据表明Nek8异常导致PC1和PC2睫状体表达增加。
讨论
尽管Nek家族的几种蛋白质已被证明在调节G2/M细胞周期进展中发挥作用，但Nek8的功能尚不清楚。发现Nek8是在杰克鼠标将Nek8与PKD链接，10这被认为与异常的细胞增殖和分化有关。最近的一项研究发现，RT-PCR测定的Nek8在人类原发性乳腺肿瘤中过度表达，11表明Nek8在细胞生长控制中很重要。
在这项研究中，我们首次提供了Nek8定位于初级纤毛的证据体内尽管最近在培养的细胞系和肾细胞的原代培养物中报道了Nek8的纤毛表达，27,28此前一项关于肾脏中Nek8的研究报告称，收集管中的Nek8表达为胞质而非纤毛。10因此，尚不清楚睫状体或细胞溶质Nek8是否与杰克老鼠。我们发现Nek8的睫状体定位仅在集合小管和集合管中，这表明Nek8在这些部位具有功能。此外，DBA和LTL染色显示杰克小鼠来源于收集小管和收集导管，将纤毛Nek8的表达与这些节段的囊肿形成联系起来杰克老鼠。这一观察非常重要，因为有证据表明，PKD中的许多突变基因类似地定位于纤毛，而纤毛蛋白的缺陷可以导致PKD。12,13,17,18,20–26如前所述，我们可以在胞浆中检测到Nek8信号。10这种抗体也能识别IMCD细胞中的睫状体Nek828（Y.L.和J.Z.，未发表的意见）。
免疫沉淀分析显示，PC2而非PC1与Nek8处于相同的蛋白复合物中。虽然Nek8不能共同免疫沉淀PC1，但PC1能够在野生型肾脏和杰克小鼠肾脏。这些结果表明，PC2与Nek8或PC1形成独特的蛋白质复合物。
我们还观察到PC2在杰克小鼠肾脏。去磷酸化分析表明，这可能是PC2异常磷酸化的结果杰克突变。哺乳动物中调节PC2纤毛运输的机制尚不清楚。一些证据支持PC2磷酸化在其贩运中的作用。在秀丽隐杆线虫，磷酸缺陷突变体第二页（S534A）定位于纤毛，而磷酸化第二页（S534D）突变体在纤毛中基本不存在。29相反，在哺乳动物细胞中，野生型PC2和定位于纤毛的磷酸缺陷突变体S812A都表明，812位丝氨酸的磷酸化并不影响PC2向纤毛的转运。19最近的研究表明，PC2丝氨酸76的另一个磷酸化位点调节了哺乳动物细胞中PC2的细胞表面定位，但不调节纤毛定位。30PC2的磷酸化和睫状体定位增加杰克小鼠认为蛋白质磷酸化可能是控制纤毛靶向蛋白质的机制。然而，我们不能排除多囊蛋白在睫状体定位的可能性杰克小鼠只是由于多囊蛋白含量增加导致的溢出所致。进一步研究，特别是对PC2磷酸化位点的精细表征杰克未来需要鼠标。
据报道，在其他PKD动物模型中，纤毛中积累了多囊蛋白。关于…的研究渗透压-5，小鼠ARPKD基因的同源序列Tg737型，透露出秀丽隐杆线虫ADPKD基因产物在缺乏渗透压-5.31研究奥普克小鼠模型显示PC2的睫状体表达在Tg737型突变型多囊小鼠肾脏。21然而，在这些动物模型中还没有报道多囊蛋白磷酸化增加，这表明PC2的异常磷酸化杰克小鼠可能是由Nek8功能的特定丧失引起的。
PC1和PC2明确定位于膀胱上皮纤毛杰克小鼠肾脏，与最近关于培养肾细胞的报道一致。27令我们惊讶的是，我们无法在野生型肾脏中检测到PC1和PC2的睫状体表达。这可能是由于我们分析的小鼠年龄以及诸如Nek8等蛋白质对PC1和PC2进入纤毛的严格调控所致。众所周知，PC1的表达受发育调控，其在出生后野生型小鼠肾脏中的表达水平显著降低，32虽然在胎儿肾脏中很容易检测到，但在成人肾脏中几乎无法通过免疫荧光检测到。14,32因为我们确实在具有相同抗体的培养细胞中观察到非常清晰的睫状体PC1和PC2表达，17,20我们不能排除野生型肾脏中睫状体PC1和PC2数量低于免疫组织化学检测极限的可能性。
