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神经元。作者手稿；PMC 2009年3月27日发布。
以最终编辑形式发布为：
神经元。2008年3月27日；57(6): 872–882.
doi（操作界面）：10.1016/j.neuron.2008.01.028
预防性维修识别码：PMC2336895型
NIHMSID公司：NIHMS44332标准
PMID：18367088

PICK1在NMDA受体依赖的双向突触可塑性中的重要作用

寺岛明,1,2,三 肯尼思·佩尔基,1,4 乔·乔尔·拉,2 Young Ho Suh公司,5 凯瑟琳·罗氏,5 格雷厄姆·柯林里奇,三 克里斯·麦克拜恩（Chris J.McBain）,4和约翰·T·R·艾萨克2,三，*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

总结

PICK1是一种钙敏感的PDZ域蛋白，与GluR2和GluR3 AMPA受体（AMPAR）亚单位相互作用并调节其贩运。尽管PICK1主要与长期抑郁（LTD）有关，但PICK1在CA1锥体神经元中的过度表达会导致AMPAR介导的传递的CaMK和PKC依赖性增强，以及突触GluR2标记AMPAR的增加，这些机制与NMDA受体依赖性长时程增强（LTP）有关。在这里，我们直接测试了PICK1是否参与海马NMDAR依赖性LTP和LTD。我们表明，PICK1增强AMPAR介导的传递是NMDAR相关的，并完全阻断LTP。相反，阻止PICK1-PDZ交互或缺少PICK1会阻止LTP。这些观察结果证明了PICK1在LTP中的重要作用。此外，PICK1的缺失或PICK1 PDZ结合的阻断阻止了NMDAR依赖性LTD。因此，PICK2在海马双向NMDAR依存性长期突触可塑性中起着关键作用。

引言

谷氨酸能传递的活性依赖性可塑性的一个主要细胞机制是通过AMPAR亚基和一系列突触后支架分子之间的协调蛋白-蛋白质相互作用调节AMPAR的运输(Bredt和Nicoll，2003年;Collingridge等人，2004年;Groc和Choquet，2006年;马利诺和马伦卡，2002年). 一类重要的相互作用涉及PDZ结构域蛋白、GRIP（谷氨酸受体相互作用蛋白）、ABP（AMPA受体结合蛋白）和PICK1（与C激酶1相互作用的蛋白），它们结合GluR2和GluR3亚基的极端C末端来调节AMPAR的运输和突触传递(Collingridge等人，2004年;Dev等人，1999年;Dong等人，1997年;Srivastava等人，1998年;Xia等人，1999年). PICK1是一种很好的候选突触AMPAR运输的潜在双向调节因子(Dev和Henley，2006年;Sossa等人，2006年). PICK1包含单个PDZ结构域，该结构域与包括GluR2/3亚单位、PKCα和mGluR7在内的多种蛋白质相互作用(Boudin等人，2000年;Dev等人，2000年;Dev等人，1999年;Staudinger等人，1995年;Xia等人，1999年). 此外，PICK1可以通过卷曲-线圈/BAR结构域二聚化，使二聚体PICK1在多蛋白复合物中连接其他蛋白质，如PKC和GluR2(Chung等人，2000年;Perez等人，2001年). PICK1还与SNARE依赖型膜融合机的部件相互作用(Hanley等人，2002年)以及通过其线圈线圈/BAR域与GRIP和膜脂质配合，以协调依赖PKC的AMPAR贩运(Jin等人，2006年;Lu和Ziff，2005年). 最有趣的是，PICK1对GluR2的亲和力表现出钙敏感性(Hanley和Henley，2005年)可能允许PICK1作为钙传感器，在LTP和LTD期间协调AMPAR贩运事件(Sossa等人，2006年).

