心力衰竭源于心脏泵满足身体需求的能力受损,并向机体其他基本功能的改变发展。充血性心力衰竭(CHF)患者总是抱怨早期肌肉疲劳和运动不耐受。据报道,该病中存在骨骼肌血管功能改变和固有骨骼肌异常(隆德等。2001). 能量代谢的改变在功能缺陷中起着重要作用,例如心脏收缩力下降、骨骼肌收缩力下降和抗疲劳能力下降。研究表明,CHF中的能量缺乏会影响线粒体室,包括呼吸速率、线粒体酶活性和表达的降低(德索萨等。1999,2000,2001;艾德等。2001;马林·加西亚等。2001). 这些变化发生在心肌、骨骼肌和膈肌中,从而导致心力衰竭患者出现代谢性肌病。这增加了CHF中激活的某些循环因子可能损害线粒体基因复制,从而损害线粒体DNA拷贝数和/或线粒体基因转录的可能性,但这仍有待确定。
心肌和骨骼肌的收缩、代谢特性和线粒体含量不同。这些特性可以通过各种生理和病理生理过程进行调节,使肌肉细胞能够适应各种环境限制。线粒体在心肌细胞中占细胞体积的20-30%,在氧化骨骼肌样比目鱼肌(SOL)中约占6%,在腓肠肌(GAS)的表面糖酵解部分中仅占2-3%。决定特定肌肉类型氧化能力的细胞机制尚不完全清楚。
线粒体有自己的基因组系统,即线粒体DNA(mtDNA),这是一种共价闭合的环状双链DNA分子。哺乳动物mtDNA仅包含两个启动子,即轻链和重链启动子(分别为LSP和HSP),从中产生转录物,然后进行处理以产生编码氧化磷酸化系统(OXPHOS)、核糖体和转移RNA的13个亚单位的单个mRNA(Attardi&Schatz,1988年;Shadel&Clayton,1997年). LSP的转录还产生启动mtDNA复制所必需的RNA引物。其余的OXPHOS亚单位以及其他线粒体蛋白和参与线粒体DNA维护的因子由细胞核编码。因此,线粒体的生物发生和功能取决于核基因组和线粒体基因组的协调表达。最近的进展已经开始阐明调节线粒体DNA复制和转录的因子以及核编码线粒体基因在生理和病理条件下的表达。基于这些研究,两种转录因子在核-线粒体通讯中起着关键作用:核呼吸因子1或2(NRF-1,NRF-2)和线粒体转录因子a(mtTFA)。
转录因子NRF-1和NRF-2结合并激活编码OXPHOS组分的各种核基因的启动子以及mtDNA转录和复制所需的因子,如mtTFA(斯卡普拉,2002年). 电刺激心肌细胞导致NRF-1 mRNA诱导和线粒体蛋白表达增加(夏等。1997). 在训练期间或运动后,骨骼肌中观察到NRF-1的诱导或结合活性增加(村上春树等。1998)AMP激酶激活或肌酸类似物给药后(贝杰隆等。2001)所有情况都与线粒体含量增加有关。在小鼠中靶向性破坏NRF-1可导致线粒体DNA数量急剧减少,并且在胚胎发育期间是致命的,这表明NRF-1在胚胎早期发育期间是线粒体DNA维持和呼吸链功能所必需的(霍和斯卡普拉,2001). MtTFA是一种细胞核编码的蛋白质,它结合mtDNA的LSP和HSP上游,并促进线粒体DNA在在体外系统。它在调节mtDNA复制中也有重要作用,因为mtDNA前导链的复制起始依赖于LSP转录产生的RNA引物(Parisi&Clayton,1991年;Dairaghi公司等。1995). mtTFA基因的破坏导致线粒体DNA耗竭、线粒体转录物丢失、线粒体DNA编码多肽丢失和严重的呼吸链缺陷(拉松等。1998). 此外,心肌细胞中mtTFA的靶向破坏导致扩张型心肌病,伴有房室传导阻滞和严重呼吸链缺陷(王等。1999;锂等。2000). 因此,这些结果确立了mtTFA在调节mtDNA拷贝数中的关键作用体内线粒体生物发生。
