生物化学杂志。作者手稿；可在PMC 2008年5月12日获得。
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尼姆斯：NIHMS46528
肝星状细胞在三维细胞外基质跨分化中的基质金属蛋白酶-9激活级联*
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韩元平
‡加利福尼亚州洛杉矶南加州大学凯克医学院外科90033-4680
§加利福尼亚州洛杉矶南加州大学凯克医学院病理学系90033-4680
甄春丽
‡加利福尼亚州洛杉矶南加州大学凯克医学院外科90033-4680
凌州
‡加利福尼亚州洛杉矶南加州大学凯克医学院外科90033-4680
蓝琴
‡加利福尼亚州洛杉矶南加州大学凯克医学院外科90033-4680
冢本秀一（Hidekazu Tsukamoto）
§加利福尼亚州洛杉矶南加州大学凯克医学院病理学系90033-4680
‡加利福尼亚州洛杉矶南加州大学凯克医学院外科90033-4680
§加利福尼亚州洛杉矶南加州大学凯克医学院病理学系90033-4680
1信件收件人：部门。南加州大学凯克医学院外科和病理学专业，2011 Zonal Ave.，HMR 813，Los Angeles，CA 90033。电话：323-442-3856；传真：323-442-6481；电子邮件：ude.csu.yregrus@nahy 摘要
肝星状细胞（HSC）在肝纤维化发生中经历肌纤维母细胞转分化。我们之前的研究表明，三维I型胶原和白细胞介素-1（IL-1）的双重刺激以依赖基质金属蛋白酶-9（MMP-9）激活的方式协同诱导HSC转分化。本研究旨在确定MMP-9在该模型中的激活机制。转分化HSC表达的前MMP-9转化活性被描述为对MMP抑制剂敏感的分泌因子，其表观分子量为50和25kDa。这与小鼠和人类皮肤中的前MMP-9激活物形成鲜明对比，后者是一种糜蛋白酶样蛋白酶。在双重刺激诱导HSC产生的多种MMPs中，MMP-13表达上调最为显著，符合作为MMP-9前激活物的所有标准。在三维I型胶原中培养的HSC，而在Matrigel中没有，IL-1分别在50和25 kDa时诱导MMP-13及其成熟形式的表达。体外重组实验证明，MMP-13（而非其酶原）激活原-MMP-9。此外，以MMP-13为靶点的短发夹RNA可消除前MMP-9活化和HSC转分化。我们进一步证明，膜相关因子促进了前MMP-13的活化，金属蛋白酶组织抑制剂-2抑制了前MMP-13的活化，而针对MMP-14的短发夹RNA则消除了其活化。此外，前MMP-13也被一种分泌因子激活，该分泌因子被明胶-Sepharose吸收并与MMP-9重组。因此，MMP激活级联（MMP-14>MMP-13>MMP-9）和MMP-9>MMP-13的正反馈回路促进了IL-1诱导的三维细胞外基质中HSC的转分化，表明它们在肝脏损伤和修复中的关键作用。
肝星状细胞（HSC）位于窦内皮和肝细胞之间的窦周间隙2是储存维生素A和产生ECM的细胞吗(1,2). 在正常肝脏中，HSC被包裹在由基底膜成分组成的松散ECM中，这些基底膜成分主要由这些细胞自身产生(1,2). 为了应对肝损伤，HSC对肌纤维母细胞进行转分化（激活），这可能会产生过度的间质ECM(三–7). 伴随着转分化，由转分化的肌纤维母细胞产生的富含胶原蛋白的纤维纤维逐渐取代了Diss间隙中的基底膜样ECM环境。尽管人们越来越需要开发新的肝硬化治疗方法，并对HSC进行了数十年的研究，但关键问题仍然是HSC如何在正常肝脏中保持静止，以及如何破坏体内平衡以在窦周ECM环境中激活HSC。分离的HSC在塑料上培养时会自发激活(8,9). 因此，可以想象基底细胞ECM在正常肝脏中获得并维持HSC处于静止状态；相反，ECM降解对于激发HSC激活的开始至关重要(10). MMP与肝纤维化相关性的最初观察是在近三十年前报道的(11). MMPs与肝纤维化的时间相关性得到了更详细的定义，并与非实质性肝细胞启动纤维化有关(12–14). 最近，MMP-13缺乏被证明可以减弱肝纤维化的发生(15).
鉴于Diss空间中独特的富含ECM的结构，我们设计了我们的研究，通过在三维ECM支架中培养孤立的HSC来重现这种环境。通过在三维基底膜ECM（Matrigel）中培养分离的HSC，复制正常肝脏中HSC的静息状态，并用I型胶原替代Matrigel，模拟窦周纤维化的发生。肝纤维化的发展与持续炎症密切相关(16–18). 我们推测急性期细胞因子可能直接启动HSC的激活。为此，我们测试了急性期细胞因子在三维培养模型中的作用。这项工作使我们发现，IL-1和I型胶原的双重刺激导致了最显著的ECM降解和HSC转分化(19). 这一发现是新颖和显著的，因为HSC已被证明是ECM降解和随后HSC转分化所需的多种MMP的主要来源。
许多分泌的基质金属蛋白酶在健康的静息组织中几乎不存在，尽管它们在“活性”组织中表达，在这些组织中，细胞外基质降解是必不可少的，例如在发育、肿瘤转移、组织损伤和修复过程中(20). 通过N末端原结构域中的保守半胱氨酸和催化结构域中保守组氨酸螯合的锌离子之间的相互作用，新生MMP被休眠。激活通常由前体蛋白的裂解介导，导致锌-半胱氨酸相互作用的重组，这一过程称为“半胱氨酸转换”(21). 基于在体外用纯化蛋白重组MMP-3被认为是一种潜在的前MMP-9激活剂(22). 类似的方法表明，纤溶酶是前MMP-3的上游激活物，而TIMP-1的下调是必需的(23,24). 另一方面，转化的肥大细胞通过使用糜蛋白酶激活MMP-9原(25,26). 糜蛋白酶亚型缺陷小鼠证实了糜蛋白酶在激活前MMP-9中的作用(27,28). 在人体皮肤中，用肿瘤坏死因子刺激-α或IL-1通过一种与皮肤组织紧密结合的未被识别的糜蛋白酶样蛋白酶激活原-MMP-9(29,30). 然而，MMP-9原在其他器官中是如何被激活的，目前尚不清楚。我们已经证明，HSC在其转分化过程中激活前MMP-9，以响应IL-1和三维I型胶原双重刺激的非常选择性条件。一旦转化为肌成纤维细胞，HSC大多停止产生MMPs，从而将纤维化的平衡转变为ECM的积累(19).
