布尔卡1乳腺肿瘤含有明显的CD44⁺/CD24型^-和CD133⁺具有肿瘤干细胞特征的细胞

无附着长期培养存活的未分类细胞的特征

通过在低结合板（美国新罕布什尔州汉普顿Fisher Scientific）上电镀细胞来测试细胞在无附着情况下的生长能力。在这些条件下，一些细胞株在培养3到4周后显示出存活的漂浮菌落，形成紧密的球形。每个细胞系的球状体形成频率由六倍的96个低结合板上的平板细胞在500至1个细胞/孔的稀释范围内进行测试。每周对集落的数量进行评分，并在3周后将球体分散到单细胞中并直立到6孔板中。为了获得单细胞悬浮液，收集球体并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中清洗。单细胞悬浮液是通过在胶原酶/淀粉酶和DNAse（瑞士罗氏）中培养获得的，通过40μm过滤器过滤以去除剩余的聚集物（Fisher Scientific），然后直接电镀到96周的组织培养板上进行药物测试，或通过传代到新的低结合板上进行扩张。

细胞表面标记物分析

如前所述，将单层生长的细胞系进行胰蛋白酶化，将球形生长的细胞分散到获得的单细胞群中。用1%牛血清白蛋白在PBS中清洗细胞，并用PE抗鼠CD24（BD Pharmingen，加利福尼亚州圣何塞，美国）或APC抗鼠CD二十四（Biolegend，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）、FITC抗鼠CD44（Southern Biotech，美国阿拉巴马州伯明翰）或PE抗鼠prominin-I CD133（eBioscience，加利福尼亚州圣迭戈，美国）染色。根据制造商的说明，使用大鼠IgG（化学试剂，美国马萨诸塞州比勒里卡）作为同型对照。使用LSR II（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）对细胞进行流式细胞术分析。使用FACSDiVa软件（BD Biosciences）从不少于30000个细胞收集数据。

细胞毒性试验和组合指数计算

阿霉素从西格玛（美国密苏里州圣路易斯）获得，并以10 mmol/l的储备溶解在PBS中。使用前立即将等分样品冷冻并稀释在培养基中。顺铂和足叶乙甙来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。17-DMAG（17-二甲氨基乙氨基-17-甲氧基格尔德霉素盐酸盐）从Invivogen（美国加利福尼亚州圣地亚哥）获得。将这些药物溶解在二甲基亚砜中，以10 mmol/l的等分储备储存，并在使用前立即在培养基中稀释。

细胞以每孔10000个细胞的速度接种在96周的培养皿中的六个重复中。第二天或按指示将培养基中的阿霉素、顺铂、足叶乙甙和17-DMAG连续稀释液添加到细胞中。产生暴露后24小时、48小时和72小时对单一药物的剂量反应曲线，以确定组合使用的浓度范围。对于药物相互作用研究，按顺序添加药物（17-DMAG延迟24小时加入）或同时添加，最终体积为100μl。使用Cell Titer 96水溶液细胞增殖试验（Promega，Madison，WI，USA）测量细胞毒性，这是一种基于四唑化合物MTS（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-5-[3-羧甲基氧基苯基]-2-[4-磺苯基]-2的生物还原测定活细胞数量的比色方法H（H）-四氮唑，内盐）。在暴露于单一药物后或在连续添加实验中总共48小时后，向每个孔中添加20μl MTS试剂，并将平板在含5%二恶英碳的37°C加湿培养箱中培养1至4小时。使用96-well平板读取器记录490 nm处的吸光度。根据未经治疗样本的平均存活率对数据进行平均和标准化，并使用CalcuSyn（Biosoft，Ferguson，MO，USA）软件进行分析，该软件基于Chou和Talalay的多药效应方程[17].

