有丝分裂受体下调涉及其内化和泛素依赖性分选到多泡体（MVB）。MVB分选的分子基础已部分确定，运输（ESCRT）复合物（ESCRT-0/h，I，II，III）所需的几个进化上保守的细胞溶质内体分选复合物被招募到内体中形成MVB，然后通过AAA ATP酶、VPS4再循环回胞浆(1). 除ESCRT复合物外，其他因素也参与MVB的形成，包括酿酒酵母蛋白质Bro1p(2)，其通过其N-末端Bro1结构域结合ESCRT-III(三)并招募去泛素酶Doa4p(4). 与ESCRT复合物相比，哺乳动物细胞中Bro1p功能的保存尚不清楚。
参与MVB生物发生的细胞成分支持逆转录病毒芽变期间的晚期事件，在逆转录病毒芽化期间，它们通过病毒Gag蛋白“晚结构域”内的保守肽被招募(5). HIV的p6晚结构域通过PTAP肽结合ESCRT-I亚单位TSG101，并通过YPD-LXXLF基序结合Bro1p-相关蛋白Alix(6–9). 后一个发现提供了间接证据，证明Alix也可能有助于MVB排序。然而，尽管Alix在结构上与Bro1p相关(10–12)，定位于内体(13)，并结合ESCRT蛋白在体外(6,7)，迄今为止的功能研究未能揭示这种作用(10,12).
结果和讨论
为了研究Alix招募是否支持MVB分类，我们首先将HIV p6连接到转铁蛋白受体（TfR）的细胞质域，该细胞质域通常在内体和细胞表面之间循环[参见支持信息（SI）图S1有关记者的详细信息]。虽然TfR-GFP分布与内源性TfR相似( 一和b条)，大多数p6-TfR-GFP定位于细胞内病灶，与迁移到晚期胞内隔间一致( c（c）和d日). Myc-tagged p6-TfR定位于类似结构(e（电子）). 根据转染细胞与相邻细胞相比的TfR荧光信号判断，与内源性TfR相比，TfR嵌合体的水平并不高()并通过Western blot分析(图S2A类). 因此，他们的贩运不太可能受到高表达水平的影响。p6-TfR定位于后来的内吞区室的一个微不足道的解释可能是，它被认为是未折叠的，并受到泛素依赖的高尔基体后质量控制(14). 然而，无法检测到嵌合体的泛素化(图S2B类). 此外，为了防止泛素化，p6和TfR细胞质尾部的所有赖氨酸突变为精氨酸，并不影响p6-TfR-GFP的分布(（f）).
HIV p6晚期结构域将TfR-GFP从内吞再循环途径转移。用TfR-GFP转染细胞(一和b条)，p6-TfR-GFP(c（c）和d日)，myc-p6-TfR(e（电子）)，或p6-TfR-GFP（6KR）(（f）)显示GFP荧光(一,c（c）、和（f）)并为TfR染色(b条和d日)或myc(e（电子）). （比例尺，10μm）
为了表征含有p6-TfR-GFP的细胞室，对细胞进行内体标记染色。尽管TfR-GFP的puncti与EEA1广泛共存(图S3)，很少有p6-TfR-GFP结构这样做。用LAMP1定位的p6-Tf R-GFP很少(图S3). 脂质LBPA是两种特征明确的内体标记物，主要定位于溶酶体和晚期内体(15,16)和胆固醇，其定位于MVB，但也存在于其他内胚体中(15)和生物合成室]。p6-TfR-GFP和LBPA之间几乎没有共定位(图S3). 相反，p6-TfR-GFP与胆固醇标志物filipin持续共定位(图S3). 这些数据表明，在稳定状态下，大多数p6-TfR-GFP存在于早期内体和溶酶体之间的隔室中。
电子显微镜用于确定HIV p6是否支持这些隔间内货物的向内发泡。大多数p6-TfR-GFP定位于空泡腔(澳大利亚、箭头和表S1). Myc-p6-TfR，标记在细胞质结构域上的表位，也标记在管腔上(抗体、箭头和表S1)，与该位置的嵌合体排序一致。这些液泡的形态与未转染细胞中成熟MVB/晚期内体的形态相似，具有丰富的内囊泡和一些额外的内容物（数据未显示）。它们的平均直径（590±77 nm；n个=55）与对照细胞的MVB/晚期内体相似（602±92 nm；n个= 46). TfR-GFP公司(交流电)或myc-TfR（数据未显示）标记质膜，细胞内标记主要出现在小管或含有少量或无内囊泡的液泡的限制膜上，这与早期内体一致(表S1).