在本报告中，我们描述了在IL-1和I型胶原双重刺激下，HSC激活前MMP-9的级联反应。我们从分析潜在候选基因与前MMP-9激活的时间相关性开始。我们的特征是，前MMP-9转化激活剂是分子量为50和25kDa的可溶性因子。转化酶对基质金属蛋白酶抑制剂敏感，但对丝氨酸蛋白酶不敏感。这些结果促使我们研究HSC在三维培养中表达的MMPs。该分析指出MMP-13作为HSC产生的前MMP-9激活剂符合所有标准。我们证明了这一点在体外重组和RNA推断介导的敲除实验。我们还鉴定了MMP-14和MMP-9是两种独立的原-MMP-13激活剂。为了支持这些MMPs在HSC转分化中的作用，我们证明来自MMP-9敲除小鼠或MMP-13敲除小鼠的HSC未能被双重刺激激活。因此，本研究阐明了IL-1诱导ECM内HSC转分化过程中复杂的MMP激活级联反应，作为组织损伤和修复中MMP相互作用的一个例子。
实验程序
材料
MMP抑制剂（目录号444247）、IV型胶原酶检测试剂盒、前体和MMP-13购自Calbiochem。大鼠MMP-13（MAB13426）、MMP-14（MAB3317）和TIMP-2蛋白（CC1064）的抗体来自Chemicon（加州特梅库拉）。异硫氰酸荧光素结合单克隆抗体α-SMA来自Sigma-Aldrich。腺病毒shRNA敲除试剂盒，包括pENTR/U6质粒，购自Invitrogen。I型胶原蛋白来自Cohesion Technologies（加州帕洛阿尔托），IL-1α来自研发系统公司（明尼苏达州明尼阿波利斯）。原-MMP-9由用慢病毒转导的角质形成细胞表达，以表达人MMP-9。如前所述，用凝胶结合的Sepharose 4B纯化条件培养基中的蛋白酶(31).
Pro-MMP-9转化激活剂分子量的测定
条件培养基由培养在三维I型胶原中的原代大鼠HSC制备，并用IL-1处理α（1ng/ml），持续5天。通过凝胶结合Sepharose-4B柱去除内源性明胶酶后，用85%饱和度的硫酸铵沉淀浓缩条件培养基。将蛋白质溶解在NT缓冲液（100 mM NaCl和50 mM Tris，pH 7.5）中，在加载到Superdex-200（GE Health Sciences）之前过滤，并通过快速蛋白质液相色谱进行解析。通过吸光度监测馏分A类280，并用标准蛋白质校准其分子量。通过培养30-μl分数，15μ1份纯化人MP-9前体和5份μl 50 mM CaCl2在37°C下放置16 h。然后通过酶谱图对反应进行解析。通过82-kDa MMP-9的比值测量pro-MMP-9的转化与92-kDa酶原。通过在非还原性SDS-PAGE中溶解条件培养基，也可以测量分子量。简单地说，在冷藏室中用SDS-PAGE（12.5%w/v）分解明胶酶耗尽和浓缩的条件培养基。然后根据分子量将凝胶切成20片。凝胶切片在NT缓冲液中与1%Triton X-100孵育，以去除残留SDS。凝胶片研磨后35μl NT缓冲液，通过添加15μpro-MMP-9和5的lμl氯化钙2然后在37°C下培养16小时。最后，通过酶谱法对反应进行解析。
小鼠HSC的分离及三维ECM培养
以前已经描述过大鼠HSC的分离和培养(32). MMP-9缺陷和野生型FVB小鼠购自Jackson实验室（ME Bar Harbor）。小鼠HSC的分离与大鼠HSC的分离程序相似，不同之处在于：从上腔静脉而不是门静脉进行肝脏灌注，降低Pronase和胶原酶的浓度，并调整低速和超速离心的速度。简单地说，在37°C的循环水浴中，用50 ml 0.4%蛋白酶灌注小鼠肝脏12分钟，然后用0.02%胶原酶灌注8分钟。然后将塌陷的肝组织切碎，悬浮在40毫升的10μg/ml DNA酶，并在37°C下摇晃10分钟。500×离心去除实质细胞后克在1分钟内，以1500×克对细胞悬液进行梯度离心8分钟。在1.034至1.043 g/cm之间从第二顶层收集星状细胞三清洗后，将星状细胞接种在含有10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、抗生素青霉素和链霉素的高糖Dulbecco改良Eagle's培养基中。通过对比相差显微镜下细胞数量和紫外光激发的自荧光来判断HSC的纯度。在2天恢复后，将细胞包埋在三维ECM中，如前所述(19).