肿瘤生长体内

所有研究均在AAALAC（国际实验动物护理评估与认证协会）认可的机构进行，符合美国公共卫生服务局关于研究中动物护理和使用的指南。将筛选出指示细胞表面标记物的亲代细胞和细胞重新悬浮在100μl RPMI培养基中，并注射到6-8周龄非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷雌性小鼠的腹股沟小鼠脂肪垫（pad#4）中。使用卡尺测量来监测肿瘤的生长，以确定肿瘤的质量。重量（毫克）是根据两个垂直尺寸（长度和宽度）的测量值（毫米）计算的，使用长椭球体的公式，假设比重为1.0毫克/毫米^三[18].

干细胞相关基因的RNA提取与分析

按照制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分离总RNA，然后进行DNAse处理和RNA清理（RNeasy Mini Kit；Qiagen，Valencia，CA，US）。使用安捷伦2100生物分析仪上的RNA 6000纳米实验室芯片试剂盒（Qiagen）测定RNA浓度和完整性。

使用人类干细胞RT检测了84个与干细胞生物学相关的基因的mRNA水平²探查器阵列（SuperArray Bioscience，Frederick，MD，USA），符合制造商的说明。使用第一链合成试剂盒（Qiagen）逆转录RNA（250至500 ng），使用SYBR green/ROX Master Mix（Qiangen）对cDNA进行实时PCR，并在7500实时PCR系统（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）上进行PCR循环。使用默认熔化曲线设置运行离解曲线作为质量控制。使用在同一阵列上扩增的家政基因的平均值对每个基因的阈值周期获得的值进行标准化。

实时定量RT-PCR

使用LightCycler RNA Master SYBR Green Kit和LightCyscler 480仪器（美国印第安纳波利斯罗氏生化公司），采用实时定量RT-PCR测量所选小鼠ATP-结合盒（ABC）转运体的mRNA表达水平。附加文件中列出了基因的特异性PCR引物序列1用250 nmol/l特异性引物对200至400 ng总RNA进行所有RT-PCR反应。由无模板（水）反应混合物组成的阴性对照品在所有反应中进行。在所有RT-PCR运行后，使用LightCycler 480软件测定每个底漆组的熔化曲线。使用二阶导数最大值分析和算术基线调整确定每个转录本的交叉点。将每个转运蛋白的交叉点值归一化为参考基因的各自交叉点值Pmca4公司（质膜钙ATP酶4）[19]. 使用ΔΔCt方法将数据表示为基因表达的倍数变化。

表达干细胞标记的细胞在无附着的长期培养中存活并增殖为球形

癌症干细胞的一个特征是，它们能够在半固体载体或液体培养基（称为球体或乳房球）中以三维结构生长。确定布尔卡1细胞在没有附着的情况下形成球形，我们将A.8细胞分类为CD44⁺/CD24型^-电池（SC⁺)和CD44^-/CD24型⁺（SC^-)人口。通过将稀释度从500限制为1个细胞/孔，在低结合96 well板中的六个重复孔中对细胞进行平板。2到3周后，一些细胞和细胞聚集体形成但退化，但许多存活下来并形成紧密的活跃生长的球体。SC⁺与SC相比，种群中增殖的活球体数量显著增加^-人口，并生成球状体，即使电镀为低至4至6个细胞/孔（图​（图2a）。2a个). 为了确定这些球体是否可以膨胀在体外在长期成球实验中，球状体被分离成单细胞悬浮液并多次传代。当在没有附着物的情况下进行电镀时，这些细胞在随后的八个通道中反复形成球体。因此，A1.8细胞系包含一组在没有附着的情况下存活的细胞，并形成可以扩展的球体在体外.