我们发现纤毛Nek8局限于肾脏中纤毛的近段。在杰克小鼠，Nek8在整个初级纤毛长度上均有表达。这一发现与最近的报告不同，在该报告中，作者发现培养的肾细胞的初级纤毛中Nek8的丢失来自杰克鼠标。27这种差异可能是组织和培养细胞之间的细胞类型和细胞分化状态不同的结果。纤毛近端的特征尚未得到很好的研究。然而，有报道称，嗅纤毛近端似乎表达了一小部分环核苷酸门控通道，而睫状体远端则占大多数，33表明纤毛的近端和远端段之间存在不同的特征。Fa2p是一种NIMA相关激酶，对纤毛解体很重要，定位于纤毛近端衣原体.5我们的数据显示，Nek 8调节纤毛长度并限制多囊蛋白进入纤毛。结合Nek8在原发性纤毛近端的特异定位，我们很容易假设近端可能是蛋白质进入纤毛轴的重要部位。我们之前的研究表明，PC1和PC2在纤毛中协同作用，作为感知液体流量的机制，并调节钙内流诱导的信号级联。17在杰克小鼠肾脏、PC1和PC2积聚在肾上皮纤毛中。虽然我们目前不知道纤毛是否在杰克小鼠的纤毛长度超过正常值，以及囊性肾中纤毛感觉机制的异常水平和磷酸化的鉴定表明，纤毛缺陷是囊性肾管腔大小失控和肾脏发育异常的原因杰克老鼠。
简明方法
老鼠
三个月大的野生型或杰克采用C57背景的小鼠进行PC1和PC2的免疫染色、Western blot分析和实时RT-PCR。使用15日龄小鼠进行免疫染色。
抗体
针对小鼠Nek8的C末端RCC结构域（285-698个氨基酸）融合蛋白（免疫荧光1:200倍稀释，Western blotting 1:1000倍稀释）制备亲和纯化多克隆抗体。10亲和纯化多克隆抗体MR3对抗2938到2956个PC1氨基酸（1:200稀释）14用于免疫组化。对于PC1的Western blotting，PC1 N末端区域的单克隆抗体7e12（1:600稀释）34使用PC1 C末端区域的多克隆PC1抗体（1:200稀释）（sc-25570，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）。针对小鼠PC2的44到62个氨基酸（免疫荧光1:200稀释度，免疫印迹1:1000），提高亲和纯化多克隆抗体96525。17,20抗α-乙酰化微管蛋白抗体的商业抗体（西格玛-阿尔德里奇，密苏里州圣路易斯）用作免疫荧光标记物（1:5000稀释）。荧光DBA和LTL购自Vector Laboratories（加利福尼亚州伯林盖姆），用作免疫荧光标记物（1:500稀释）。
组织切片的免疫荧光
根据制造商的协议，将福尔马林固定的组织切片脱蜡并重新水化，并使用抗原揭开溶液（Vector Laboratories）进行抗原提取，但我们将规定的高压下1分钟煮沸替换为无高压下30分钟煮沸。抗原回收后，将切片与10%山羊血清在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中预孵育，并与10%山羊血清在PBS中的特异性一抗在37°C下孵育2小时。清洗后，将二级抗体培养1 h。使用带有DAPI（Vector Laboratories）的Vectorshield贴装培养基进行DAPI染色，并保护免疫荧光信号不褪色。记录时，使用尼康TE2000-U显微镜（尼康公司，纽约州梅尔维尔）和滨松ORCA-ER相机（滨松，静冈，日本）拍摄图像。
共免疫沉淀和Western印迹
新鲜小鼠肾脏在含有蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，Indianapolis，in）的T-PER组织蛋白提取试剂（Pierce，Rockford，IL）中匀浆。IMCD细胞在含有蛋白酶抑制剂的M-PER组织蛋白提取试剂（Pierce）鸡尾酒中均质化（Roche Diagnostics）。以10000×克在4°C下放置15分钟，收集上清液。如前所述进行共免疫沉淀和Western blotting。20
