MS-DOCK：用于多步骤虚拟配体筛选的精确多构象生成器和刚性对接协议

摘要

背景

人类基因组学和蛋白质组学项目的最新进展极大地促进了大量大分子靶点进入药物研发项目。同样，目前有1000多万种有机化合物可从化学品供应商处获得，并可用于高通量筛选（HTS）实验或生物信息学计算。然而，实验分析和硬件/软件的成本不断攀升，突显出需要开发新的方法来帮助快速高效的命中识别。在这里，我们重点关注基于结构的虚拟配体筛选（SBVLS）方法[1-4]因为在药物发现活动或化学基因组学倡议的背景下，它们对图书馆优先排序有效[5-7]. 学术团体可以使用大量免费或开源VLS工具[8,9]诸如此类生物信息学方法在促进新先导化合物的鉴定方面起着重要作用。

理想的SBVLS方法应该预测配体的位姿和亲和力，并能够处理灵活性[10]. 目前还不存在这样的工具，试图用可用的灵活对接方法将数百万分子对接在数千个目标上，最终再进行结合亲和力的实际计算，这对大多数研究小组来说都是遥不可及的。事实上，人们可能想知道，将数百万个化合物对接/评分的合理性，例如，使用对CPU要求很高的随机方法（即，它们可能需要几次独立运行），放入可能有一半（或更多）的分子无法容纳的结合囊中。虽然互补的物理化学特征在确定蛋白质与蛋白质结合亲和力方面非常重要，但形状互补也是必不可少的[11,12]表明应重新考虑刚体对接程序。此外，当前的趋势是使用高质量[13]以目标为中心的库，而不是SBVLS或HTS项目中的大型化合物集合，因为活性化合物往往被数据库的噪音所掩盖[14,15]. 显然，在SBVLS项目中，根据受体结合位点规定的几何约束，集中化合物库的化学空间似乎是合理的[16]在通过灵活的方法将数据库中的所有化合物放入装订袋之前。许多工具和协议（即多步骤SBVLS协议）利用刚体对接的概念，或至少使用仅分析形状或形状互补性的方法，作为分层程序的第一步，在使用更精确和耗时的停靠/计分计算之前，快速减少复合集合的大小[16-21].

已经开发了几种在配体和受体之间执行形状互补搜索的方法。由Kuntz及其同事开发的DOCK是通过刚体对接实现蛋白质与小分子相互作用的首批程序之一，涉及形状互补搜索[22]. 程序DOCK通过使用填充装订袋的球体生成接收器的负像。然后，该算法尝试将配体原子叠加到球体的中心。配体和受体之间的匹配是通过配体原子叠加到受体表面来实现的[23]. 其他执行小分子和蛋白质刚性对接的程序是FLOG[24]、CLIX[25]和FRED[26]. 后者应用高斯形状拟合函数优化配体和蛋白质之间的接触面，从而实现极快的刚性对接过程。

尽管存在明显的局限性，但刚体对接方法还是很有趣的，因为它们比柔性对接算法快得多，而且大型集合的完全柔性对接会产生显著的噪声。提高刚体对接精度的一种常见方法是使用包含每个配体预先生成的多个构象的化合物库。事实上，与每个配体只有一个构象的刚性对接相比，将配体的多个构象集合与修饰型DOCK对接到受体部位显示出更好的富集效果[27]. 为了有效地使用刚体方法，必须使用成熟的商业软件包生成多转换器库[28,29]例如Corina/Rotate（Molecular Networks GmbH）（Gasteiger Research）、OMEGA（Openeye Scientific Software）、Catalyst[30]或使用FROG等免费工具[31].