在这些转录因子的上游,最近人们关注过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的转录共激活物,即PGC-1α。PGC-1α被描述为一种多功能的共激活剂,可以共同激活PPARα以促进脂肪酸氧化(FAO)酶的表达,或PPARγ/甲状腺激素受体β以促进解偶联蛋白的表达以促进适应性产热,还可以通过与NRF的相互作用激活线粒体的生物生成(Knutti&Kralli,2001年;雷曼和凯利,2002年;斯卡普拉,2002年). 在心脏围生期发育期间,PGC-1α基因表达与能量产生能力的增加平行,并且在培养的心肌细胞或转基因小鼠的心肌中过度表达PGC-1 a会导致线粒体含量、脂肪酸循环酶和呼吸增加(雷曼兄弟等。2000). 此外,最近的研究结果表明,突变组蛋白脱乙酰酶5(HDAC5)对PGC-1α表达的心脏特异性抑制导致线粒体丢失和形态改变,线粒体酶下调(Czubryt公司等。2003). 这些数据建立了PGC-1α基因表达和氧化能力之间的直接因果关系。因此,PGC-1α作为线粒体功能能力的关键调节器,参与生理刺激对心脏能量产生的转导。氧化肌和心肌中PGC-1αmRNA高于糖酵解肌(拉鲁伊等。1999;林等。2002)通过低强度长时间运动和AMP激酶的激活增加(寺田等。2002). 它可以激活NRF的表达和活性,进而上调线粒体和核编码mtTFA核基因的表达(吴等。1999;斯卡普拉,2002年).
我们假设心力衰竭可以通过线粒体基因复制和/或转录受损影响氧化能力。使用主动脉条带诱导的大鼠CHF模型,我们测量了对照和衰竭心肌和骨骼肌中呼吸链复合体IV的一个细胞核和一个线粒体编码亚单位(COX IV和COX I)的mtDNA含量和mRNA表达。此外,我们还检查了参与核-线粒体通讯的已知因素(NRFs、mtTFA和PGC-1α)定量地与不同健康肌肉类型的氧化能力水平相关,以及它们的mRNA表达是否发生改变,并通过将每个mRNA水平与耗氧率和氧化酶活性相关,解释CHF氧化能力降低的原因。
结果表明,CHF患者线粒体基因转录而非复制减少,PGC-1α与衰竭心肌和骨骼肌以及健康肌肉的氧化能力相关。
方法
CHF大鼠模型
本研究符合INSERM动物福利委员会的指导原则。动物由法国Charles River实验室进行手术,手术后3周购买假手术和CHF大鼠。将动物随机分为两组(主动脉狭窄组(CHF)或半手术组(sham)),并用60 mg kg麻醉−1如前所述,通过胸部切口在升主动脉上放置0.6 mm宽的不锈钢止血夹,可诱发戊巴比妥、I.P.主动脉狭窄(德索萨等。1999;费尔德曼等。1993). 假手术大鼠在没有放置夹子的情况下进行了相同的手术。术后6个月,CHF组的死亡率约为70%,研究了11只CHF大鼠和11只Sham大鼠。通过腹膜内注射氨基甲酸乙酯(0.2g(100g体重)麻醉动物−1)分离并称重右心室和左心室(分别为RV和LV)、氧化比目鱼肌(SOL)和腓肠肌(GAS)的浅表糖酵解部分。这些肌肉的一部分被迅速冷冻用于生化、DNA和RNA分析,其他部分立即用于呼吸实验。
酶分析
冷冻组织样品在冰镇缓冲液((50 mg湿重)ml中均质后−1)包含(m米):Hepes 5(pH 8.7),EGTA 1,二硫苏糖醇1,MgCl25和Triton X-100(0.1%),在4°C下培养60分钟,以确保完全提取酶。如前所述,使用耦合酶系统测定柠檬酸合成酶(CS)和肌酸激酶(CK)的总活性(30°C,pH 7.5)(德索萨等。1999). CK同工酶用琼脂糖(1%)凝胶电泳在250 V下进行90分钟分离,个别同工酶通过将凝胶与耦合酶系统孵育来分解。细胞色素c(c)氧化酶(COX)活性如前所述测定(沃顿和扎戈洛夫出版社,1967年).