细胞处理和定量RT-PCR
如前所述，将分离的大鼠HSC（第2天）置于培养皿上或嵌入三维I型胶原中。用或不用IL-1处理细胞α（1ng/ml）在含有5%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养16小时。根据制造商的说明（Invitrogen），使用TRIzol试剂提取总RNA。第一链cDNA是使用SuperScript II逆转录酶和随机引物通过第一链cDNA合成生成的。每个逆转录反应混合物（20μl） ●●●●。使用ABI Prism 7900HT（应用生物系统）进行实时PCR。10-μl反应在384孔PCR板中使用以下最终浓度进行：1μmol正向和反向引物，1×SYBR Green主混合（qPCR Mastermix Plus用于SYBR GreenI，Eurogentec）和5 ng cDNA。对于每种情况，使用三份样品来最小化变化。循环条件如下：初始步骤（50℃2 min）、热活化（95℃10 min）、重复40次扩增（95℃15 s和60℃1 min），并用单一荧光测量进行定量。使用ABI Prism SDS 2.1软件分析数据。相对基因表达通过ΔΔ计算C类t吨方法。简言之，合成的mRNA被标准化为其自身的GAPDH。最终结果表示为n个-基因表达相对于GAPDH mRNA和校准物的倍数差异如下：n个-折叠=2–(ΔC类t吨样品–ΔC类t吨GAPDH），式中ΔC类t吨通过减去平均值来确定样品和校准品的值C类t吨调查记录的平均值C类t吨每个样本的GAPDH基因值。对于大鼠MMP-9，正向引物的序列为CAG ACC AAG GGT ACA GCC TGT，反向引物为AGC GCA TGG CCG AAC TC。对于大鼠GAPDH，正向和反向引物分别为CCT GGA GAA ACC TGC CAA GTA T和CTC GGC CGC CTG CTT。其他MMP和TIMP引物的序列信息将根据要求发布。
免疫荧光染色
用冷甲醇固定20分钟后，将三维ECM中的细胞用0.15%Triton X-100在磷酸盐缓冲盐水中透化15分钟。用5%脱脂乳在磷酸盐缓冲盐水中封闭，将细胞与荧光素异硫氰酸偶联的单克隆抗体一起孵育α-SMA（1:100，西格玛）。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯丙氨酸（1μg/ml）持续5分钟。图像由尼康Eclipse TE2000-U、Roper Scientific Photometrics公司的数码相机和Metamorph软件拍摄。
MMP-13和MMP-14的分解
大鼠MMP-13和-14的shRNA是根据BLOCK-iT RNAi设计器（Invitrogen）设计的。靶向大鼠MMP-13 N末端区域的shRNA插入物具有以下序列（结构AB）：正向、5′-CACGCAGACTACTTGAA-ATCACGAATGATTCAAGTAGTGCTCTGCTGC-3′和反向、5′-AAAAAGCAGCACTTGAACATTCG-ATTTCAAGTGCTGC-3'。另一组抗大鼠MMP-13催化区的shRNA（construct CD）序列如下：正向，5′-CACGCGCAGAA-CTTCCAACCATGTCGAAACATGGTGTGGAAGTTC-TGGC-3′和反向，5′-AAAGCCAGAAACTTCCCAA-CATGTGGC-3′。对于针对大鼠MMP-14的shRNA，构建体AB具有以下序列：正向，CACCGTCTAGGAATCATATTCCGT-TCCTTTCGAAAGGAACGGAATGTGATTCCTAGA；向后，AAAATCTAGGAATCATTCCGTTCCTTTT-CGAAGGAGAATGTGATTCCTAC。MMP-14 shRNA的构建CD具有以下序列：正向，CAC-CGTCATGATCTTGTTTGCTGAGGGTTTCGAAAAACCC-TCAGCAAACAAGATCAGA；向后，AAAATCATGAT-CTTGTTGCTGAGGTTTTCGAAACCTCCAGAA-CAAGATGAC。根据制造商的说明，还使用插入序列构建了表达lacZ shRNA的控制载体。质粒（U6启动子）和腺病毒敲除程序均已应用。对于质粒介导的敲除，将大鼠HSC置于6厘米的培养皿中，并使用LipofectAMINE（Invitrogen）用pENTR/U6 shRNA转染3-4小时。对于基于病毒的传递，培养皿上的HSC被腺病毒感染，感染倍数为100。将转染或转导的细胞接种在三维I型胶原中，并在5%胎牛血清中用或不用IL-1（1 ng/ml）刺激3天。分别通过Western blot和实时定量PCR证实MMP-13和MMP-14的敲除。
粗膜组分的制备及Pro-MMP-13转化酶的测定
将HSC接种在经IL-1或不经IL-1处理的三维I型胶原中24小时。用NT缓冲液洗涤后，收集凝胶晶格，并在14000×克.将颗粒悬浮在NT缓冲液中，并用Dounce均质机均质。用NT缓冲液反复洗涤后，以14000×克.将膜组分和pro-MMP-13或条件培养基与TIMP-2混合或不与TIMP-2.混合，并在37°C下培养规定时间。用Western blot测定pro-MMP-13的转化率。
结果
Pro-MMP-9在HSC转分化中的表达和激活
首先，我们评估了IL-1诱导的HSC转分化与三维ECM培养中的前MMP-9表达/激活之间的时间相关性。从大鼠肝脏中分离出HSC，并通过塑料培养回收2天。在这一点上，根据自体荧光和典型的星形形态所测得的大量维生素A滴判断，HSC仍呈静止状态。然后将细胞包埋在三维I型胶原中，并在含有或不含IL-1的5%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基中培养α在指定的时间间隔内，对细胞进行免疫染色α-SMA和条件培养基通过凝胶溶解酶谱进行解析。如所示如丝状肌动蛋白纤维所示，在IL-1刺激下，HSC在形态上转化为肌纤维母细胞。通过紫外线下的自荧光测定，维生素A滴在治疗过程中被耗尽（数据未显示）。Pro-MMP-9（啮齿动物为105 kDa）在第2天出现，未激活。在第3天，前MMP-9（95kDa）开始激活，并且在第4天和第5天变得更加明显(). MMP-9表达/激活的时间模式与HSC转分化的启动和进展相一致()胶原晶格的降解，这表明MMP介导的ECM重塑和细胞激活之间可能存在因果关系().