PICK1是中枢神经系统不同区域多种形式的突触可塑性所必需的(Isaac等人，2007年). PICK1最明确的作用之一是在小脑内平行纤维Purkinje细胞突触的mGluR-dependent LTD中，其表达需要GluR2-PICK1相互作用以实现PKC-dependive AMPAR内化(Chung等人，2003年;斯坦伯格等人，2006年;Xia等人，2000年). 同样在小脑中，在平行的纤维星状细胞突触处，PICK1-GluR2相互作用以另一种形式的LTD介导GluR2-lacking的活性依赖性开关(Gardner等人，2005年;Liu和Cull-Candy，2005年;Liu和Cull-Candy，2000年). 在腹侧被盖区LTD期间，还观察到GluR2 AMPAR亚基组成中类似的PICK1依赖性开关(Bellone和Luscher，2005年;Bellone和Luscher，2006年).

与PICK1在小脑可塑性中的既定作用相反，PICK1对海马可塑性的作用尚不清楚。初步研究表明，PICK1降低培养海马神经元表面GluR2水平，这与海马LTD的潜在作用一致(Chung等人，2000年;Perez等人，2001年). 然而，随后使用阻断PICK1 PDZ结构域相互作用的肽急性输注到CA1锥体神经元的研究是不确定的，产生了相互矛盾的结果。一项研究支持PICK1在NMDAR依赖性海马LTD中的作用(Kim等人，2001年)而其他工作发现PICK1在这种LTD形式中没有作用(Daw等人，2000年;Duprat等人，2003年). 此外，PICK1在CA1锥体神经元中的过度表达不会导致LTD，而是导致突触增强。这是因为PICK1的表达导致从突触中去除含GluR2的不透钙AMPAR，并将其替换为具有较高单通道电导的GluR2标记的透钙AMPA(Terashima等人，2004年). 有趣的是，在NMDAR依赖性LTP的CA1突触中观察到类似的GluR2标记AMPAR掺入(Plant等人，2006年). 此外，PICK1介导的突触强度增强需要PKC和CaMK(Terashima等人，2004年)，进一步与LTP机制相关(Malenka和Nicoll，1999年;Wikstrom等人，2003年). 这些观察结果共同提高了PICK1也参与海马LTP的可能性。因此，PICK1-GluR2相互作用可能广泛用于调节突触处AMPAR的GluR2含量，从而调节其主要生物物理特性，从而实现对突触效能的双向控制。此外，AMPAR亚单位组成的PICK1依赖性调节可能是几种显著但看似不同的长期突触可塑性形式的表达机制。

在这里，我们通过研究PICK1功能的获得或丧失如何影响海马NMDAR依赖性LTP和LTD，直接测试PICK1是否参与NMDAR相关的双向可塑性。我们表明，PICK1诱导的突触强度增加(Terashima等人，2004年)依赖于NMDAR，并屏蔽了后续LTP。此外，通过shRNA-介导的PICK1敲低或表达一种抑制PICK1-PDZ相互作用的肽pep2-EVKI，导致PICK1功能的急性丧失，可以预防LTP。此外，PICK1KO小鼠的切片中没有海马LTP。此外，我们发现缺乏PICK1或PICK1-PDZ结构域相互作用受阻的神经元中有LTD丢失。总之，这些发现证明了海马NMDAR依赖性双向可塑性对PICK1的核心需求，并表明PICK1在CA1锥体神经元GluR2亚单位AMPAR组成的活动依赖性调节中的作用。