p6-TfR被输送到晚期内吞腔。(A类)转染p6-TfR-GFP的细胞(一)，myc-p6-TfR(b条)，或TfR-GFP(c（c）)使用GFP或myc抗体对EM进行免疫标记。箭头显示了标记内体的纳米金增强颗粒的示例。（比例尺，0.4μm）(B类) (左侧)将转染myc-p6-TfR的细胞与Alexa脉冲相结合594Tf，然后固定并用抗myc染色。箭头显示了同位化的示例。星号表示未转染细胞。（比例尺，10μm）(赖特)通过宽视野显微镜对上述处理的转基因细胞进行成像。计算每个细胞[未转染（cont）124个细胞、myc-TfR 40个细胞和myc-p6-TfR 45个细胞]的平均Tf荧光强度。数值为平均值±SEM。
为了确定p6-TfR是从生物合成途径进入晚期内吞室，还是首次暴露在细胞表面，对其内化和保留Tf的能力进行了检测。用Alexa短暂刺激细胞594Tf并用leupeptin追踪，以限制残留Tf的降解。当从未转染细胞或含有myc-TfR的细胞中有效回收时，Alexa594转染myc-p6-TfR的细胞中保留了Tf(P（P）<0.0001，Mann–Whitney双尾试验），其中大部分与myc-p6-TfR共定位(B类).
HIV要么直接从质膜上发芽，要么在发芽进入质膜的内体或内体样结构域后通过分泌“外泌体”途径释放(17). p6-TfR不会发生这些命运。首先，细胞中未释放p6-TfR-GFP(图S4A类). 第二，用溶酶体蛋白酶抑制剂培养细胞会增加p6-TfR-GFP的水平，但根据Western blotting或荧光定量判断，对TfR-GFP几乎没有影响(图S4B类和C类). 在这些条件下，大多数p6-TfR-GFP，但不是TfR-GFP，被LAMP1定位(图S4天). 与此相一致，脉冲追踪分析表明，虽然一些TfR-GFP和p6-TfR-GFP在生物合成后不久即被降解（很可能是通过ER相关降解），但此后p6-Tf R-GFP的降解速度比TfR-GFP快(图S4E类). 总之，p6-TfR-GFP遵循导致溶酶体降解的途径。p6-TfR-GFP的表达并没有破坏内源性MVB货物的运输，因为EGF降解在表达p6-Tf R-GFP细胞中不受影响(图S5). 此外，含有EGF的大多数隔间也含有p6-TfR-GFP，这表明p6-Tf R-GFP进入新形成的含有EGF-的MVB。
抑制AAA ATP酶VPS4干扰ESCRT功能并阻止MVB分拣和货物转发(18). 在表达显性阴性（dn）VPS4的细胞中，在大液泡和簇中发现p6-TfR-GFP(A类). 因此，p6-TfR-GFP表现为真正的MVB货物。HIV p6包含两种肽（PTAP和LYP-LRSLF），它们分别通过招募ESCRT-I亚单位TSG101和Alix介导病毒释放(6,8,9,19) (B类). PTAP基序的突变使GST-p6与TSG101的结合失效（数据未显示），并不影响p6-TfR-GFP的定位(B类). 相反，p6-TfR-GFP缺乏功能性LYP-LRSLF基序，其定位类似于TfR-GFP(B类). 因此，p6-TfR-GFP的排序与绑定Alix的能力相关，但与TSG101无关。HIV p6对TSG101的有效招募可能取决于PTAP肽以外的因子。其中一个因素很可能是泛素，因为它能够增加TSG101对PTAP肽的亲和力(19)泛素化在病毒出芽中的作用(20).