IL-1诱导MMP-9表达/激活与三维I型胶原HSC转分化的时间相关性A类，将分离的大鼠HSC包埋在三维I型胶原中，并用IL-1处理α（0.5纳克/毫升）。细胞固定在指定的时间点，用于免疫荧光染色α-SMA和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。B类条件培养基中的MMP-9通过酶谱图进行解析。C类通过I型胶原晶格的塌陷监测ECM的整体降解。
遗传和药理学证据显示MMP-9在三维ECM中HSC转分化中的重要作用
先前我们研究表明，外源性TIMP-1或明胶酶缺失可减弱IL-1诱导的三维I型胶原中HSC的转分化。鉴于在这一细胞激活过程中MMP-9原的诱导和激活密切相关，我们的结果表明MMP-9在三维ECM中HSC转分化中的关键作用(19). 然而，TIMP-1也抑制其他MMPs，明胶亲和力降低可能会清除其他明胶酶，如MMP-2。为了直接测试MMP-9在三维ECM中激活HSC中的作用，我们从MMP-9缺失和基因匹配的野生型小鼠中分离出HSC。分离的小鼠HSC纯度很高（>96%），因为通过相控显微镜鉴定的几乎所有细胞都具有特征性的瞬时紫外线激发的自体荧光发射，作为细胞内维生素A储存的证据(，下部面板）。将HSC镀在塑料上或嵌入I型胶原中，然后用或不用IL-1治疗4天。在塑料上培养，来自野生型和MMP-9敲除小鼠的HSC表现出相似的激活程度，表明MMP-9在这种“无ECM”和人工环境下对细胞激活的独立性(). 事实上，塑料培养的HSC未诱导MMP-9（数据未显示）。相反，在三维I型胶原中培养的野生型但不是MMP-9缺陷的细胞在IL-1处理的反应中经历活化，如通过表达α-SMA应力纤维。
遗传和药理学证据表明MMP-9在IL-1诱导三维胶原中HSC转分化中的重要作用A类、从野生型和MMP-9基因敲除中分离出的HSC(击倒对手)小鼠在相差显微镜下和紫外线下检查自身荧光（维生素A滴）。B类，将细胞包埋在I型胶原中或在塑料上培养。加入或不加入IL-1培养5天后α，细胞被染色α-座椅模块组件。C类，将大鼠HSC嵌入三维I型胶原中，并用IL-1刺激α在MMP抑制剂存在或不存在的情况下。培养5天后，对细胞进行染色α-座椅模块组件。D类肽裂解法测定Ⅳ型胶原酶活性。电子MMP抑制剂可消除重组间质胶原凝胶的整体分解。
然后，我们测试了羟肟酸型MMP抑制剂对前MMP-9转化和转分化的影响。分离的大鼠HSC在三维I型胶原中培养，用IL-1和MMP抑制剂一起处理。如所示MMP抑制剂可消除IL-1诱导的三维I型胶原中的HSC活化，如应力纤维减少所示，并在细胞周围出现皱褶肌动蛋白环，这是三维胶原中HSC的典型表现。相反，该化合物对塑料上生长的HSC的活化没有影响，表明抑制剂缺乏细胞毒性（数据未显示）。由荧光底物测定的条件培养基中的IV型胶原酶活性被抑制剂显著消除，支持其功效(). 抑制剂明显阻止了前MMP-9的转化以及胶原蛋白凝胶的整体降解，表明间质胶原酶也可能参与I型胶原蛋白的降解和细胞活化(). 因此，这些结果表明，前MMP-9的激活可能由另一种MMP介导，而活性MMP-9在IL-1和三维I型胶原诱导的细胞激活中起着明确的作用。
Pro-MMP-9转化激活剂的分子量分别为50和25 kDa
首先，我们试图确定转化酶是否分泌。为此，从I型胶原蛋白中的HSC三维培养获得条件培养基，并暴露于IL-1中，通过明胶偶联Sepharose-4B柱来消耗内源性MMP-9。然后，将条件培养基与纯化的人MP-9前体在37°C下培养16小时，以评估MP-9原的转化。如所示，转化活性在条件培养基中明显，表明HSC释放的假定原-MMP-9激活剂为可溶性形式。然后，我们估计了转化酶的分子量。用硫酸铵沉淀浓缩条件培养基，并通过凝胶过滤（Superdex-200）进行溶解。蛋白质谱由A类280吸光度和前-MMP-9转化活性通过将组分与纯化的人前-MMP9孵育，然后进行酶谱分析来测定。用标准蛋白质校准组分的分子量。转化活性以50 kDa主峰和25 kDa副峰的分数洗脱(). 由于50-kDa分子可能代表25-kDa-转化酶的二聚体，我们通过非变性SDS-PAGE解析了转化活性，并对切片进行了前MMP-9转化活性分析。转化活性不仅保留在SDS-PAGE中，而且在约50kDa处有一个主峰，在约25kDa时有一个小峰，分子量也相似(). 这些结果表明，HSC分泌的50-kDa转化酶是单体状态，以响应IL-1和I型胶原。
HSC分泌的前MMP-9转换活性分子量分别为50和25kDaA类去除内源性明胶酶后，在胶原中培养的HSC条件培养基中加入IL-1α用或不用纯化的人MP-9原孵育5天。16小时后，反应通过酶谱法分解。B类用Superdex-200对条件培养基进行拆分，然后用纯化的pro-MMP-9孵育，然后进行酶学分析。C类，通过非还原性SDS-PAGE将条件培养基溶解，然后根据分子量将凝胶切片为20片。将切片与pro-MMP-9孵育后，通过酶谱分析确定转化活性。50kDa和25kDa时的转换活动表示为箭头.