结果

PICK1过度表达导致NMDAR依赖的传输增强，从而阻断LTP

CA1锥体神经元中PICK1的过度表达增强了AMPAR介导的突触传递，并在需要PKC和CaMK的机制中导致突触上GluR2标记的AMPAR的表达(Terashima等人，2004年). 因为活动诱导的LTP表现出类似的要求(Malenka和Nicoll，1999年;Plant等人，2006年;Wikstrom等人，2003年)，我们通过研究PICK1过度表达的影响是否也依赖于NMDAR激活，这是LTP诱导的另一个关键要求，进一步探讨了PICK1依赖性增强与LTP之间的联系(布利斯和柯林里奇，1993年;Collingridge等人，1983年;Malenka和Nicoll，1999年). 我们使用Sindbis病毒在培养1–2天的急性海马脑片CA1锥体神经元中双向表达PICK1和GFP，并比较了AMPA和NMDAR介导的邻近感染和对照（未感染）神经元的突触传递(图1A). 如前所述(Terashima等人，2004年)PICK1的病毒表达使CA1锥体神经元中AMPAR介导的EPSCs的振幅增加，内向整流的增加表明GluR2标记的AMPAR的表达(图1B). 然而，在病毒感染期间与D-AP5（100µM）孵育可阻止这些PICK1驱动的AMPAR功能变化(图1C). 因此，病毒过度表达PICK1期间切片中的NMDAR激活是增强AMPAR介导的突触传递和改变GluR2亚单位组成所必需的。

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PICK1过度表达导致AMPAR介导的EPSC中NMDAR依赖性增加。（A） 感染Sindbis病毒的急性培养海马切片中CA1锥体神经元的荧光图像，表达GFP（左）和实验方法的示意图（右）显示了相邻感染和未感染（对照）神经元的序列记录。（B） AMPAR介导PICK1过表达和邻近未感染对照神经元的EPSC振幅和校正指数（n=13）。（C） 病毒感染期间，在100µM D-AP5中孵育的切片中，AMPAR介导的EPSC振幅（PICK1过度表达和切片控制神经元之间的比较，相同的刺激位置和强度）和校正指数（n=11）。

接下来，我们研究了病毒过表达PICK1或阻断PICK1-PDZ结构域相互作用是否会影响CA1锥体神经元中的LTP。首先，我们研究了PICK1过度表达引起的AMPAR介导的传递增强是否阻断了LTP。在急性培养1-2天的海马脑片中，病毒过度表达PICK1可阻止LTP(图2A、D); 然而，在对照组未感染神经元中，相同的配对方案可靠地诱导了LTP(图2B、D). 在这些实验中，与对照神经元相比，PICK1过表达神经元中基线AMPAR介导的EPSCs表现出更大的振幅和更大的内向整流（PICK1过度表达：AMPA:NMDA比率（A:N）=7.2±1.3，整流指数（RI）=5.6±2.0，N=6；未感染对照组：A:N=2.14±0.6，RI=1.7±0.5，N=7；P（P）A:N和RI均<0.05）。

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过度表达PICK1或表达阻断PICK1-GluR2相互作用的肽（pep2-EVKI）可预防LTP。急性培养海马脑片中Sindbis病毒的表达。（A–C）CA1锥体神经元病毒过度表达PICK1（A）、对照未感染神经元（B）和病毒表达pep2-EVKI（C）的神经元的LTP实验示例。（D） 这三种条件下的LTP实验以及单独表达GFP的神经元的汇总数据（PICK1:n=7；未感染：n=18，pep2-EVKI:n=7，GFP：n=7）。黑色条表示LTP配对协议。

PICK1-PDZ域相互作用，包括PICK1-GluR2相互作用，被肽pep2-EVKI（YNVYGIEEVKI）阻断。然而，Pep2-EVKI并不阻断另外两种PDZ结构域蛋白（GRIP和ABP）之间的相互作用，这两种蛋白也结合GluR2&3(Daw等人，2000年;Li等人，1999年). 我们使用病毒表达的pep2-EVKI测试了阻断PICK1-PDZ相互作用是否影响LTP，并发现这种操作也完全阻断了LTP(图2C、D). 病毒表达的神经元中缺乏LTP并不是病毒感染的非特异性效应造成的，因为在交叉对照实验中，仅病毒表达GFP的神经元表现出强大的LTP(图2D). 因此，PICK1过度表达增强了AMPAR介导的传播，这与LTP相阻断，而阻断PICK1-PDZ相互作用可以阻止LTP。