对于免疫印迹，我们使用了PC1的7e12抗体（1:600稀释）、PC1的C末端抗体（1:200稀释）和PC2的96525抗体（1:1000稀释）。接下来，清洗过滤器并在二级抗体（抗鼠或抗兔IgG辣根过氧化物酶偶联物；英国白金汉郡Amersham Bioscience）中培养1小时。蛋白质通过ECL系统（Hyperfilm，Amersham Bioscience）可视化。按照制造商的建议（马萨诸塞州贝弗利新英格兰生物实验室），使用蛋白磷酸酶1对肾脏蛋白质进行去磷酸化。肾匀浆来自杰克在变性之前，将小鼠肾脏在30°C的温度下与蛋白磷酸酶1孵育2小时。为了定量分析Western印迹带，我们使用ImageJ软件。
实时RT-PCR
小鼠实时RT-PCR引物第1页,第二页，和GAPDH的制备如下：
鼠标第1页：5′TAT CTG CAG TAC CGA CTG TGT TAC C 3′
鼠标第1页：5′TTG AAC TGG CGG AGT ACC TG 3′
鼠标第二页：5′TGT GTG GTC AGG TTA TTG GCG 3′
鼠标第二页：5′GCC AGG AAG AAA TCA AAG GC 3′
该引物集设计用于扩增3368到3500的cDNA第1页({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“U70209”，“term_id”：“2138182”，”term_text“：“U700209”}}U70209型)和第1303至1415页第二页（NM008861）。用M-MLV逆转录酶（Invitrogen，Carlsbad，CA）和随机六聚体（QIAGEN，Valencia，CA）逆转录从3月龄小鼠的全肾中分离的总RNA。使用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒（QIAGEN）在LightCycler（Roche Dignostics）中进行实时PCR。用GAPDH mRNA表达水平校正定量数据。
PC2的短发夹RNA
基于pLKO.1的慢病毒载体，包含编码小鼠编码序列（TRCN88790）shRNAs的干环盒第二页通过Sigma-Aldrich从MISSION TRC shRNA库中获得。shRNAs的寡核苷酸序列如下（与目标转录物匹配的21-nt干序列下划线；非互补的6-nt环序列斜体化）：MISSION shRNA TRCN88790，5′-CCGGCGTGATTGCAAGCTGGAGAT公司CTCGAG公司ATCTCCAGCTGACATCAG公司TTTTT-3′。我们使用MISSION pLKO.1-uro对照载体（Sigma-Aldrich）作为对照。将293T细胞与pLKO.1构建物、包装质粒pCMVΔR8.91和表达VSV-G的包膜质粒pMD共转染产生VSV-G慢病毒颗粒。G.公司。35所有实验程序均按照RNAi联盟的指示进行。使用FuGENE 6（Roche Diagnostics）进行转染，转染后48和72小时收集病毒。使用慢病毒上清液在8μg/ml聚布伦存在下转导细胞，并用2μg/ml嘌呤霉素（Sigma-Aldrich）选择感染的细胞。
致谢
作者感谢Q.Xi和P.Finnerty提供的技术援助，P.Starremans提供的实时RT-PCR引物集，C.Ward博士提供的7e12抗体，S.Nauli博士提供的技术帮助，I.A.Drummond博士提供了有益的讨论并提供了本研究中使用的一些肾切片，以及F.S。David请求协助慢病毒shRNA筛选和生产。这项工作得到了美国国立卫生研究院（DK53357、DK40703和DK51050）对J.Z的资助，以及肾脏疾病分子和细胞病理学研究小组和JSPS海外研究博士后奖学金对E.S.和PKD基金会对Y.L.的资助。
参考文献
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