HSC和人类皮肤中的Pro-MMP-9转换酶有很大不同
我们之前的报告和之前的实验表明，TIMP-1和MMP抑制剂抑制了MMP-9原的激活，证明了MMP在MMP-9前激活中的潜在作用。然后我们在无细胞系统中讨论了这个概念。条件培养基中的内源性明胶酶被耗尽，所得培养基与纯化的人MMP-9原以及MMP抑制剂或糜蛋白酶样蛋白酶抑制剂糜蛋白酶抑制素一起培养。结果表明，pro-MMP-9在条件培养基中被可溶性因子转化。此外，MMP抑制剂在100 nM时抑制了前MMP-9转化活性，而转化对凝乳抑素完全耐药()，再次证明激活物很可能是基质金属蛋白酶。相反，来自人类皮肤提取物的转化活性对MMP抑制剂不敏感，但被凝乳抑素完全消除(). 同样，小鼠皮肤提取物也显示出激活前MMP-9的能力，以及凝乳抑素而非MMP抑制剂的抑制作用。三因此，这些结果表明HSC和皮肤对前MMP-9激活具有组织特异性差异机制。
HSC和皮肤使用不同的机制激活MMP-9前体A类在内源性明胶酶耗尽后，将胶原蛋白中HSC与IL-1的条件培养基与人MMP-9原在有或无蛋白酶抑制剂的情况下孵育，如图所示。孵育16小时后，反应通过酶谱图进行解析。B类，用1%Triton X-100、6 M尿素和2 M氯化钠依次提取正常人皮肤。透析后，将最终提取物与前MMP-9和蛋白酶抑制剂孵育。16小时后，反应通过酶谱法分解。
HSC在IL-1和I型胶原双重刺激下产生多种MMPs
然后，我们分析了在IL-1的双重刺激下HSC对MMP家族的表达α和I型胶原蛋白使用Affymetrix DNA微阵列分析。凝胶中细胞上调的800个基因中，IL-1对其有反应α，我们注意到五种基质金属蛋白酶：MMP-3、MMP-9、MMP-10、MMP-12和MMP-13(). 其中，MMP-13的诱导作用最高，增加了1300倍，其次是MMP-9，上调了110倍。膜型MMP-14的信使组成性高表达，对IL-1的反应没有显著增加。由于转化酶是分泌因子，膜型MT-MMP不太可能是前MMP-9的直接激活剂。基质金属蛋白酶-23下调，而其他基质金属蛋白酶则不存在于星状细胞中。然后，我们通过实时定量RT-PCR分析确认了DNA微阵列数据。如所示当细胞在塑料上培养时，这些MMP不是由IL-1诱导的，而是在含有细胞因子的三维I型胶原中爆炸性上调。MMP-13上调了800倍，证实了微阵列结果。
HSC表达的MMPs和TIMPs对IL-1和I型胶原的反应A类，将分离的大鼠HSC嵌入三维I型胶原中，然后用IL-1治疗α提取RNA并转化为cDNA。通过Affymetrix DNA微阵列筛选MMPs和TIMPs的表达。白介素-1α-MMPs的诱导表达表现为基底水平的折叠变化。“A类“代表缺席。B类HSC在塑料或三维I型胶原上培养16 h，加入或不加入IL-1。通过定量RT-PCR测定MMPs的mRNA水平。
MMP-13与Pro-MMP-9转化活性的紧密联系
上述对MMP-13 mRNA的显著诱导非常有趣，因为该MMP的分子量（如预测的，pro-MMP-13为52 kDa，MMP-13为48 kDa）接近凝胶过滤和SDS-PAGE所示的转化活性大小。为此，我们对条件培养基进行了免疫印迹分析，并证明在第2天出现活性MMP-13（48 kDa）和截短型（25 kDa()，在pro-MMP-9转换之前(). 25-kDa MMP-13可能是催化结构域，因为它被单克隆抗体识别为铰链区域，其活性如下一节所示。然后我们询问三维基质细胞缺乏MMP-9原激活是否是由于MMP-13表达或激活缺失所致。如所示在三维基质培养中未检测到MMP-13的表达，再次证明了MMP-13在前MMP-9激活中的潜在致病作用。
基质金属蛋白酶-13的缺失导致基质金属蛋白酶-9前体缺乏激活A类将分离的大鼠HSC接种在塑料上或嵌入I型胶原或基质中，然后用IL-1刺激α.按规定的间隔对经调节的培养基进行取样。用识别MMP-13铰链区的单克隆抗体通过Western blot检测MMP-13的表达/激活。B类在规定条件下培养5天的HSC条件培养基通过酶谱图进行解析。
活性MMP-13直接激活Pro-MMP-9
然后我们测试了MMP-13是否可以直接转换pro-MMP-9在体外纯化的前MMP-13和活性MMP-13（催化域）与纯化的人前MMP-9在5 mM CaCl存在下孵育2在pH值为7.5的含有100 mM NaCl和50 mM Tris的缓冲液中。培养16小时后，反应通过酶谱图进行解析。如所示活性MMP-13，但其酶原（pro-MMP-13）不能将pro-MMP-9转化为活性形式。我们还检测了MMP抑制剂I和凝乳抑素的抑制作用。正如预期的那样，MMP抑制剂I有效地阻断了MMP-13介导的促MMP-9活化，而糜蛋白酶抑制素则没有作用(). 相反，凝乳抑素（而非基质金属蛋白酶抑制剂I）很容易消除组织蛋白酶G介导的原-MMP-9激活（数据未显示）。
有活性的MMP-13，但不是其酶原，激活前-MMP-9A类将纯化的活性MMP-13和pro-MMP-13按指示剂量与纯化的pro-MMP-9孵育16 h，然后进行酶谱分析。B类在有或无MMP抑制剂或凝乳抑素的情况下，将活性MMP-13与前MMP-9孵育16小时，然后进行酶谱分析。