尽管刚体对接方法对分层SBVLS药物发现项目具有吸引力[16,19,32]，这些是未被充分利用的。本文提出了基于DOCK程序的多构象刚体对接滤波器MS-DOCK。我们的方案是在含有37970个类药物化合物的文库中对七种具有不同结合位点性质的靶蛋白进行测试，以确定其检索65种已知抑制剂的能力。通过与用于多变换器生成的商业程序OMEGA和用于刚体对接的程序FRED进行比较，进一步验证了MS-DOCK的性能（即，在本研究中，我们将FRED用作形状互补滤波器，而不是用于完整筛选程序）。MS-DOCK能够成功地将初始化合物收集量减少2或3倍，具体取决于配体大小（如果已知）和结合囊形状。这样一个专注于口袋形状的简化化合物集合可以用于随后的广泛灵活对接阶段，可以使用DOCK或其他工具进行对接。因此，我们的刚体对接方法通过仅选择与受体结合囊具有满意形状互补性的分子来优先选择化合物。

结果

MS-DOCK方法

在这项工作中，我们描述了一种基于DOCK的高效方法MS-DOCK，以快速筛选分子数据库，并丰富与给定蛋白质靶结合位点具有良好形状互补性的分子的输出集合。MS-DOCK方法包括两个主要步骤：首先，为输入化学库中的柔性分子生成多个3D构象，这一步骤是使用内部开发的工具Multiconf-DOCK基于DOCK5中可用的系统搜索方法执行的[33]; 其次，在刚性蛋白质靶上使用几何匹配方法，将所有多重构象与DOCK6刚性对接（详细信息请参见方法）。

Multiconf-DOCK：方法和实现

我们开发了用于生成小分子多conformer的程序Multiconf-DOCK，该程序要求以mol2格式的每个输入分子的3D结构为起点。该方法基于对配体柔韧性的系统搜索[34]如DOCK5中所述。分子的3D结构是从锚段开始构建的，柔性部件是通过名为“锚优先”的增量重建方法添加的。我们使用多片段选项来考虑几个可能的锚片段。通过以指定增量旋转所有单、非末端、无环键来生成构象。使用扭转驱动方法[34]对于之前定义的每个扭转，尝试使用低能二面体值。在我们的实现中，我们通过增加允许位置的数量，显著增加了对构象空间的探索。引入这些变化是因为DOCK中的低能角值不足以重现实验测定的蛋白-甘氨酸复合物中观察到的配体结合构象[16,32]. 因此，对于芳香环和sp2杂化原子之间的单键，我们允许6个位置以45°旋转增量，而酰胺键保持刚性。单键sp2-O.3/S.3原子（Tripos原子类型）和芳香环-O.3/S-3原子也被认为可以以45°增量旋转。

由于用户定义的RMSD截止值，以及RMSD与外部构象的比较，Multiconf-DOCK工具可以有效地对配体的不同构象进行采样。为了计算两个不同结构之间的RMSD，两种构象通过最小二乘拟合程序叠加[35]. 每个分子的允许构象是根据包含范德瓦尔斯和库仑项的计算能量以及DOCK5中实现的琥珀力场来选择的。能量阈值，如RMSD，可以由用户定义。在本研究中，允许接受构象物的最大能量设置为25 kcal/mol，此外，允许初始单构象和生成的单构象之间的能量阈值为25 kcal/mol。为了应用于随后的刚体对接阶段2，我们为化学库中存在的每个分子生成了多达50个构象，RMSD值为1.0Å。为了编写Multiconf-DOCK，我们修改了用C++编写的程序DOCK5，同时还实现了RMSD和能量过滤器以及上述灵活性参数的更改。Multiconf-DOCK可在Linux和Mac OS X系统上运行。

用Multiconf-DOCK和OMEGA评估多构象生成

为了评估我们的构象生成器Multiconf-DOCK，我们使用了两个验证集。使用Multiconf-DOCK和OMEGA对从NMRshift数据库中获得的100种化合物进行了首次测试。这些分子的可旋转键的分布如图所示​图11（即这些化合物包含几个可旋转的键）。图中显示了由Multiconf-DOCK和OMEGA生成的一系列多达50个构象的最佳构象与预测的核磁共振结构与这100个分子的可旋转键数量之间的计算RMSD​图2。2由Multiconf-DOCK和OMEGA生成的最佳拟合构象与测试集之间的平均RMSD分别为1.1º和0.9º。由于所有保存生成的异构体之间的RMSD选择为1.0º，因此两个程序获得的结果都令人满意。可以预期，生成与NMRshift数据库中的结构相近的构象的能力取决于可旋转键的数量（图​（图2）。2). 89%的具有1-9个可旋转键的分子在使用Multiconf-DOCK和NMRshift结构生成的最佳构象之间的RMSD在0.1到1.5º之间，而58%的具有10-15个可旋转链的分子的RMSD大于1.5º。