缺乏PICK1的CA1锥体神经元中无LTP

我们的过度表达研究表明，PICK1在海马LTP中起着中心作用，因此预测缺乏PICK1的神经元中不存在LTP。为了验证这一假设，我们首先研究了使用RNA干扰急性敲除PICK1是否会影响LTP。使用慢病毒在培养的海马神经元中表达了几种不同的针对PICK1的短发夹RNA（shRNA）构建体，并用免疫细胞化学方法检测了它们敲低内源性PICK1的有效性。基于这个特性，我们选择了一个shRNA（'T197'），它是最有效的。通过慢病毒表达shRNA和GFP，我们发现T197 PICK1 shRNA在感染7天后将培养海马神经元内源性PICK1表达降低到检测水平以下，而表达扰乱控制shRNA的病毒对PICK1的表达没有影响(图3A). 然后我们比较了这两种病毒对LTP的影响。当培养海马脑片中的CA1锥体神经元感染慢病毒7天(图3B)我们发现，LTP被PICK1 shRNA完全阻断，但在表达对照干扰shRNA的细胞中可靠诱导(图3C-E).

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使用shRNA敲除PICK1可防止LTP。（A） GFP荧光（顶部）和内源性PICK1染色（中间；带覆盖层，底部）的示例，来自感染表达GFP的慢病毒的分离培养海马神经元，并控制扰乱的shRNA（左侧）或PICK1 shRNA（右侧）。比例尺为20µm。（B） 一周培养的海马切片中CA1神经元的双光子荧光图像，表达慢病毒shRNA和GFP，低倍镜（顶部，显示切片中病毒注射的两个位置，标尺为250µm）和高倍镜（底部，顶部图像中方框区域，标尺50µm。（C） 一周培养切片中CA1锥体神经元表达PICK1 shRNA的示例LTP实验的EPSC振幅与时间。插图顶部：示例平均基线和LTP诱导后的EPSC（和叠加）。黑色条表示导入协议。（D） 对于B，但对于表达对照组乱序shRNA的神经元。（E）所有LTP实验的数据汇集在表达PICK1 shRNA（蓝色；n=8）的神经元或表达对照组乱序shRNA（黑色；n=9）的神经元上。

为了证实敲除研究揭示的对PICK1在LTP中的需求，我们接下来确定PICK1敲除（KO）小鼠中是否存在LTP缺陷(Gardner等人，2005年). 我们使用来自PICK1 KOs的急性海马切片中的CA1锥体神经元的全细胞电压钳记录以及在交错实验中来自野生型（WT）同窝出生的切片中的CA1锥体神经元的全细胞电压钳记录对此进行了研究。在WT窝友的切片中，LTP诱导的配对母体产生了稳定的LTP(P（P）<0.01基线vs.配对后20分钟；图4A、C). 然而，相同的配对丙醇在PICK1 KO切片中没有产生持久的增强作用(P（P）=0.26基线vs.配对后20分钟；P（P）配对后20分钟KO vs.WT<0.05；图4B、C). 重要的是，PICK1 KOs中的LTP缺陷似乎不是由基础突触特性的改变引起的，因为在PICK1 KO和WT切片之间没有观察到AMPAR和NMDARs的I-V关系以及AMPA与NMDA的比率的差异(图4D). 因此，PICK1 KO小鼠的LTP缺陷不太可能是由于NMDAR功能的中断，这表明PICK1在NMDAR激活下游发挥作用。

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PICK1基因敲除小鼠切片中配对诱导的LTP缺乏。（A） 使用从WT急性海马切片中的CA1锥体神经元记录的全细胞电压灯进行LTP实验的示例。插图顶部：在字母（A–c；bars 100 pA/50 ms）指示的时间点进行的记录。（B） 在PICK1 KO切片中的CA1锥体神经元中的LTP实验示例（对于a；条100 pA/50 ms）。（C） 所有全细胞LTP实验的汇总数据（PICK1 KO:n=6只动物的20个细胞；WT同窝伙伴：n=4只动物的16个细胞）。（D） 来自PICK1 KOs（n=4）和WT（n=7）的EPSC的I-V分析，较低插入：来自相同细胞的AMPAR:NMDAR EPSC比率（bar 100 pA/20 ms）。