HSC中MMP-13的敲除消除Pro-MMP-9的激活
为了证明MMP-13是HSC-衍生的MMP-9原激活物，我们测试了RNA干扰对MMP-13的敲除是否可以阻止培养在三维I型胶原中的HSC对IL-1诱导的前MMP-9激活。shRNA产生了两个靶向MMP-13的小干扰RNA。shRNA的表达是在质粒或腺病毒的背景下由U6启动子驱动的。针对LacZ的shRNA被用作对照。通过质粒转染分离的大鼠HSC，在三维I型胶原中培养，并用IL-1处理α培养4天后，通过酶谱分析条件培养基中的前MMP-9激活情况，并通过Western blot分析MMP-13表达情况。如所示，两种shRNA（AB代表前肽结构域，CD代表催化结构域）有效抑制了MMP-13的表达，并协同阻止了前-MMP-9的转化，而不影响酶原本身的表达。shRNAs对原-MMP-2的组成表达和激活没有影响，也证明了敲除的特异性。为了确定MMP13敲除是否抑制HSC转分化，我们用腺病毒载体表达MMP-13或lacZ的shRNA。用腺病毒转导原代HSC，然后在三维I型胶原中培养并用IL-1处理。正如预期的那样，病毒介导的shRNA的表达彻底敲低了MMP-13，并完全消除了原-MMP-9的成熟，而酶原的表达没有受到影响(). 作为MMP-13主要底物的三维I型胶原的整体降解也被抗MMP-13的shRNA所消除，作为MMP-13-敲除的功能后果的证据(插入属于). 同时，由丝状菌评估HSC激活α-MMP-13敲除明显减弱SMA。这些结果明确地证明了基质金属蛋白酶和细胞外基质降解级联在细胞外基质环境中HSC转分化中的关键重要性。
MMP-13的敲除消除HSC-介导的前MMP-9激活A类用质粒（pENTR/U6）转染分离的大鼠HSC，该质粒可传递shRNA对抗MMP-13和lacZ。转染4小时后，将细胞包埋在I型胶原中，并用IL-1刺激α通过酶谱分析前MMP-9的表达和激活。B类Western blot检测MMP-13的下调。C类和D类在三维培养的细胞中，用编码MMP-13 shRNA的腺病毒转导细胞可消除前MMP-9的激活，而对酶原的表达无任何影响。电子、编码MMP-13和lacZ shRNA的腺病毒转导的细胞表型。shRNA对MMP-13胶原蛋白分解的抑制作用由插入.
MMP-14介导的Pro-MMP-13激活
刀豆球蛋白A刺激的成纤维细胞表达MT1-MMP并激活前MMP-13(33). 因此，我们在我们的三维ECM培养模型中检测了MT1-MMP在前MMP-13激活中的潜在作用。DNA微阵列和定量RT-PCR的结果显示MMP-14 mRNA的组成性表达和IL-1调节的缺失(). 然而，Western blot分析清楚地证明了MMP-14蛋白对IL-1的诱导反应，表明可能存在转录后调节(). 此后，我们测试了TIMP-2（MMP-14的一种优先组织抑制剂）是否能够抑制前MMP-13的激活。外源TIMP-2被添加到三维培养物中，它确实以剂量依赖的方式抑制了前MMP-13的成熟(). TIMP-2也抑制了前MMP-9的激活，这一点完全一致，再次证明了MMP-13和MMP-9之间的因果关系。为了确定pro-MMP-13是否可以被膜结合蛋白酶直接处理，将pro-MMP13与来自三维培养物的膜组分进行培养，该培养物由IL-1刺激或不刺激。Western blotting显示，在三维培养中，前MMP-13仅被IL-1刺激的HSC的膜部分激活，而非非刺激的HSCs，这与MMP-14蛋白水平的变化一致(). 此外，TIMP-2抑制了膜分裂介导的pro-MMP-13活化(). 最后，我们通过腺病毒表达shRNA，靶向蛋白酶的两个区域，击倒MMP-14。用编码MMP-14 shRNA（结构体AB和CD）或lacZ的腺病毒转导HSC。细胞被胶原包埋并用IL-1刺激。定量RT-PCR显示MMP-14 mRNA显著下调()并通过该敲除减弱了原-MMP-13的激活。有残留的前MMP-13激活，这很可能反映了shRNA治疗后残留的MMP-14蛋白(). 综上所述，这些结果证明了MMP-14在我们三维培养模型中pro-MMP-13的加工过程中的重要作用。
膜型MMP-14介导前MMP-13的激活A类Western blot检测HSC在含或不含IL-1的三维I型胶原中2天MMP-14的表达。B类将TIMP-2加入三维培养物中培养3天。通过Western blot和酶谱分析分别检测TIMP-2对前MMP-13和前MMP-9活化的抑制作用。指出了这些基质金属蛋白酶的成熟形式和可能的催化域。C类，用HSC在含有或不含IL-1的三维胶原中制备粗膜组分2天。将组分与pro-MMP-13孵育指定时间，然后进行MMP-13的Western blot分析。D类将含有IL-1的三维培养物的膜组分与pro-MMP-13和TIMP-2共同孵育。孵育后，通过Western blot分析测定pro-MMP-13的活化。电子以编码MMP-14 shRNA的腺病毒或lacZ作为对照，通过HSC转导MMP-14。通过定量RT-PCR测定MMP-14 mRNA的下调效率。F类，通过蛋白质印迹分析评估MMP-14的下调对MMP-13激活的抑制作用。