线粒体的功能特性
研究了线粒体总数的呼吸参数就地如前所述,在新鲜的皂苷激酶纤维中(维克斯列尔等。1987). 简单地说,从LV、SOL和GAS肌肉中切下薄纤维束,并在4°C的含有50μg ml的溶液S(见下文)中培养30分钟−1皂甙使肌膜渗透。使用克拉克电极(英国Strathkelvin Instruments)在含有3 ml呼吸溶液(溶液R,见下文)、温度为22°C、持续搅拌的血氧描记池中测定呼吸频率,并表示为(μmol O2)最小值−1(g干重)−1所含溶液S和R(m米):EGTA-CaEGTA缓冲液10(游离Ca2+浓度100 n米),氯化镁21、牛磺酸20、二硫苏糖醇0.5、咪唑20和离子强度160 m米(甲烷磺酸钾)。溶液S(pH 7.1)也含有5 m米MgATP和15 m米磷酸肌酸,而溶液R含有5 m米谷氨酸,2米米苹果酸,3米米磷酸盐和2 mg ml−1无脂肪酸牛血清白蛋白。ADP刺激呼吸(ADP公司)基础耗氧量以上(哦2)绘制为[ADP]与肌酸或不肌酸(20 m)的函数米).ADP公司使用Michaelis-Menten方程的非线性拟合来计算。最大呼吸速率(最大)是(ADP公司+哦2). 对每一块肌肉进行了一到三次测量。
总DNA的Southern blot分析
采用蛋白酶K消化、有机提取和乙醇沉淀等标准方法从LV、SOL和GAS肌肉中提取细胞总DNA。为了测量线粒体DNA水平,使用与大鼠线粒体12S rRNA基因nt231-695对应的线粒体DNA cDNA探针(GenBank登录号854269)和与大鼠核编码18S rRNA的nt872-1525对应的nDNA探针(GenBank登录编号854269{“类型”:“entrez-notide”,“属性”:{“文本”:“M11188”,“term_id”:“206631”,“term_text”:“M101188”}}M11188型)作为核DNA数量的控制。每种肌肉类型的总DNA(2μg)用巴姆HI限制酶,通过0.7%琼脂糖凝胶电泳分离并转移到尼龙膜(Hybond-N+,法国奥赛阿默沙姆生物科学公司)。将携带与mtDNA探针互补序列的少量质粒(25 ng)添加到测试样品中,用作阳性对照。用杂交缓冲液(AlkPhos直接杂交缓冲液,Amersham米磷酸钠,150 m米氯化钠,1米米氯化镁2,2 g封闭试剂(Amersham Biosciences)),并在室温下在二次洗涤缓冲液(50 m)中两次20 min米Tris,100米米氯化钠,2米米氯化镁2). 用碱性磷酸酶(AlkPhos Direct,Amersham)标记试剂盒标记每个探针。用化学发光试剂(CDP)检测信号-星星,Amersham),并使用图像分析仪(法国马内斯拉科奎特Bio-Rad)进行量化,以确定mtDNA与nDNA的比率。
实时定量RT-PCR分析
根据制造商的说明,使用Trizol试剂技术从冷冻组织样品(50–100 mg)中分离出总肌肉RNA(Invitrogen,Cergy Pontoise,法国)。使用Superscript II逆转录酶(Invitrogen)从5μg总RNA合成寡核苷酸第一链cDNA。