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图1

NMRSHIFT收集的100种测试化合物的可旋转键分布。

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图2

最佳构象（对于50个系列）与核磁共振结构之间的RMSD与100种化合物的可旋转键数量.▲表示Multiconf-DOCK生成的构象物；OMEGA生成的异构体。

我们还研究了Multiconf-DOCK在第二个测试集的生物活性构象上的性能（参见方法部分）。我们通过计算实验结构的RMSD和目视检查，评估了改变处理柔性的参数的影响。这里的目的是检查Multiconf-DOCK是否能够正确地再现我们目标蛋白活性分子的实验结合构象。对于36个PDB蛋白-晶体结构（在所有65种已知活性物中），配体晶体结构与Multiconf-DOCK和OMEGA生成的最佳构象（每个化合物最多50个构象）之间的平均RMSD分别计算为1.32º和1.30º。Multiconf DOCK和OMEGA产生的最佳构象显示，36个X射线结构中77%和75%的RMSD分别低于1.5Å。两种FX抑制剂（PDB代码）的最差RMSD为2.45º1升/加仑对于Multiconf-DOCK和1g2升对于OMEGA）。这种大RMSD的一个可能原因可能是生物活性构象的准确性。对于中的配体1升/加仑提出了两种构象A和B。我们计算了构象a和构象B的最佳RMSD值分别为2.45º和1.23º。正如Hawkins等人最近讨论的那样[36]X射线蛋白-配体复合物中某些配体结构的不精确性已被注意到，可能是由于多种原因，最终导致与模拟配体构象相比，RMSD较高。在以下情况下1g2升分辨率为1.9Ω的.pdb，原因可能在其他地方。这个1g2升配体非常灵活，有12个可旋转键，已知结构预测精度随着可旋转键数量的增加而下降。此外，生成更多的构象物对此类化合物可能很有价值，使用OMEGA和多达100个构象物进行的额外测试提高了结果，最佳RMSD值为1.7º。最后，这两个程序都能够检索到36个平均RMSD值低于1.3Å的生物活性构象（每个配体最多有50个构象）。对于通过刚体对接生成“良好”对接姿势，可以认为此RMSD值是可以接受的。根据计算的RMSD值和目视分析（参见附加文件1)Multiconf-DOCK和OMEGA都很好地探索了构象空间，并且能够生成接近配体共晶体结构的构象。

此外，我们应用Multiconf-DOCK为我们的MS-DOCK VLS协议的刚性对接阶段2生成多转换器结构。我们之前的分析[16]结果表明，最终多conformer数据库的速度、准确性和结构多样性之间的最佳平衡意味着每个化合物生成约50个构象，RMSD值为1.0º。因此，我们为我们的诱饵库中的37970个小分子保存了每个化合物多达50个构象。这产生了由Multiconf-DOCK生成的总共709233个构象（平均每个化合物19个构象）（总共90小时），而当使用OMEGA以类似参数进行计算时，生成了825250个构象。

MS-DOCK刚体对接的形状滤波

然后我们调查了MS-DOCK是否能够回收活性化合物（见表​表1）1)从37970个分子组成的诱饵类药物库中筛选出7个蛋白靶点：核糖核酸酶a（RNAse）、凝血因子X（FX）、雌激素受体（ER）、CDK2（CDK）、胸苷激酶（TK）、羧肽酶a（CBXpe）和神经氨酸酶（NA）。众所周知，SBVLS方法的性能取决于受体结合位点的性质[37-39]，我们选择了具有不同物理化学性质的蛋白质的结合位点区域。我们的验证目标可以根据口袋形状和可接近性分为三组：1）具有极开放和平坦的结合部位：NA具有30%的埋藏度（计算方法如[16])体积约为504欧^三（使用Q-SiteFinder计算[40]); 2） 溶剂暴露凹槽，带有一些深的子口袋：埋藏度<47%，体积如下：RNAse，CDK2（511μ^三)和FX（546欧^三); 3） 具有相当封闭和深的结合囊和高度埋藏（75%-90%）：ER（572^三)，CBXpe（342Å^三)和TK（456º^三). 与结合囊类似，七个靶点的活性也显示出不同的物理化学性质（其中两个在本研究中至关重要：分子量和体积，见表​表11).