p6-TfR-GFP分选的分子表征。(A类)转染p6-TfR-GFP和WT的细胞(上部)或dn(下部)VPS4B-myc用抗myc免疫染色。(B类) (上部)p6-TfR-GFP图，表示PTAP和LYP-LRSLF基序。(下部)用p6-TfR-GFP转染细胞(左侧)或LYP-LRSLF中含有p6-TfR-GFP突变(居中)或PTAP(赖特)如图所示的图案。(C类)去除Alix的细胞转染p6-TfR-GFP，与溶酶体抑制剂孵育，然后标记EEA1(上部)或LAMP1(下部). 箭头表示缺少EEA1和包含LAMP1的p6-TfR-GFP结构的示例位置。（比例尺，10μm）
令人惊讶的是，根据这种相关性，导致Alix耗尽的条件基本上无法检测到(图S6A类)没有实质性改变p6-TfR-GFP的分布（数据未显示），也没有阻止p6-Tf R-GFP从早期内体中分离出来，并在阻止其降解时在溶酶体中积累(C类). 同样，Alix消耗仅对EGF贩运产生轻微影响(图S6B类和C类;P（P）=0.007，学生配对测试，双尾）。与ESCRT-I损失的影响相反(21,22)，EGF在早期内胚体中没有积累，泛素化蛋白的内胚体池没有增加（数据未显示）。先前的研究未能检测到阿利克斯耗竭对EGF降解的影响(10,12). 这些发现，再加上p6-TfR的持续贩运，表明其他因素可能是内体Bro1p相关活性的原因，或者至少可以补偿Alix的损失。
哺乳动物细胞含有另一种Bro1p样蛋白，即His结构域磷酸酪氨酸磷酸酶（HD-PTP）/His-D结构域/N23型蛋白酪氨酸磷酸酯（PTPN23）(23). 与Alix一样，HD-PTP拥有Bro1域并绑定ESCRT在体外(24)但除此之外，基本上仍没有特征。HD-PTP的预测二级结构表明Alix的V结构域结合HIV p6内的LYP-LRSLF基序(8,9)，也是保守的(图S7). 当HA标记的HD-PTP与dn VPS4共表达时，发现其聚集(图S8)并与VPS4、EEA1和LAMP1部分重叠(A类). 相反，当HD-PTP单独表达（数据未显示）或与WT VPS4联合表达时，HD-PTP主要是细胞溶质的(图S8). 这种行为与E类vps蛋白的行为一致，表明HD-PTP可能参与ESCRT途径。事实上，在沉默HD-PTP表达后(图S9A类和B类)，p6-TfR-GFP定位于与EEA1密切相关的簇(B类)表明其远期贩运受到了损害。使用HD-PTP对Alix进行编码时，未观察到其他表型（数据未显示）。
HD-PTP对内吞贩运至关重要。(A类)用HA标记的HD-PTP和dn VPS4B-myc转染细胞，然后按指示进行免疫染色。(B类)用HD-PTP RNAi处理的细胞用p6-TfR-GFP转染，用溶酶体抑制剂孵育，并对GFP或EEA1染色进行成像。(C类)将耗尽层粘连蛋白A或HD-PTP的细胞脉冲标记为125I EGF并追踪，然后分析EGF降解情况（正方形、实线）、再循环情况（三角形、虚线）或细胞保留情况（圆形和虚线）。数值为三个实验的平均值±SEM，每个实验重复进行。(天)去除层粘连蛋白A或HD-PTP并转染HA-Ubiquitin的细胞(居中右对齐)与Alexa同步555EGF并按指示染色。箭头突出显示EGF与标记物的共定位，箭头突出显示缺少EGF的HA-Ub阳性结构的示例。(E类)如图所示，将耗尽的细胞与EGF孵育10分钟，清洗以去除表面标签，然后固定。（比例尺，10μm）。
为了确定HD-PTP沉默是否影响其他MVB货物，我们测量了125I-EGF降解。在这些实验中，125I-EGF被短暂内化，细胞表面标签在随后的追踪中通过低pH清洗去除，以关注细胞内体池的命运125I-EGF公司(C类). 大幅减少了125I-EGF降解(P（P）=0.0015，Student配对试验，双尾）和增加的细胞内滞留125I-EGF公司(P（P）=0.05）与对照细胞相比。单独的实验表明，HD-PTP的耗竭对125I-EGF吸收和/或略微增强快速回收（数据未显示）。