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图2

表达干细胞标记物的细胞在没有附着的情况下存活并形成球形结构。（a）球体形成频率增加布尔卡1为SC分类的A1.8个单元格⁺（CD44⁺/CD24型^-)与SC相比^-（CD24⁺/CD44细胞^-)人口。所示结果来自于通过限制稀释进行的长期球体分析。黑色条表示CD44形成的球体数量⁺/CD24型^-排序后的单元格/孔和白色条表示CD24中的数字⁺/CD44细胞^-培养2周后，细胞与6个重复孔的±标准偏差。纵坐标上的数字显示电镀/孔的电池数量。显示了三个独立实验中的一个。（b）未分类布尔卡1A1.8在没有附着物的情况下电镀的细胞形成球形，富含表达干细胞标记的细胞。将A1.8作为单个细胞在低结合板中电镀2至3周，所得球体随后扩增4代，分散到单个细胞群中，并用适当的抗体染色（如材料和方法中所述）。CD44和CD24标记在左侧显示为开放直方图，填充直方图显示用匹配的同种抗体染色的阴性对照。单色分析在右侧面板上；双重染色显示在底部。结果以CD44的百分比表示⁺/CD24型^-细胞总数。注意含有CD24的双重人群的外观^-/低亲本细胞中不明显的细胞与球衍生细胞并排运行，如图1中的亲本A1.8细胞系所示。这里显示了三个以上的代表性实验。

由未分类细胞形成的球形物在表达癌症干细胞标记物的细胞中富集

为了确定假定的肿瘤干细胞标记物在球体中的表达，我们将A1.8和RP.1细胞系作为单个细胞/孔在低结合96-well板中进行了预先分类。球状体形成的频率为2%至4%，这与在这些细胞系中表达各自癌症干细胞标记的细胞所占比例一致。所得球体分离成单个细胞，并在96周内膨胀，然后在六孔低结合板中膨胀。对多次传代后来源于球体的细胞的分析显示，表达推定癌症干细胞标志物的细胞自发富集。此外，一个明显的细胞亚群，即CD24^-/低人口（图​（图2b），2亿)之前在任何亲本细胞系中都没有观察到这种现象（图​（图1b1亿以及未示出的数据）。超过10%的来自扩张A1.8球体的细胞获得CD44⁺/CD24型^-表型（图​（图2b，2亿，下部面板）和超过30%的CD44⁺/CD24型^-/低对RP.1细胞进行了类似的观察，其中球形细胞的CD133含量为27.7%⁺多段后的单元格（附加文件4).

确定是否有其他布尔卡1细胞系可以在没有附着的情况下生长，我们在限制稀释的长期球状体形成试验中，将16个细胞系中的每一个细胞作为单细胞/孔进行电镀。在培养2至3周后，监测细胞的生长情况，并对球体的数量进行评分。细胞形态变化很大，如培养2周后的A1.1、A1.8、B.15、P3.17、P2.1和RP.1细胞所示（附加文件5). 来自B、P2和P3肿瘤的细胞系具有小聚集体和漂浮的非活性细胞。相反，来自A1和RP.1肿瘤的所有细胞系在96周的培养中都有活的球形细胞，并且在随后的多次传代后以球形细胞的形式大量增殖在体外巧合的是，这些细胞系的CD44细胞比例也较高⁺/CD24型^-或CD133⁺种群。由于其他细胞系未能生长为球形，我们没有尝试描述表达CD44的细胞的微小部分⁺/CD24型^-这些细胞系中的标记。

在单层培养中传代数代后，筛选出假定干细胞标记物的细胞重新填充亲本细胞组分

我们检查了细胞是否被分类为阳性或阴性表达，或者假设的干细胞制造者在传统组织培养皿中作为单层生长时是否保持其表型。A1.8细胞分类为100%CD44⁺/CD24型^-（SC⁺)或CD44^-/CD24型⁺（供应链^-)群体和镀层为单层。仅占SC的2.7%⁺保留CD44的细胞⁺/CD24型^-三次传代后的表型，从而重建了亲本细胞中1.32%至5%的部分（附加文件6[面板A]和图​图1）。1). 此外，从CD44的相对象限中筛选出的细胞^-/CD24型⁺CD44表型持续缺失⁺/CD24型^-标记物（0.05%）。因此，CD44的扩增⁺/CD24型^-单层细胞导致CD44和CD44的重建⁺/CD24型^-和CD44^-/CD24型⁺在亲代细胞中发现的细胞组分，而CD44缺失的细胞⁺/CD24型^-细胞无法重新填充CD44⁺/CD24型^-分数。