表1

七个靶点活性物质的理化性质

蛋白质	重原子数	分子量	可旋转键的数量	体积（Ω三)
RNA酶（8活性）	21 – 50	322 – 791	4 – 14	253 – 613
FX（9个活动）	29 – 41	427 – 548	5 – 12	411 – 616
ER（10个活动）	29 – 45	390 – 458	7 – 15	450 – 483
CDK（10个活动）	18 – 31	241 – 449	1 – 7	250 – 447
TK（10个活动）	13 – 21	186 – 369	4 – 7	181 – 243
NA（10个活动）	17 – 25	237 – 350	4 – 10	236 – 376
CBXpe（8个活动）	12 – 16	121 – 290	2 – 5	108 – 177

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我们将Multiconf-DOCK生成的多conformer数据库严格停靠在每个目标上，并研究在保留活性分子的同时可以减少多少输入收集。利用MS-DOCK（由Multiconf-DOCK生成的37970种具有多构象状态的类药物化合物库）筛选获得的七个蛋白质靶点的富集图如图所示​图3。三在MS-DOCK计算之后，使用接触评分函数优化参数，用DOCK6进行了刚体对接实验（见方法）。进行了两次模拟：一次使用凹凸过滤器（最大允许凹凸数设置为8，可以认为这是非常宽松的，允许一些原子碰撞，这是刚体对接有时需要的），另一次没有凹凸过滤器。由于没有发现任何重要的差异，因此这里只显示了使用凹凸过滤器的富集图。我们使用三个不同的值（默认值为50、30和0）对每次接触碰撞的惩罚进行了初步测试（有关详细信息，请参见方法），结果表明，接触碰撞惩罚为30时表现最佳。因此，MS-DOCK的所有现有结果都是以每次碰撞30的碰撞惩罚获得的。

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图3

7个蛋白质靶点和37970-化合物集合的富集图.根据检索到的已知活性物的百分比绘制了多构造器刚性对接后排名化学库的百分比。显示了MS-DOCK后七种蛋白质的结果，允许凹凸重叠：0.5（青色）、0.6（洋红）、0.75（绿色）。黄线表示FRED的结果。

为了更好地考虑配体和结合囊中的重要结构/化学差异，我们测试了3个可能的允许凸起重叠，范围从0.5到0.75。较低的碰撞-碰撞重叠参数容许配体和受体原子之间相对紧密的接触。人们可以预计，较大的配体往往会产生更多的碰撞，请记住，该过程涉及刚体对接。显然，根据结合位点/配体的性质调整评分/对接方法可以提高VLS实验的性能[16,41]. MS-DOCK的结果如图所示​图3三都同意这种推理。对于具有碰撞碰撞重叠三个值的CDK，实现了令人满意的富集。对于蛋白质RNAse、ER和FX，显示具有大容量和结合相对较大抑制剂的结合位点（见表​表1），1)，当允许的碰撞碰撞重叠为0.5时，观察到最佳结果（图​（图3，三，单位为青色）。相反，当小得多的抑制剂被激活时，例如对于TK、CBXpe和NA，首选碰撞碰撞重叠为0.75（图​（图3，三，绿色）。例如，我们使用Q-SiteFinder评估配体体积/口袋体积的比率[40]外汇为0.95第1页.pdb和0.45（对于TK）1e2k个因此，对大抑制剂（FX、ER、RNAse）应用0.5的冲突重叠，对小抑制剂（TK）应用0.75的冲突重叠，在多构象异构体刚性对接/接触评分步骤之后，用MS-DOCK方法在排名数据库的前30%中检索到至少70%的真实活性。对于NA和CBXpe（配体体积/口袋体积之比分别为0.44和0.42），我们仍然注意到MS-DOCK的可接受结果。在形状核心数据库的前40%中，检索到了50%的活动。