在LightCycler快速热循环器上使用SYBR Green技术进行实时PCR(法国梅兰罗氏诊断公司)。正向和反向引物()每个基因都设计在目标基因序列的不同外显子中,消除了扩增基因组DNA的可能性。对于缺乏内含子序列的线粒体COX I基因,我们使用阴性逆转录产物检查了基因组DNA的污染不会干扰定量。对于每组引物,基本的局部比对搜索工具(BLAST)搜索显示,仅获得了目标基因的序列同源性。对每组引物进行事先优化,包括确定最佳引物和MgCl2浓度、模板浓度和验证扩增效率。为了确认扩增的特异性,对PCR产物进行熔融曲线分析和琼脂糖凝胶电泳。PCR扩增重复进行,总反应体积为15μl。反应混合物由1μl稀释模板、1.5μl FastStart DNA Master SYBR Green I试剂盒(×10)、3 m米(COX I、mtTFA、NRF-1、NRF-2α、PGC-1α)或4米米(COX IV,β-肌动蛋白)氯化镁2和0.5μ米正向和反向引物(NRF-2α和PGC-1α除外,当0.3μ米使用)。Taq聚合酶激活8分钟后,允许扩增进行30–40个循环,每个循环包括在95°C下变性10 s,在55(COX I,mtTFA)、56(NRF-1)、58(COX IV)或65°C(NRF-2α,PGC-1α)下退火5–10 s,在72°C下延伸5–24 s,具体取决于靶基因。对每个靶基因的比目鱼总RNA的五倍系列稀释液进行分析,并允许我们构建线性标准曲线,从中计算测试样品的浓度。将结果归一化为β-肌动蛋白转录,以补偿输入RNA数量和反转录效率的变化,然后乘以总RNA(mg湿重)−1校正每单位组织中总RNA数量的变化,以比较三种肌肉之间目标基因的表达水平。
统计
数据表示为平均值±s.e.m(标准电气).单向方差分析,其次是纽曼-凯尔斯事后(post-hoc)测试用于评估控制肌肉之间的差异。CHF的影响由Student’st吨在每一块肌肉内进行测试。的值P(P)<0.05被认为是显著的。
结果
解剖数据
由于CHF大鼠体重显著下降(-34%),器官重量以每胫骨长度表示,这是一个独立于体脂或体液稳态的生长指数(). 由于两个心室的相对重量增加,CHF导致显著的绝对和相对心肌肥大(+83%),也导致肺重量增加。此外,在CHF大鼠中观察到明显的心脏失代偿临床证据(棕色和“肉豆蔻”肝脏、胸膜和腹膜积液以及心房增大)。
表2
| Sham公司(n个= 11) | 瑞士法郎(n个= 11) | P与。伪装 |
---|
体重(g) | 732 ± 22 | 484 ± 33 | < 0.001 |
心脏重量(g) | 1.62 ± 0.07 | 2.93 ± 0.15 | < 0.001 |
心脏重量/TL(g cm−1) | 0.35 ± 0.01 | 0.64 ± 0.03 | < 0.001 |
右心室重量/TL(g cm−1) | 0.06 ± 0.01 | 0.11±0.01 | < 0.001 |
左心室重量/TL(g cm−1) | 0.24 ± 0.01 | 0.38 ± 0.02 | < 0.001 |