Pro-MMP-13与MMP-9的正反馈激活
除了测试膜组分对pro-MMP-13的活化作用外，我们还检测了条件培养基中的活性。2天培养的条件培养基主要含有前MMP-13。然后将条件培养基在无细胞系统中培养额外时间。令我们惊讶的是，内源性前MMP-13在条件培养基中与可溶性因子孵育期间自发成熟，并且在200 nM时MMP抑制剂抑制了其激活(). 然后，我们使用明胶珠耗尽条件培养基中的明胶酶，并检测前-MMP-13活化。如所示，明胶酶的耗竭，主要是该制剂中的MMP-9，导致了原-MMP-13的加工被消除，表明MMP-9在原-MMP-13激活中的作用。为了证明这一观点，我们将活性人MMP-9添加到缺乏明胶酶的条件培养基中。这恢复了培养基中pro-MMP-13的处理(). 因此，这些数据揭示了MMP-9在三维培养中激活MMP-13的正反馈回路。
MMP-9激活前MMP-13的正反馈回路和MMP激活级联A类收集含有IL-1的三维胶原HSC条件培养基2天，并在有或无MMP抑制剂的情况下将混合物培养额外时间。通过Western blot分析测定内源性前MMP-13的激活。B类，条件培养基中的明胶酶被明胶Sepharose 4B耗尽。将原始培养基和耗尽的条件培养基培养额外时间，并通过明胶酶酶谱和MMP-13的Western blot进行解析。C类，将活性人MMP-9添加回缺乏明胶酶的条件培养基中。孵育后，MMP-13被Western blot溶解。D类，阐明了所提出的三维ECM中HSC对IL-1刺激的MMP激活级联的模型。
讨论
肝纤维化研究进展的一个主要推动力是建立了分离HSC并随后将其鉴定为ECM产生细胞的方法(8,34). 在塑料、静止、储存维生素A的HSC上培养后，HSC会自发转分化为肌纤维母细胞(35). 这样的在体外通过添加Kupffer细胞调节介质或经鉴定可刺激HSC的可溶性因子也可加速激活。其中转化生长因子-β(36,37)血小板衍生生长因子(38)是激活塑料上HSC的两种最有效的介质。然而，HSC体内存在于三维ECM环境中，很少有研究通过实验再现这种微环境来研究HSC转分化的机制。将这种三维ECM环境纳入HSC培养，我们最近发现HSC是前MMP-9表达和激活的主要场所，反过来促进IL-1诱导的三维胶原HSC转分化。在本报告中，我们描述了MMP活化级联反应，包括用膜型MMP（MMP-14）激活pro-MMP-13，而膜型MMP-14反过来又处理pro-MMP-9。此外，我们确定了MMP-9的正反馈环，以激活前MMP-13。通过使用来自MMP-9敲除小鼠的HSC、shRNA敲除MMPs和MMP抑制剂，我们明确证明了MMP在三维ECM培养中HSC转分化中的作用。ECM中HSC转分化过程中IL-1诱导MMP激活级联的工作模型如所示.
将基质金属蛋白酶纳入肝损伤和纤维化形成的提议可能不一定毫无根据。一个明确的理由是，如果特定的ECM成分维持正常肝脏中静止HSC的表型，那么MMPs启动的基质分解应该有助于HSC的激活。事实上，来自临床和动物研究的证据表明，MMPs在许多类型的肝损伤中上调(39). 例如，早在CCl后6小时即可检测到MMP-3（基质溶素-1）的诱导4大鼠给药及48-72小时达到峰值(40). 一项更全面的研究揭示了基质金属蛋白酶在肝损伤中的相关性。单剂量CCl后4MMP-13、MMP-2、MMP-9、MT1-MMP、MMP-3和MMP-10均增加，峰值表达与炎症细胞因子的诱导一致(41). 此外，肝脏的免疫染色显示MMP-9在纤维形成活跃的“瘢痕”区域的定位，表明HSC可能是MMP-9的重要来源，而巨噬细胞除外(14). 在胆道结扎诱导的大鼠肝纤维化中，MMP-2和MMP-9的活性在胆管结扎后2天增加，在第10天达到最高水平，并在整个30天的研究期间保持较高水平，这表明慢性胆汁淤积导致的持续组织损伤和炎症维持了MMPs的诱导(13). 除了MMP在肝纤维化中的文献外，有充分的证据表明MMP与肺纤维化有关(15,42–44). 在我们的三维I型胶原培养模型中，促炎细胞因子IL-1，而不是生长因子，如转化生长因子-β或血小板衍生生长因子，诱导并激活原-MMP-9。这种急性期细胞因子诱导的选择性ECM内多种MMPs的大规模表达和激活在HSC的组织破坏和激活的早期阶段具有深远的意义，可能部分是通过Diss空间中ECM的降解。
pro-MMP-9的生理转化酶的鉴定仍不清楚。大多数培养细胞在体外可在细胞因子或生长因子的作用下产生MMP-9原，但正常细胞很少发生酶原的成熟（激活）。例如，骨关节炎的软骨细胞，而非正常组织，以MMP-13依赖的方式产生活性MMP-9(45). 在人类和小鼠皮肤中，糜蛋白酶样蛋白酶负责原-MMP-9的成熟，而分离的皮肤细胞无法转化原-MMP9(29,31). 为了在我们的培养模型的高度严格背景下找到MMP-9原激活物，我们首先将该激活物描述为对MMPs抑制剂敏感的分泌型蛋白酶原。这种抑制作用与我们之前的发现一致，即TIMP-1在相同的模型中阻止前-MMP-9的激活，表明另一种MMP是前-MMP-9的激活剂(19). 然后我们测定了转化酶的分子质量，该酶的主要成分约为50 kDa，次要成分约为25 kDa。这些尺寸与MMP-13（~50 kDa）及其催化域（~25 kDa）的尺寸相同。25-kDa带是催化结构域的概念是基于使用针对MMP-13铰链区域的单克隆抗体通过Western blot检测到该带的结果，并且在该部分中证明了实际的促MMP-9转化活性。然后，我们进行了全球调查，通过DNA微阵列分析确定在我们的三维培养模型中哪些MMP被差异上调。经实时RT-PCR证实，该分析表明MMP-13是前MMP-9激活剂的主要候选物。最后，我们对MMP-13的重组和敲除实验证明了这一观点是正确的。