尽管PICK1 KO动物的切片中缺乏LTP，但在许多记录中观察到大量的短暂配对后增强(图4B、C). 这种增强的持续时间与我们在LTP表达期间报告的GluR2标记的内向整流AMPAR瞬时掺入的持续时间相似(Plant等人，2006年). 因此，在PICK1 KO动物切片的LTP实验子集中，我们分析了瞬态增强期间AMPAR整流的变化。有趣的是，瞬时增强与EPSCs中AMPAR介导成分的校正增加相关，该校正是在保持电位为-60 mV和+40mV时获得的EPSCs初始斜率的比率（配对后3-5分钟RI=基线的172±20%，P（P）<0.01，n=5；配对后15–20分钟RI=130±20%，P（P）=0.33，n=5）。AMPAR介导的EPSCs向内整流的这种变化取决于细胞内精胺的存在，因为在使用缺乏精胺的全细胞溶液的交叉实验中，在瞬时增强期间未观察到整流的变化（配对后3–5分钟RI=基线的105±11%，n=4；P（P）<0.05精胺（与无精胺相比）。这些发现与在PICK1 KO中LTP诱导后GluR2标记AMPAR的初始掺入一致，后者负责瞬时增强。此外，未能保持这种增强作用表明，PICK1 KO中的LTP缺失可能部分是由于无法巩固初始增强作用，因为GluR2受体取代最初插入的GluR2标记AMPAR的机制被破坏。值得注意的是，在这些全细胞实验中观察到的瞬态增强并不是由于突触前诱导后增强（即强直后增强或短期增强）(Lauri等人，2007年)，因为我们在PICK1 KO中观察到的瞬时增强发生在诱导过程中突触前刺激率没有显著变化的情况下，并且与AMPAR介导的EPSC向内整流的突触后变化有关。

不同的诱导协议可能会对LTP有不同的信令要求；因此，我们还利用海马脑片的双向细胞外场电位记录，检查了破伤风诱导的PICK1KO小鼠LTP是否存在缺陷。在一个稳定的基线期后，高频刺激方案（HFS；两个100 Hz，1 s破伤风，间隔20 s）在PICK1 KO小鼠的切片中没有产生显著的长期增强作用（112±10%，n=6；LTP途径：基线vs.破伤风刺激后30 min，P（P）=0.16，n=6只动物；强直刺激30分钟后控制通路与LTP通路的比较，P（P）=0.17，n=6只动物；图5A、B). 相反，同样的HFS协议应用于WT窝友对照切片，在交叉实验中表现出稳健的LTP（177±10%，n=6；LTP途径：基线vs.强直刺激后30分钟，P（P）<0.01，n=6只动物；强直刺激30分钟后控制通路与LTP通路的比较，P（P）<0.01，n=6只动物；图5C、D)HFS后30分钟，WT动物切片中测得的增强水平显著高于PICK1 KO切片中的增强水平（WT vs.PICK1 KO：P（P）< 0.05). 这些发现进一步证实了PICK1缺失导致LTP缺失，揭示了NMDAR相关LTP中对PICK1的需求。此外，全细胞和场电位记录实验中的LTP缺陷表明，PICK1在LTP中的作用并不局限于单一的特定记录条件或诱导协议。

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使用细胞外场电位记录的PICK1 KO动物切片中LTP缺乏。（A） PICK1 KO切片中CA1区域的双向场电位实验示例。插入顶部：在字母（a，b）指示的时间拍摄的fEPSP记录道，比例尺=0.2 mV/5 ms。对于此面板和后续面板，箭头表示LTP感应（两个，1s，100 Hz tetani，测试强度，相隔20秒），开放符号表示控制路径，闭合符号表示LTP路径。（B） PICK1 KO切片中所有细胞外场电位LTP实验的汇总数据（n=6只动物，均与WT产仔交配，如C、D所示）。（C，D）LTP实验，取自WT窝友切片的交叉实验（n=6只动物；A，B）。