比目鱼重量/TL(g cm−1) | 0.062 ± 0.002 | 0.051 ± 0.003 | < 0.05 |
肺重量/TL(g cm−1) | 0.37 ± 0.01 | 0.61 ± 0.06 | < 0.001 |
在同一CHF大鼠模型中(德索萨等。1999;莫肯等。2003)我们使用Langendorff灌注心脏模型显示CHF心脏的收缩和舒张异常(例如左室舒张末压从10±4升高到62±18 mmHg),并使用体内超声心动图显示收缩功能受损(左室缩短减少30%,射血分数减少21%)。总的来说,这些结果证实了这些动物出现严重CHF。比目鱼肌重量减轻显示肌肉萎缩。
线粒体的酶分析和功能特性
健康心肌表现出最高水平的CS、COX和线粒体CK(mi-CK)活性和氧化能力,其次是SOL和GAS肌肉(). 在LV和GAS中,CHF诱导CS(LV,−37%;GAS,−53%)、COX(LV)(−37%.GAS,–68%)和mi-CK活性(LV(−63%;GAS-72%)显著降低。LV和GAS在CHF期间的氧化能力分别降低了21%和33%。SOL肌肉对CHF的反应不太明显:CS和mi-CK分别显著降低22%和33%,而COX活性和最大呼吸速率降低()不显著。
假手术和CHF大鼠左心室(LV)、比目鱼肌(SOL)和腓肠肌(GAS)的酶活性和线粒体功能CS,柠檬酸合成酶;COX,细胞色素c(c)氧化酶;mi-CK、线粒体肌酸激酶和,最大呼吸速率。数值为平均值±s.e.m(标准电气). (n个=11)*P(P)< 0.05; **P(P)<0.01;***,†††P(P)< 0.001与各自的Sham组(*)或与Sham LV(†)。
线粒体DNA含量
通过Southern blot分析测量mtDNA含量,以mtDNA与nDNA的比值表示。结果显示于未显示健康和CHF心肌或骨骼肌之间mtDNA含量的显著差异。
假手术(S)和CHF大鼠左心室(LV)、比目鱼肌(SOL)和腓肠肌(GAS)总DNA的Southern blot分析一个,每种肌肉类型的代表性Southern blots,其信号来自线粒体DNA(mtDNA)和核DNA(nDNA)。包含与线粒体探针互补的质粒携带序列对应的阳性对照,并在4365 bp处提供信号。B类,在量化每个信号后测定mtDNA-nDNA比率。数值为平均值±s.e.m(标准电气). (n个= 11).
线粒体DNA编码的COX亚单位I和nDNA编码的COX-亚单位IV mRNA水平
如前所述(哈贝茨等。1999)Sham GAS的总RNA含量是Sham LV或SOL的两倍(LV:0.98±0.03,SOL:0.92±0.05,GAS:0.52±0.02μg(mg湿重))−1,P(P)< 0.001). 此外,CHF中LV的总RNA含量增加(Sham LV:0.98±0.03,CHF LV:1.08±0.02μg(mg湿重)−1,P(P)< 0.01). 两种COX亚单位的表达水平()线粒体生物发生的关键因素()将其归一化为β-actin值,因为与其他测试参考基因相比,该基因的表达最稳定(数据未显示)。将其乘以总RNA(mg湿重)−1,比较三块肌肉(哈贝茨等。1999).