类似地，RP.1细胞分类为100%CD133⁺在单层细胞中传代两代后，细胞表现出表达减少（附加文件6【面板B】），而细胞耗尽CD133⁺人口（分类为100%CD133^-)无法重建亲代群体，CD133的比例很低（0.6%）⁺细胞。这些数据表明CD44⁺/CD24型^-和CD133⁺在各自的亲代细胞中，细胞具有相似的自我更新和重新繁殖细胞部分的能力。

布尔卡1细胞对DNA损伤剂的敏感性不同

为了确定布尔卡1细胞株使用不同的常用药物治疗乳腺癌患者，细胞株使用以阿霉素、顺铂和足叶乙甙为代表的不同类别的DNA损伤剂进行治疗。此外，我们使用了一种新的口服分子靶向药物，即17-DMAG，它是一种天然存在的安沙霉素抗生素，来源于格尔达霉素（GA，NSC 122750）。由于17-DMAG影响多个靶点并干扰细胞存活和DNA修复途径，因此对其进行了测试[20-24]. 所有细胞对顺铂的反应相对相似，抑制浓度为50%（IC₅₀)3至8μmol/l，对其他试剂的敏感性不同（附加文件7和数据未显示）。

表达干细胞标记物的细胞和来自球体的细胞对化疗药物高度耐药

我们比较了亲代A1.8细胞、分离自球形细胞的细胞和分选CD44的细胞对药物的敏感性⁺/CD24型^-（SC⁺)或CD44^-/CD24型⁺（SC^-)群体在分类后立即进行电镀。在第二天，随着顺铂浓度的增加，细胞被并排处理（图​（图3）。三). 来源于球形细胞的细胞对顺铂的耐药性显著高于亲代细胞，IC₅₀s分别为16.675μmol/l和4.274μmol/l（图​（图3a）。3a年). 此外，SC^-（CD44^-/CD24型⁺)人群明显比父母或SC更敏感⁺（CD44⁺/CD24型^-)人口，带有IC₅₀1.384μmol/l。此外，CD44⁺/CD24型^-（SC⁺)细胞有一个估计的IC₅₀45.846μmol/l（图​（图3b），3亿)，使用CalcuSyn软件计算得出。由于干细胞标记物在单层生长的细胞中逐渐丢失，这些数据可能进一步低估了癌症干细胞的化疗耐药性。暴露于8μmol/l顺铂48小时后，每个细胞组分的形态如图所示​图3c。3立方厘米虽然父母和SC^-人群表现出明显的毒性迹象，SC⁺细胞几乎没有毒性迹象，从球状体中分散的细胞显示出小的聚集体，表明细胞生长延迟，但值得注意的是，没有明显的毒性迹象。亲代RP.1细胞、球体和CD133分选细胞也获得了类似的结果⁺和CD133^-人口（未显示数据）。

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图3

布尔卡1表达干细胞标志物的细胞和生长为球状体的细胞对顺铂具有高度抗性。A1.8亲本细胞、来自分散球体的细胞和分选干细胞+（CD44）的细胞⁺/CD24型^-)和干细胞–（CD44^-/CD24型⁺)标记物与增加浓度的顺铂同时处理48小时。（a）父A1.8单元格（实心符号）与球衍生单元格（开放符号）的比较。（b）A1.8细胞分类为干细胞+（开放符号）和干细胞-（实体符号）群体。（c）对照组未经处理的细胞和暴露于8μmol/l顺铂的细胞的形态学外观，如各面板所示。注意培养72小时结束时，球状分散细胞形成聚集体。这里显示了三个独立实验中的一个。

为肿瘤干细胞制造者筛选的细胞在单层中生长时会失去耐药性

为了确定为假定的癌症干细胞标记物分类的细胞在单层生长后是否会失去耐药性，分类A1.8 CD44⁺/CD24型^-（供应链⁺)，CD44^-/CD24型⁺（SC^-)和RP.1 CD133⁺和CD133^-细胞作为单层传代四次。如上所述，除了失去干细胞标记物的富集外，这些细胞与亲代细胞相比，失去了对顺铂敏感性的差异（数据未显示）。