海马NMDAR依赖型LTD需要PICK1

有充分证据表明，PICK1通过介导含GluR2的AMPAR的内化在mGluR依赖性小脑LTD中发挥中心作用(Steinberg等人，2006年;Xia等人，2000年). 然而，尚不清楚PICK1是否在NMDAR依赖性LTD中发挥作用，NMDAR依存性LTD是海马中LTD的一种显著形式，在新皮质的许多区域也表达(杜德克和贝尔，1992年;坎普和巴希尔，2001年;马伦卡和熊，2004年;Mulkey和Malenka，1992年). 因此，我们直接测试了PICK1是否参与海马NMDAR依赖性LTD。在CA1锥体神经元的全细胞记录中，我们首先使用低频配对诱导协议（LFP；1Hz 300次刺激，保持电位为−40 mV），比较了PICK1KO和WT室友脑片中的LTD，这有力地触发了NMDAR-dependent LTD(Hjelmstad等人，1997年;Luthi等人，1999年). 在PICK1 KO小鼠切片中，LTD不存在(图6A; LTD路径基线vs.配对后30分钟，P（P）=0.88），而在WT窝友的切片中，LTD很容易被相同的LFP方案诱导(图6B; LTD路径基线vs.配对后30分钟，P（P）< 0.0005; 配对PICK1 KO与WT后30分钟，LTD路径，P（P）< 0.001). 为了证实PICK1缺失导致LTD缺陷，我们接下来确定LTD是否受到PICK1急性敲除的影响，方法是使用慢病毒介导的shRNA表达来敲除培养一周的海马脑片CA1锥体细胞中的PICK1。与我们对PICK1 KO小鼠的研究结果一致，使用PICK1 shRNA敲除PICK1的神经元未能显示LFP诱导的LTD(图6C)而表达控制混乱shRNA的神经元表现出强大的LTD(图6D). 最后，我们利用Sindbis病毒介导的急性切片培养中的表达，研究了PICK1 PDZ域相互作用阻断肽pep2-EVKI的病毒表达是否也能防止LTD(图6E)而对照组未感染神经元可靠地产生了稳健的LTD(图6F). 因此，使用三种独立的功能丧失方法，我们表明海马NMDAR依赖性LTD需要PICK1。

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Hippocampal LTD需要PICK1。（A） 来自PICK1 KO急性海马脑片CA1锥体神经元的双通道全细胞LTD实验的EPSC振幅与时间的汇集数据（n=7只动物，均与B所示的WT幼崽脑片实验交错）。对于此和面板B，插入顶部是基准和LTD诱导后控制（开放符号）和LTD（闭合符号）路径的EPSC平均值示例。黑色条表示LTD感应协议。（B） 将LTD实验的数据汇集在WT切片中（n=7只动物，与A中的数据交错）。（C） 在培养1周的海马脑片中病毒性表达PICK1 shRNA的CA1锥体神经元的全细胞LTD实验的EPSC振幅与时间的汇集数据（n=8）。（D） 在培养1周的海马脑片（n=8）中，CA1锥体神经元病毒性表达对照扰乱shRNA，对全细胞LTD实验的EPSC振幅与时间的汇集数据。（E） 急性培养海马脑片中病毒表达pep2-EVKI的CA1锥体神经元的全细胞LTD实验EPSC振幅与时间的汇集数据（n=5）。（F） 急性培养海马脑片中对照未感染CA1锥体神经元的全细胞LTD实验EPSC振幅与时间的汇集数据（n=5）。

讨论

在这里，我们显示了海马NMDAR依赖性LTP和LTD对PICK1的关键需求。我们发现，增强AMPAR介导的突触传递以及PICK1过度表达引起的GluR2 AMPAR亚单位组成的变化需要NMDAR活性并阻断随后的LTP。阻断PICK1-PDZ相互作用可以阻止LTP和LTD，并且缺乏PICK1的CA1锥体神经元缺乏这两种形式的突触可塑性。因此，我们证明PICK1是海马NMDAR依赖性LTP和LTD所必需的，这是海马和新皮质长期突触可塑性的显著形式，与学习记忆、发育和疾病密切相关。