本研究还确定了三维培养模型中pro-MMP-13的上游激活物。通过系统方法，我们发现前MMP-13由两种机制激活，一种是由膜型MMP-14（MMP-14）激活，另一种是通过分泌型MMP-9激活。首先，我们证明了膜相关的促MMP-13转化活性及其被TIMP-2抑制。虽然MMP-14的mRNA是组成性表达的，但IL-1似乎在转录后水平上调节蛋白酶，如其蛋白水平增加所示。MMP-14与shRNA的敲除程度与前MMP-13成熟的废除完全相关。令我们惊讶的是，我们还发现可溶性成分中存在额外的前MMP-13激活剂。部分中明胶酶的消耗使其活性消失，这导致我们检测了两种明胶酶，MMP-9和MMP-2。虽然基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶-2都存在于培养基中，但后者的数量很少，重组实验证明基质金属蛋白酶9是可溶性的前MMP-13激活剂。
全球ECM降解通常由许多MMP的协同作用介导。事实上，我们的三维ECM培养模型显示通过MMP激活级联（MMP-14>MMP-13>MMP-9+MMP-9>MMP13）发生基质塌陷和降解。三维系统诱导的其他基质金属蛋白酶，如MMP-3、MMP-10和MMP-12()也可能参与ECM退化。为了降解间质胶原蛋白，如I型胶原蛋白，MMP-13需要对三螺旋胶原蛋白进行初始裂解，从而导致胶原蛋白变性。随后通常会被明胶酶（如MMP-9）进一步降解。MMP-14作为非标准胶原酶的作用也有越来越多的证据(46,47). 事实上，我们的三维培养模型中的胶原蛋白分解是通过MMP-14的敲除来预防的。
在三维基质中，IL-1诱导了前MMP-9的表达，但没有激活。这与MMP-13缺乏表达有关。只有当引入I型胶原蛋白时，MMP-13才能诱导和激活，从而激活前MMP-9。关于IL-1诱导的上调I型胶原中MMP-9和MMP-13的信号传导机制，以及Matrigel如何阻止MMP-13前体而非MMP-9前体对IL-1的诱导，仍存在核心问题。为了解决这些问题，我们试图识别这两种ECM中HSC差异激活的IL-1信号。已知的MMP-9转录的两个主要调节因子是NF-κB和AP-1(29,48–50). 虽然I型胶原可以通过整合素或盘状体域受体传递信号并诱导原-MMP-2成熟(51–53)，这种信号不足以诱导MMP-9或MMP-13。因此，MMP-9和-13的诱导似乎需要IL-1提供额外的信号。
一般来说，哺乳动物细胞的增殖和分化最好在三维ECM环境中进行研究。虽然缺乏对三维细胞外基质中细胞分化的深入研究，但新的报道已经证明了细胞外基质重塑在细胞命运决定中的作用（主要由细胞外基质顶部的培养细胞进行）。基质金属蛋白酶对细胞命运决定的影响可能来自于ECM介导的机械支持的丧失，或来自基质释放的配体或外结构域脱落。例如，在骨髓细胞中组成性表达较高水平的MMP-9负责释放可溶性试剂盒配体，允许内皮干细胞和造血干细胞分化(54). 血浆激肽释放酶依赖性纤溶酶原激活级联被证明对通过ECM降解实现脂肪细胞分化至关重要(55). 上皮-间充质转化被认为是组织纤维化的另一种机制。最近，MMP-3被证明可以通过激活Rac和产生活性氧来启动上皮-间充质转化(56). 我们对三维ECM中HSC跨分化的研究为更好地理解MMP表达和激活调控的分子机制以及这些过程在HSC表型改变中的生物学意义开辟了一条途径。我们未来的工作将集中于IL-1和ECM双重刺激在HSC跨分化中同时产生的细胞内信号。同样，我们必须解决ECM降解如何引起HSC的转分化。最后，我们将在动物模型中确定MMP和IL-1在肝纤维化发生中的作用。
脚注
*这项工作得到了国立卫生研究院（NIH）拨款DK069418和AR051558、罗伯特和梅·赖特基金会（Y.P.H.）以及NIH拨款P50 AA11999和R24AA12885（H.T.）的支持。
2使用的缩写是：HSC，肝星状细胞；ECM、细胞外基质；基质金属蛋白酶；短发夹RNA；IL-1、IL-1；RT，逆转录；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；金属蛋白酶组织抑制剂TIMP；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白。
三Y.-P.Han，未公布数据。
工具书类
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