内化EGF定位于EEA1阳性簇，并在这些簇中保持至少3小时(D左). 与对照细胞相比(D中心)，HD-PTP缺失细胞表达HA-Ub(D右侧)显示了HA在EGF簇上的强烈标记，也标记了内源性泛素化蛋白（数据未显示）。泛素化蛋白也在晚期内吞室中积累（数据未显示）。较短的摄取时间证实EGF在缺乏HD-PTP的细胞中被内化，尽管其定位比在对照细胞中更外围(E类). 因此，HD-PTP的消耗，就像ESCRT-I的消耗一样(25)，导致泛素化蛋白质在异常的内胚体上积聚。HA-Ub的过度表达并没有阻止EGF贩运，这表明这不仅仅是游离泛素水平下降的结果。
ESCRT的主要作用是在MVB内产生管腔内小泡。然而，一些ESCRT也可能在哺乳动物细胞内组织早期内体方面具有更广泛的功能(21,22). HD-PTP的丢失也显著影响了内体的结构组织，导致货物受体和液相标记物的通过缺陷。尽管在对照细胞中追逐后，内化的BSA-金几乎只定位于溶酶体，但在缺乏HD-PTP的细胞中，它并没有这样做，而是聚集在引人注目的膜簇中(答和b条和表S2). 这些让人想起ESCRT-1亚基TSG101缺失时形成的异常内体(交流电)尽管蓄水池堆叠(22)和细长的线性小管(21)没有TSG101缺失的特征。这种普遍的相似性不能用HD-PTP沉默后ESCRT-I的二次丢失来解释，因为TSG101水平不受影响（数据未显示）。
HD-PTP对于维持早期内体形态和功能至关重要。(A类)层粘连蛋白A耗尽的细胞(一和d日)、HD-PTP(b条,e（电子）、和（f）)或TSG101(c（c）)用BSA-15 nm金脉冲相位(a–c)或HRP-EGF(d–f)如图所示，然后进行EM处理。箭头表示HRP-EGF浓度区域。（比例尺，600 nm。）(B类) (上部)RNAi处理的细胞用抗TfR进行免疫染色。(下部)用Alexa对细胞进行脉冲处理594Tf和固定。每个样本使用相同的采集设置。（比例尺，10μm）(C类)RNAi处理的细胞被固定并进行LAMP1染色。（比例尺，10μm）(天)测量来自RNAi处理的细胞的280个溶酶体的直径，并将其分组到所示的尺寸范围内。
簇包含一系列小管和小液泡元件。液泡通常具有一些管腔内内容物，尽管其电子密度不如对照细胞中的晚期内体。因此，膜内陷似乎减少了，但并没有完全阻止。HD-PTP耗竭的另一个特征是MVB的体积密度从0.45%降至0.13%(表S2). 为了检查货物分类，细胞被HRP-EGF脉冲标记(A d–f). 在对照细胞中，HRP-EGF通过含有大量内部囊泡的内涵体到达溶酶体。在HD-PTP缺失的细胞中，HRP-EGF定位于簇，含有HRP-EGF的MVB数量减少了94%。HRP-EGF在3小时追逐中保持在集群中；事实上，含有HRP-EGF的簇的体积密度增加了（数据未显示）。HRP-EGF通常集中在簇的选定管状区域(A e公司和（f），箭头）。EGF在液泡中的分离受损，以及这些液泡未能完全发育和脱离管状结构域，表明HD-PTP在内胚体分选和MVB生物发生中发挥作用。
内胚体组织的丧失伴随着TfR重新分布到内胚体簇和Alexa摄取减少594Tf，很可能是因为TfR地表水池的减少(B类). 这样的货物回收失败可以解释为什么在消耗HD-PTP时发现p6-TfR-GFP与集群EEA1相关。后期的内吞区室也受到HD-PTP耗竭的影响。免疫荧光显示LAMP1标记的结构更大(C类). 通过EM分析，虽然晚期内体/溶酶体的体积密度仅略有增加(表S2)，它们的大小分布发生了显著变化(天;P（P）<0.0001，Mann–Whitney双尾检验）。
当用HD-PTP处理细胞时，RNAi被转染有HA-标记的抗RNAi版本的HD-PTP(图S9C类)但不是对照载体（数据未显示），根据EGF聚集表型的拯救和WT泛素染色模式的逆转判断，它们完全恢复了对内吞货物的分类能力(图S10,、和表S3). 挽救的细胞也能将p6-TfR-GFP分类为溶酶体(图S11). 这些救援实验允许解剖HD-PTP功能。