对于PICK1缺失研究，我们使用了两种不同的方法，shRNA-介导的PICK1敲除和基因敲除。最近的一项研究表明，shRNA可以对突触功能产生脱靶效应，这种效应取决于所使用的shRNA的种类，但与被敲除的蛋白质无关(Alvarez等人，2006年). 因此，shRNA和KO模型中均缺乏LTP和LTD，这提供了重要的补充结果，确立了PICK1在双向NMDAR依赖性长期突触可塑性中的需求。此外，这两种方法的类似发现缓解了人们对长期缺乏PICK1的小鼠的发育缺陷或培养切片中严重缺乏PICK的神经元的培养伪影导致的可塑性缺陷的担忧。

PICK1在LTP中的作用

我们的研究直接证明了PICK1在海马LTP机制中的核心需求。我们发现，PICK1过度表达以NMDAR依赖的方式增强了LTP的传播，而阻断或删除PICK1可以阻止LTP。总之，这些发现表明PICK1是LTP的关键介导者，而不是间接调节途径的参与者。PICK1在海马LTP中的机制作用尚待充分阐明；然而，我们的结果结合以往的研究提供了一些见解。我们之前的工作表明，PICK1可以调节AMPAR的GluR2亚单位组成，并且在LTP期间AMPAR中的GluR2含量会发生变化(Terashima等人，2004年;Plant等人，2006年). 我们目前的研究结果表明，PICK1被敲除或PICK1-PDZ结构域相互作用被肽表达阻断的神经元中缺乏LTP，提示PICK1在LTP的诱导或初始表达中发挥作用。在这方面的一种可能性是，PICK1作用于保留含GluR2的AMPAR，以使GluR2标记的AMPARs的初始掺入成为LTP表达最早阶段的基础(Plant等人，2006年). 最近有证据表明PICK1在维持含有GluR2的AMPAR的细胞内池中具有这种保留作用(Ho等人，2007年;Jin等人，2006年;Lin和Huganir，2007年)并可能通过额外的新型PICK1相互作用进行调节(曹等人，2007).

然而，对PICK1 KO的实验表明，在没有PICK1的情况下，LTP表达的初始阶段可能会出现一个成分。在PICK1KO小鼠的切片中，我们发现LTP诱导协议产生瞬时增强。这种瞬时增强的存在可能是敲除部分补偿的结果，因为在PICK1被剧烈敲除的神经元中没有观察到这种现象。PICK1 KO中神经元的瞬时增强与AMPAR介导的EPSC内向整流的增加有关，表明该增强是由GluR2标记的AMPAR所介导的。这一发现表明，在LTP表达过程中，PICK1在LTP中可能发挥额外的作用，介导从缺乏GluR2到含有GluR2的AMPAR的转换。这一作用与先前提出的观点一致，即PICK1调节含GluR2的AMPAR向海马突触的募集(Daw等人，2000年). 此外，这种机制与小脑星状细胞可塑性表达的机制类似，其中PICK1是GluR2标记AMPARs向GluR2标记AMPAR活性和钙依赖性转换所必需的(Gardner等人，2005年;刘和卡尔·坎迪，2002年;Liu和Cull-Candy，2005年;Liu和Cull-Candy，2000年).

一个相关的有趣问题是，当表达涉及AMPAR亚单位组成从GluR2-标记到GluR2受体的变化时，LTP期间突触增强如何保持恒定。由于与含有GluR2的对应物相比，GluR2标记的AMPAR具有更高的单通道电导(Isaac等人2007年)，含GluR2的GluR2与GluR2标记受体的简单一对一交换将导致LTP表达期间的增强减弱。对于由诸如配对之类的协议诱导的LTP，其不包括刺激频率的显著变化（这可能导致短暂的突触前增强），通常观察到LTP的很少或没有减少（例如，如本数据所示）。这表明，在LTP表达期间，必须用更多含GluR2的AMPAR取代GluR2标记的AMPARs，以维持突触强度的增加。这个想法主张增加突触强度的动态平衡，而不是在LTP期间为突触处的AMPAR创建一组“插槽”。