多药耐药基因的表达布尔卡1干细胞

为了确定表达干细胞表面标记物的细胞的耐药性是否是由于多药耐药基因的表达所致，我们比较了几种选定的ABC转运体在代表每个原发肿瘤的五种细胞系中的表达，并将其表达与C57/Bl6小鼠的正常乳腺进行了比较。数据标准化为Pmca4公司，一种家务基因[19]. 使用一组最有可能导致化疗药物耐药性的ABC转运体，我们包括Abcb1a型,抗体1b,抗体1、和抗体cg2.的表达式抗体cg2除P3.17外，所有细胞系中的表达均较高。与正常乳腺中的表达相比，B.15细胞的表达水平最高，增加了25倍（C57/Bl6；附加文件8[面板A]）。因此，抗体cg2表达与干细胞群体的存在或细胞在没有附着的情况下生存的能力无关，因为B15细胞对所有药物更敏感，缺乏干细胞标记物的富集，并且没有形成球体。

引人注目，更高抗体1b(Pgp公司,Mdr1号机组)在富含癌症干细胞标记物（即A1.8和RP.1）的细胞系中检测到了ABC转运蛋白的表达，但没有检测到其他ABC转运蛋白表达8[面板B]和数据未显示）。

我们还比较了ABC转运体在亲代细胞系、球体和分选阳性或阴性干细胞标记的细胞中的表达，以及在各自的原始A1和RP中的RNA水平布尔卡1肿瘤（附加文件8[面板C和D]）。对于抗体1b，A1.8细胞的亲本和分选群体的抗体1表达，A1.8亲代和A1.8 SC增加最大⁺已排序的单元格。相反，RP.1 CD133^-与原发性RP肿瘤相比，亲代细胞增加了五倍，而CD133⁺细胞和球体保留了原始RP肿瘤中的表达水平（附加文件8[面板C]）。

分析抗体cg2运输车（附加文件8【面板D】）在A1.8细胞中显示SC中的水平较高⁺与SC中的亲代细胞相比^-或球体。RP.1 CD133^-细胞显示最高水平的抗体cg2而RP.1亲代细胞系CD133⁺与在原始RP肿瘤中发现的水平相比。这些数据表明抗体1，但不是抗体cg2，与耐药性相关。

17-DMAG敏化布尔卡1细胞转化为化疗药物

我们还检测了热休克蛋白（HSP）90抑制剂17-DMAG是否致敏布尔卡1细胞对DNA损伤剂和给药时间表是否起重要作用。同时或依次添加阿霉素、顺铂或足叶乙甙，在DNA损伤剂之前或之后24小时添加17-DMAG。利用CalcuSyn软件模拟组合指数（CI）的计算，以确定药物相互作用的协同或拮抗作用。CI为1表示累加效应，而低于1表示协同效应。对于所有受试细胞系和药物，联合治疗是协同作用的，比单独使用任何一种药物都更有效，但与同时治疗相比，如果在顺铂24小时后添加17-DMAG，则没有发现额外的协同作用（图​（图4）。4). 使用阿霉素和17-DMAG也获得了类似的结果（数据未显示）。相反，当细胞在顺铂之前暴露于17-DMAG时，观察到CI高于1的显著拮抗作用（未显示）。这些数据与之前报告的G一致₁HSP90抑制剂在其他癌细胞中诱导的阻滞，使其对DNA损伤剂高度耐药[20].