在我们分析的这个阶段，出现了一个明显的问题：如果没有关于给定靶点的活性配体的信息，那么应该使用哪些参数通过与MS-DOCK的刚性对接来有效地减少数据库？在这种情况下，我们建议碰撞重叠为0.6（见图​图3，三五个靶点FX、RNAse、ER、CDK和TK的总富集度良好，其中80%的活性物质被回收到顶部~50%（富集系数为1.6）。NA和CBXpe的前50%中回收了40%（富集系数为0.8）。最终结果是，在应用MS-DOCK并根据结合囊和配体的大小调整参数后，化学库可以成功地减少2到3倍，从而显著减少后续柔性对接步骤的计算时间。

讨论

据报道，SBVLS最近在命中发现、潜在客户优化和基于目标的库设计方面的成功应用[15]但大多数不同的步骤都可以优化。这里我们建议，能够快速减小输入库大小的形状匹配工具不仅对节省CPU时间很重要，而且对提高整体停靠评分方法的性能也很重要[16,20]. 根据这一推理，最近的研究强调了使用目标特定库的必要性，因为活性化合物可能会被包含它们的大型数据库的巨大噪音所掩盖（例如，参见Orry等人[14]). 为了克服柔性配体对接方法固有的指数问题，可以使用多个构象库作为输入进行刚体对接，并将形状互补搜索作为层次过程的第一步过滤。这样的方案应该能够快速对接大量分子，以相对“粗糙”的方式过滤掉不相关的化合物，而适合结合囊中的分子可以传递到下一个更精确、更灵活的对接评分阶段。尽管有一些能够进行刚体对接的商业或专有软件包可用，但重要的是向从事药物发现领域的学术科学家提供免费的程序（如DOCK、Multiconf-DOCK和MS-DOCK），因为许多机构的资金可能相当有限。

另一方面，忽略了VLS协议中的受体灵活性[42]在处理某些目标（即诱导配合）时可能会出现问题[43]或增强蛋白质界面的灵活性[44]). 最近，发表了几项研究，建议在VLS研究中采用各种策略来治疗受体灵活性[43,45,46]. 然而，这是一个非常具有挑战性的问题，因为可能的构象数量随着可旋转键的数量呈指数级增长，并且在项目的初始阶段，在处理数千种化合物时，目前无法对所有可能的构像进行全面采样。因此，许多方法从受体侧实现伪柔性，这些方法可能会或可能不会导致更好的富集[47]. 然而，MS-DOCK的目的是允许快速的基于形状的预过滤步骤，而不是直接处理装订袋的灵活性。然而，MS-DOCK可以很容易地应用于通过模拟（例如通过正常模式分析或分子动力学/蒙特卡罗模拟）生成的多个受体构象[48])或实验（几种核磁共振或X射线结构[21]).

Lorber和Shoichet也有[27]提出对接包含处于多重构象状态的配体的刚性分级数据库。使用他们的方法的一个问题是缺乏对配体内能的处理。因此，该协议很容易导致不切实际的配体构象（例如，可能存在重要的内部配体冲突）明显很好地拟合到结合囊中，而实际上是一个计算伪影。这反过来又增加了排名数据库的噪音，因为一些无法放入装订袋的化合物仍然被选中，并且可能确实具有非常有利的装订分数。相反，在合理的能量窗口内生成多个配体构象（不一定只有最低能量构象），就像刚体对接之前使用Multiconf-DOCK或OMEGA一样，允许选择相关的配体构像。在[23]作者提出将随机增加120°的二面角产生的多配体构象对接在刚性受体上。以不同的方式，我们在Multiconf-DOCK中通过增加灵活性的系统搜索来处理可旋转键（详见结果部分：Multiconf-DOCK：方法和实现)允许更好地探索配体构象空间，但仍在允许的能量窗口内。我们提出的Multiconf-DOCK工具能够生成接近预测的小分子核磁共振结构的构象（见图​图2）。2). 对于80%具有多达15个可旋转键的测试化合物，与实验结构的最佳拟合显示RMSD值低于1.5º。此外，测试Multiconf DOCK产生与生物活性构象相似的构象的能力也非常重要（见附加文件1)因为本研究的一个目标是提出一种能够减小输入化学库大小的几何滤波器。36种活性物质的最佳拟合预测结构和实验晶体结构之间的平均RMSD为1.3º，这证明了我们在参数中引入的变化可以在适当的时候增加配体的灵活性。如上所述，我们强调读者注意到这样一个事实，即在DOCK5中实现默认的低能二面角，许多与蛋白质结合的配体构象不能被复制[16,32]. 事实上，众所周知，当配体与蛋白质结合时，它通常不是处于最低能量构象[49,50]. 决定结合配体中高应变能的因素之一可能是去折叠过程，在去折叠过程中，配体中疏水基团之间的分子内相互作用被释放，以增加与蛋白质结合位点的相互作用，如[49].