表1。
| 构造 | n个 | WT EGF（重量EGF）
| 集群EGF
|
|---|
| 变速箱 | 取消翻译 | 变速箱 | 取消翻译 |
|---|
| 佛罗里达州HD-PTP | 6 | 99 ± 2 | 18 ± 5 | 1 ± 2 | 82 ± 5 |
| L202型 | 4 | 88 ± 8 | 25 ± 12 | 12 ± 8 | 75 ± 12 |
| L202/I206型 | 4 | 91 ± 7 | 28 ± 13 | 9 ± 7 | 72 ± 13 |
| 兄弟1 | 4 | 17 ± 5 | 9 ± 3 | 83 ± 5 | 91 ± 3 |
| 浏览器1-V | 7 | 85 ± 11 | 14 ± 5 | 15 ± 11 | 86 ± 5 |
| 浏览器1-V L202 | 三 | 77 ± 15 | 11 ± 3 | 23 ± 15 | 89 ± 3 |
| Bro1-V L202/I206型 | 三 | 43 ± 6 | 7 ± 7 | 57 ± 6 | 93 ± 7 |
| Δ兄弟1 | 2 | 22 | 17 | 78 | 83 |
HD-PTP通过其Bro1结构域结合CHMP4B，通过包含两个PS/TAP基序和其他富含脯氨酸序列的中心结构域结合TSG101(24). Alix中的CHMP4B结合位点，而不是TSG101结合位点，对其驱动HIV萌芽的能力至关重要(8). 为了确定ESCRT结合是否与HD-PTP功能相关，我们首先在RNAi拯救实验中检测了删除结构域的影响。缺少Bro1域的HD-PTP无法恢复功能(,表S3、和图S11)Bro1域也不能单独使用(,表S3,图S10、和图S11). 令人惊讶的是，缺乏整个脯氨酸丰富区域和C末端PTPase结构域的HD-PTP能够恢复EGF贩运，接近全长HD-PTP观察到的水平()并大幅度恢复p6-TfR-GFP排序(图S11). 许多转染HD-PTP Bro1-V的RNAi处理细胞显示泛素的WT分布，并且在那些标记了细胞质结构的细胞中，其表型比未转染细胞中的表现温和(表S3). 仅V域并不能挽救HD-PTP的丢失（数据未显示）。因此，至少在这些实验条件下，Bro1-V结构域是HD-PTP中的最小功能单元。
在确定了Bro1域的重要性之后，我们接下来讨论了HD-PTP功能是否需要ESCRT-III绑定。CHMP4B与Alix Bro1内的疏水囊结合，其中Ile-212至关重要(8). 我们将HD-PTP（Leu-202）中的等效疏水残基突变为天冬氨酸。相邻的保守疏水残基Ile-206也被突变为天冬氨酸以产生双突变体。正如预期的那样，HD-PTP的Bro1域与Alix Bro1域一样，直接绑定到GST-CHMP4B，并且HD-PTP Bro1（L202D）和HD-PTP布罗1（L2202D，I206D）中都取消了这种绑定(A类). 为了进一步确定该区域是HD-PTP中唯一的CHMP4B结合位点，翻译了全长蛋白和突变体在体外用于结合分析( B类和C类). 这些分析证实Bro1结构域对CHMP4B结合至关重要。然而，令人惊讶的是，HD-PTP（L202D）保留了显著且可重复的CHMP4B结合活性（WT的10%），尽管这在HD-PTP中降低到了WT的1%（L202D-I206D）。当使用在体外翻译的Bro1-V结构( B类和C类). 网织红细胞裂解物中的辅助因子可能稳定HD-PTP和CHMP4B之间的相互作用。或者，V结构域可以充分稳定CHMP4B结合，使Bro1-V能够耐受单个氨基酸变化，而分离的Bro1结构域则不能。Alix中的Bro1和V域形成一个结构单元，尽管V域与CHMP4B结合位点有一定距离(8).