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图4

17-DMAG与顺铂协同作用布尔卡1亲代干细胞和癌症干细胞。用浓度增加的顺铂、17-DMAG（17-二甲氨基乙氨基-17-脱氧基格达霉素盐酸盐）或这两种药物以恒定的1:3比例组合处理细胞。（a）同时治疗48小时。开口圆圈和虚线表示接触17-DMAG，填充圆圈和点线表示作为单一药物接触顺铂，实心线连接的填充方块表示组合。（b）连续添加药物。填充的圆圈表示暴露于顺铂48小时，开放的圆圈和虚线表示暴露于17-DMAG 24小时，填充的方块由实线连接表示组合。纵坐标表示顺铂的浓度，误差线表示三个以上独立实验中一个实验的六个重复孔的±标准偏差。（c）使用CalcuSyn软件计算的每个组合的组合指数（CI）的可视化表示。闭合的圆圈表示同时治疗，而开放的圆圈则表示顺铂和17-DMAG的连续添加。CI值小于1表示协同作用，大于1表示对抗，CI=1表示加性效应。（d）17-DMAG使亲代和癌干细胞对顺铂敏感。顺铂和17-DMAG的CI同时（+）或顺序（→）添加到亲代细胞或筛选出假定癌症干细胞标记物的细胞中。数据来自三个以上的独立实验。

我们还检测了顺铂与17-DMAG的组合是否使假定的癌症干细胞对DNA损伤剂敏感。同时或依次将来自A1.8和RP.1亲代细胞的细胞分离为相应的干细胞阳性和阴性标记物，并暴露于顺铂和17-DMAG。无论是同时给药还是连续给药（24小时后添加17-DMAG），所有药物剂量的联合治疗都具有高度协同作用，CI显著低于1（图4c、d).

携带干细胞标记物细胞的肿瘤诱导能力

确定表达不同癌症干细胞标记物的细胞是否致癌体内，增加RP.1的数量（图​（图5a）5a级)和A1.8（图​（图5b）5亿)将筛选出表达肿瘤干细胞标记物的细胞注射到小鼠体内，每次注射50个细胞。只有三分之二的老鼠接受了5×10的剂量^三CD133型^-RP.1细胞，无小鼠注射1×10^三细胞或更少的细胞在40天内形成肿瘤（图​（图5a）。5a级). 相反，为CD133排序的所有单元格⁺标记物具有高度致瘤性，肿瘤由50个CD133构成⁺细胞。此外，肿瘤由5×10^三CD133型⁺细胞比由相同数量的CD133细胞形成的肿瘤至少大10倍^-40天结束时的细胞。再观察60天没有肿瘤的动物。没有接受50或100 CD133的小鼠^-60天后对乳腺进行检查，发现细胞形成肿瘤或有小肿瘤的迹象（未显示）。共八只小鼠中有四只接受了5000个细胞，另外九只小鼠中又有三只接受了1000个RP CD133^-细胞有小肿瘤，平均直径小于200毫米^三，2个月后。

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图5

CD44表达的细胞分类⁺/CD24型^-或CD133⁺标记物在肿瘤起始细胞中富集。通过在非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷小鼠的小鼠脂肪垫（MFP）#4中植入50、100、500或1000个细胞来确定肿瘤启动能力。（a）RP.1 CD133⁺细胞与RP.1 CD133比较^-单元格，以及（b）A1.8 CD44型⁺/CD24型^-细胞与亲代细胞的比较。如材料和方法中所述，监测肿瘤生长率，并显示基于三次植入的每种细胞类型和植入的细胞数量的平均肿瘤大小。（c）生长肿瘤的小鼠总数，根据对每个细胞系进行的独立实验确定。阳性肿瘤的百分比显示在括号中。

虽然A1.8细胞形成的肿瘤生长速度慢于RP.1肿瘤，但A1.8 CD44⁺/CD24型^-细胞在肿瘤起始细胞中也高度富集，50到100个细胞足以在60天内生成肿瘤（图​（图5b）。5亿). 在这些细胞中进行的多项实验的统计分析，如图所示​图5c，5厘米，确认RP.1 CD133的富集⁺和A1.8 CD44⁺/CD24型^-肿瘤起始细胞中的群体。这些体内两种细胞类型的肿瘤发生研究表明布尔卡1携带不同癌症干细胞标记物的细胞在肿瘤起始细胞中富集至少50倍至100倍。