在对构象生成步骤进行分析后，我们评估了MS-DOCK和FRED（在其形状-互补模式下运行，只是为了使当前的比较有意义）的性能，以检索37970个分子的类药物库中种子的已知活性，用于七种具有不同结合位点几何形状和性质的靶蛋白。在ER、RNAse、CDK和FX的情况下，当大配体结合在相对大的结合位点时，FRED是非常有效的。相反，当囊中结合了相对较小的配体（TK、CBXpe和NA）时，FRED形状过滤搜索失败。MS-DOCK在ER、RNAse、FX、CDK和TK方面显示出良好的结果，只允许保留最初库的前30%。对于NA和CBXpe，由于抑制剂较小，活性位点相对较大，MS-DOCK表现不太好，但结果是可以接受的。在这种情况下，应考虑50%的排名数据库用于后续更精确的柔性对接实验。就速度而言，MS-DOCK在70小时内筛选出我们的收集物，其中包含709233个构象，平均7个靶点（每秒2.8个构象；每分钟约10个配体），在一个CPU上，而与DOCK进行柔性配体对接时，则为每分钟1个配体。因此，MS-DOCK方法比标准柔性配体与DOCK对接的速度快10倍，并且可以大大加快VLS过程，使后续柔性对接步骤减少至少2倍。本研究中的所有计算都是在两个Linux工作站（Xeon 3.0 GHz和1.5 Gb RAM）上进行的。根据七个目标的平均值，FRED在30小时内筛选出825250个构象的数据库。平均而言，FRED每秒在同一台计算机上对接8个构象，因此速度是MS-DOCK的3倍。然而，虽然FRED实现了更快的刚体对接，但MS-DOCK在创建仅基于形状互补的目标特定库时显示出更好的整体性能。

结论

我们开发了MS-DOCK，用于快速筛选大型化合物集合，以生成具有与受体结合囊满意形状互补性的小分子“聚焦”文库。MS-DOCK使用内部开发的工具Multiconf-DOCK生成多整合库。此外，在Multiconf-DOCK中实现的更好的配体柔性处理可以很容易地用于提高与DOCK6的柔性对接精度。

MS-DOCK方法基于广泛使用的程序DOCK（对于学术机构来说都是免费的），当该方法至少在我们的验证集上用作几何过滤器时，其性能往往优于FRED。根据目标绑定站点的不同，MS-DOCK允许使用初始数据库的一部分（通常为30-50%），而不会影响协议在检索活动时的性能。

我们认为，多级SBVLS有助于提高使用新支架搜索命中化合物的速度和速率。应用形状过滤作为基于结构的筛选协议的第一步，可以在不降低所选化合物的化学多样性的情况下创建目标特异性库。在这种推理过程中，MS-DOCK方法可以成功地应用于分层VLS过程，以减少计算长度，同时提高整个过程的性能。

方法

作者的贡献

NS为该方法的开发和验证做出了贡献。DL有助于分析和数据解释。BOV和MAM设计的MS-DOCK。MAM开发了Multiconf-DOCK并协调了该研究。所有作者都参与了写作，阅读并批准了最终手稿。

补充材料

鸣谢

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