实时定量RT-PCR分析左心室(LV)、比目鱼肌(SOL)和腓肠肌(GAS)过氧化物酶体增殖物激活受体γ协同激活物1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF-1)、核呼吸道因子2 DNA结合亚基α(NRF-2α)和线粒体转录因子A(mtTFA)mRNA的表达非手术大鼠和CHF大鼠结果以平均值±给出s.e.m(标准电气)标准化为β-肌动蛋白转录并乘以总RNA(mg湿重)的值−1. *,†P(P)< 0.05; **,††P(P)< 0.01; ***,†††P(P)< 0.001与各自的Sham组(*)或与Sham LV(†)。
线粒体DNA(mtDNA)编码细胞色素mRNA表达的实时定量RT-PCR分析c(c)氧化酶亚基I(COX I)和核DNA(nDNA)编码的细胞色素c(c)假手术和CHF大鼠左心室(LV)、比目鱼肌(SOL)和腓肠肌(GAS)中的氧化酶亚基IV(COX IV)一个,结果为平均值±s.e.m(标准电气)标准化为β-肌动蛋白转录并乘以总RNA(mg湿重)的值−1. *,†P(P)< 0.05; **,††P(P)< 0.01; ***,†††P(P)< 0.001与各自的Sham组(*)或与Sham LV(†)。B类COX I或COX IV mRNA水平与PGC-1α(过氧化物酶体增殖物激活受体γ-辅激活物1α)之间的相关性。第页相关系数;P(P),统计显著性。
在健康动物中,线粒体DNA编码的COX I和nDNA编码的COX-IV亚基表现出类似的mRNA表达模式,COX IV和COX I在LV中的表达较高,SOL中的表达较低1.5倍,GAS中的表达则较低3-5倍。在CHF中,我们观察到这两个亚单位的mRNA表达在LV中平行下降,COX I和COX IV分别为27%和43%,在GAS肌肉中分别为67%和74%。COX I和COX IV的抑制表达也存在于失败的SOL中,但未达到显著水平。
线粒体生物发生和功能相关的核因子mRNA水平
在健康动物中,LV中PGC-1αmRNA表达较高,SOL中低3倍(P(P)<0.001),GAS低6倍(P(P)< 0.001). NRF-1、NRF-2α和mtTFA转录物没有呈现类似的组织分布:它们在Sham LV和SOL肌肉中的表达具有可比性,在GAS中的表达显著降低().
在LV和GAS中,CHF导致PGC-1α、NRF-2α和mtTFA基因表达显著降低30-40%。SOL对CHF的反应再次减轻。全身代谢缺陷与线粒体生物发生和功能调节相关关键因子的表达总体下降有关。
在健康组织中,强正相关(P(P)在PGC-1αmRNA表达和CS之间观察到<0.001)(第页=0.856),COX(第页=0.837),mi-CK(第页=0.649)活性或氧化能力(第页= 0.868). NRFs或mtTFA mRNA与线粒体参数(例如COX活性:第页=0.204,带NRF-1,第页=0.324,NRF-2α,第页=−0.022(mtTFA)。当合并对照组和CHF组时,我们再次发现PGC-1αmRNA和线粒体参数之间存在显著的正相关(). 有趣的是,如果我们将COX I或COX IV亚单位mRNA的表达与转录因子或PGC-1αmRNA的表达相关联,则仅与PGC-1αmRNA获得显著相关性().
PGC-1αmRNA表达水平与柠檬酸合成酶(CS)、细胞色素酶活性的相关性c(c)氧化酶(COX)、线粒体肌酸激酶(mi-CK)或最大呼吸速率()假手术和CHF大鼠的左心室(LV)、比目鱼肌(SOL)和腓肠肌(GAS)第页相关系数;P(P),统计显著性。
讨论
本研究结果表明:(1)CHF导致心肌和骨骼肌的氧化能力和线粒体酶活性降低。(2) 这伴随着呼吸链复合物IV的核和线粒体编码亚单位的表达同时减少,而线粒体DNA拷贝数没有受损,表明线粒体基因转录而不是复制功能障碍,与核编码线粒体基因表达减少有关。(3) CHF患者心肌和骨骼肌中PGC-1α、NRF-2α和mtTFA基因表达的下调可以解释线粒体基因转录的改变,从而解释呼吸链功能的改变。(4) PGC-1αmRNA水平与COX I或COX IV亚单位mRNA的表达以及线粒体标记物密切相关,表明该因子在健康和患病肌肉中可能调节组织特异性氧化能力。
衰竭心肌和骨骼肌的氧化能力
主动脉束带是一种典型的心力衰竭模型(费尔德曼等。1993)这会导致血流动力学和外周改变。尽管心力衰竭的发病机制多种多样,但能量代谢缺陷与疾病进展有关(英格沃尔1993;泽加等。2000;雷曼和凯利,2002年;文丘里管夹持器等。2002). 蛋白质组学分析表明,CHF中改变的许多心脏蛋白与能量代谢有关(海因克等。1999). 在犬和大鼠心力衰竭模型中,心脏和骨骼肌的呼吸链复合体显著减少(艾德等。2001;马林·加西亚等。2001). 人类衰竭心肌中也显示出呼吸复合体I功能障碍(朔伊贝尔等。2002).