HD-PTP Bro1结合的分子解剖。(A类)Alix、HD-PTP或HD-PTP（L202D）或（L202D/I206D）突变体的His-tagged细菌表达的Bro1结构域与预先加载GST-CHMP4B或对照珠的GSH珠培养。结合后，考马斯公司对样品进行分析(上部)或者用抗-His蛋白涂抹Western blot(下部). 箭头指示绑定Alix和HD-PTP Bro1域的位置。存在CHMP4B带和少量CHMP4B降解产物。(B类)体外翻译的HD-PTP，指示的突变体(左侧)或Bro1-V结构域和指示突变体(赖特)用预先加载GST或GST-CHMP4B的GSH珠培养。GST-CHMP4B绑定的加载控件如下所示。箭头指示全长HD-PTP的位置。(C类)来自绑定已转换构造的数据。减去与GST对照的结合后，每个突变体的值表示为与WT全长HD-PTP或WT Bro1-V结构体的结合。数值为三个实验的平均值±SD。
为了测试ESCRT-III结合对HD-PTP功能的重要性，用HD-PTP（L202D）或HD-PTP（L202D，I206D）转染RNAi缺失的细胞。令人惊讶的是，尽管在细胞质结构上发现了泛素化蛋白的少量积累，但这两个突变体都能够拯救EGF分选和泛素分布，接近WT水平(和表S3). 这些数据表明，在全长蛋白质的背景下，ESCRT-III结合对HD-PTP功能不是必需的，并且表明Bro1结构域具有其他基本功能。然后在Bro1-V结构域融合中进行相同的突变。在这种情况下，Bro1-V（L202D）可以非常有效地恢复HD-PTP功能，而Bro1-V(和表S3). 因此，在缺乏包括ESCRT-I结合位点但也可能包含其他补偿活性的C末端残基的情况下，当ESCRT-III结合受到严重破坏时，HD-PTP功能就会丧失。上述HD-PTP突变体均未对内体功能产生显性负效应（数据未显示）。
本研究的目的是确定哺乳动物蛋白质是否与酿酒酵母Bro1p参与MVB排序。根据其分子相互作用模式和支持病毒萌芽的能力，最有可能的候选者是Alix(6,7). 然而，尽管能够结合Alix的肽的附着将TfR转移到MVB途径，但这种嵌合体的分类似乎并不严格依赖Alix。Alix的耗尽也对EGF贩运造成了轻微影响。相反，这两种货物的运输都受到了HD-PTP的严重影响。我们不知道HD-PTP是否直接支持p6-TfR贩运，因为我们无法检测HD-PTP和p6之间的结合[Alix对HIV p6具有中等亲和力(8,9)，HD-PTP可能结合p6的亲和力太低，我们无法检测。]然而，我们很想知道HD-PTP是否影响逆转录病毒的出芽。总之，我们的研究结果表明HD-PTP是内吞贩运的关键调节器，其中ESCRT-III结合很重要，但并非严格必要。