肌肉氧化能力通过测量渗透性纤维中线粒体的呼吸来评估,不受底物、ADP或氧气的限制(萨克斯百货等。1998). 通过测量关键酶的活性来研究线粒体的主要途径:CS,一种克雷布斯循环的酶,COX,呼吸链的复合物IV,以及mi-CK,一种参与氧化肌肉中线粒体和细胞溶质之间能量传递的膜间空间酶(文丘里管夹持器等。1998). 我们在这里描述了心脏和腓肠肌线粒体功能和生化标记物的显著降低。比目鱼肌中,只有CS和mi-CK显著降低,表明这种姿势肌对心力衰竭的敏感性较低。目前尚不清楚这是否由线粒体基因表达和/或线粒体复制缺陷引起。CHF的能量代谢缺陷似乎不是由于线粒体DNA含量降低所致。在平息诱导的CHF中也获得了类似的结果(马林·加西亚等。2001)和人类(麻袋等。1996)尽管在心肌梗死后早期的小鼠心力衰竭模型中,这种含量有所下降(艾德等。2001). 这与衰竭心肌中较小线粒体数量的增加相一致,但线粒体总体积没有改变(萨巴赫等。1992).
另一方面,心力衰竭的代谢缺陷更可能是由OXPHOS基因转录紊乱引起的,如核(COX IV)和线粒体编码(COX I)COX亚基基因表达的协同减少所示。参与线粒体基因调控的主要核因子的表达在CHF中显示出显著变化。MtTFA基因在衰竭大鼠肌肉中的表达明显减少,尽管这种减少对比目鱼肌没有意义。MtTFA促进线粒体基因转录和复制。最近发现,mtDNA的复制受到少量mtTFA的刺激,并且在很大的mtTFA浓度范围内保持高度活性,而转录仅在高水平mtTFA下激活(法尔肯伯格等。2002). 这可能解释了线粒体基因转录降低而线粒体基因复制没有改变的原因。NRF-2α的表达,其识别位点已在啮齿类动物mtTFA和线粒体蛋白编码基因上描述(斯卡普拉,2002年)在衰竭的大鼠心肌和快速肌中,NRF-1显著下调,而NRF-1仅在腓肠肌中显著下调。
肥厚期间,心肌底物利用率从脂肪酸转移到葡萄糖氧化,同时FAO酶表达降低(麻袋等。1996). 这种代谢变化与PGC-1α表达下调和PPARα核转录因子失活有关(织女星等。2000;雷曼和凯利,2002年). 因此,由于PGC-1α还通过与NRF的相互作用参与线粒体的生物生成和功能,因此研究其在晚期心力衰竭(主动脉结扎后六个月)的心肌和骨骼肌中的表达很有意义。受CHF影响最大的两块肌肉CHF腓肠肌和心脏中的PGC-1αmRNA显著降低,而比目鱼肌中的PGCαmRNA没有显著降低,这两块肌肉受CHF的影响较小。此外,PGC-1α基因表达与健康和疾病肌肉中COX亚单位基因表达、氧化能力和线粒体标记物呈正相关。综上所述,这些结果表明CHF患者心脏和骨骼肌的氧化能力降低可能最终是由于与PGC-1α、NRFs和mtTFA下调相关的线粒体基因表达减少所致。
目前尚不清楚导致PGC-1α下调和CHF能量代谢降低的信号通路。在从代偿性肥大到衰竭的过程中,激素(肾素-血管紧张素-醛固酮系统、内皮素-1和肾上腺素(肾上腺素))、神经介质(去甲肾上腺素)和细胞因子(白细胞介素和肿瘤坏死因子(TNF))普遍过度激活。在肥大的补偿期未被激活的不同信号通路在随后当补偿机制不堪重负时被刺激(危险品等。2001). 有丝分裂原激活的蛋白激酶以及蛋白激酶Akt或蛋白激酶B(PKB)通路,在肥厚的心脏中没有激活,在心力衰竭中高度激活,与疾病的病因无关(危险品等。2001). 心力衰竭时显著增加的TNFα、血管紧张素II和内皮素-1可能潜在激活Akt通路(Molkentin&Dorn,2001年). Akt组成性活性突变体的心脏特异性表达介导PGC-1αmRNA表达的近三倍下调(厨师等。2002). TNFα过度表达导致心力衰竭,伴有线粒体异常和DNA修复活性受损(锂等。2001)而TNFα被认为在CHF线粒体缺陷中起着促进作用(马林·加西亚等。2001). 这在CHF患者的神经体液激活、PGC-1α表达降低和心肌和骨骼肌生物能量学改变之间提供了可能的联系,需要进一步研究。
健康心肌和骨骼肌的氧化能力
肌肉和心脏线粒体含量可以通过神经元、激素或机械参数来调节。氧化能力的四个标志物(最大呼吸速率、CS、COX和mi-CK)符合不同组织的已知线粒体含量,其等级顺序为:左心室>比目鱼肌>腓肠肌,但决定不同肌肉氧化能力的因素尚不清楚。PGC-1α已被提议为极有可能的候选(雷曼兄弟等。2000;林等。2002). PGC-1α在比目鱼肌中表达非常高,在快速肌肉中表达较低,在含有不同水平PGC-1的转基因品系中,其表达与线粒体标记物的表达成比例(林等。2002). 在心肌中,它被确定为心脏线粒体数量和功能的关键调节器,以响应能量需求(雷曼兄弟等。2000). 目前的结果表明,心肌和骨骼肌的耗氧量、CS和COX活性与PGC-1αmRNA密切相关。Mi-CK,在糖酵解纤维中表达量极低,但在氧化纤维中增加(文丘里管夹持器等。1998;秦等。1999)这些结果扩展了先前的数据,支持了PGC-1α可能调控一组与肌肉氧化能力控制相关的基因的论点。
与PGC-1α相反,NRF-1或NRF-2α的表达与肌肉氧化能力或生化标记物没有线性相关。NRF1和NRF-2αmRNA在心脏和比目鱼肌中的水平相似,而在腓肠肌中的含量只有一半。然而,由于NRF的表达和转录活性可能直接受PGC-1α控制(吴等。1999;斯卡普拉,2002年),PGC-1α介导的NRF转录活性的改变也可能参与心肌和比目鱼肌之间的氧化能力差异。
MtTFA基因的表达也没有严格遵循肌肉氧化能力。事实上,心脏和比目鱼肌的mRNA表达没有差异,尽管心脏的氧化能力高出五倍。然而,最近发现了两种线粒体转录因子TFB1M和TFB2M,它们与线粒体RNA聚合酶和mtTFA共同相关,对线粒体启动子的转录活性都是必需的(法尔肯伯格等。2002). PGC-1α能否调节其表达尚待确定。需要进一步研究以确定PGC-1α表达与线粒体含量之间的联系机制。
结论
这项研究表明,CHF期间心脏和骨骼肌线粒体功能降低与线粒体蛋白基因表达改变有关。结果确定了CHF中基因表达下调的几个转录因子,建立了PGC-1α、NRFs、mtTFA的表达与线粒体功能之间的相关性。它们还支持PGC-1α在调节组织特异性线粒体容量方面的可能重要性。CHF线粒体功能和能量转移的改变可能限制钙稳态和肌原纤维功能,并参与心脏泵衰竭和骨骼肌减弱。PGC-1α可能是心力衰竭期间氧化能力的决定因素,这可能揭示了一个新的潜在治疗靶点,以摆脱能量耗尽的心脏的恶性循环。