目前关于中枢突触活动依赖性增强的一个著名理论认为，最初招募含GluR1的AMPAR，随后用含GluR2的AMPARs替换(Hayashi等人，2000年;马利诺和马伦卡，2002年;Shi等人，2001年). 我们目前的研究结果与此模型一致，在该模型中，含有GluR1的AMPAR将是最初在LTP期间并入的GluR1-同源体，然后以依赖PICK1的方式被GluR1/2杂合物取代。这一序列为发现的结果提供了解决方案，即CaMKII对LTP至关重要(Malenka和Nicoll，1999年)并调节GluR1同源体，但不能调节含GluR2的AMPAR(Oh and Derkach，2005年). 此外，最近的研究表明，Kalirin-7和cGKII选择性地与GuR1相互作用并参与LTP(Serulle等人，2007年;谢等人，2007)为GluR2-标记受体提供潜在的特异性伴侣。因此，我们关于PICK1在LTP中的作用以及AMPARs中GluR2含量的调节的研究结果与LTP表达机制的现有模型相一致，并在现有模型的基础上进行了扩展。全面阐明PICK1参与LTP的诱导和表达机制，对于理解GluR2标记的AMPAR在突触可塑性过程中是如何调节的具有重要意义，也可能为研究疾病中GluR2标记AMPAR的病理调节提供机制上的见解(Cull Candy等人，2006年).

在本研究中，我们证明了PICK1在两个三周大的动物海马脑片LTP中的作用；然而，某些形式的LTP可能不需要PICK1，例如，由不同的协议或在不同的发展阶段诱导的LTP。越来越多的证据表明，多种形式的LTP共存，这些LTP可由不同的活动模式或不同的发展阶段诱发(Palmer等人，2004年). 例如，GluR1（GluRA）基因敲除小鼠缺乏由典型破伤风或低频配对协议诱导的成年海马LTP(Zamanillo等人，1999年)，但显示LTP遵循θ突发配对协议(Hoffman等人，2002年). 此外，GluR1基因敲除在幼鼠中表现出LTP，尽管其大小有所减小(Jensen等人，2003年). 因此，就GluR1的需求而言，开发和诱导协议会影响用于LTP的表达机制。有趣的是，在GluR1基因敲除中，θ突发配对诱导的LTP表现出延迟的增强时间过程(霍夫曼等人，2002年)这表明GluR1在最初的表达中起着显著的作用，与LTP早期条件突触中GluR1-同源体的短暂掺入相一致(Plant等人，2006年). 与本研究特别相关的是最近的研究结果表明，LTP可以在不改变GluR2 AMPAR亚基组成的情况下表达(Adesnik和Nicoll，2007年;格雷等人，2007年)或者GluR2含量增加（而不是减少）(Bagal等人，2005年). 然而，其他工作证明了在LTP期间纳入GluR2标记AMPAR的作用(Lu等人，2007年;Plant等人，2006年). 此外，先前的研究表明，在相同的诱导条件下，LTP可以通过单通道电导增加或单通道电导率不增加的机制来表达(Benke等人，1998年). LTP表达的这两种不同机制可能反映了一种情况下高电导GluR2标记AMPAR的掺入，而另一种机制中低电导Glu R2标记AMPARs的掺入。因此，综上所述，这些研究表明，LTP可能涉及GluR2标记AMPAR的掺入，但这并不是唯一的表达机制，即使在相同年龄和非常相似的实验条件下也是如此。因此，确定发育和不同的活动模式如何影响LTP表达不同机制的利用具有重要意义。

PICK1在LTD中的作用

有令人信服的证据表明，PICK1在小脑LTD中起中心作用。这种LTD依赖于mGluR1和PKC的激活，表现为表面GluR2相关AMPAR的减少，并涉及一种需要PICK1-GluR2相互作用和GluR2上丝氨酸880的PKC依赖性磷酸化的机制(Chung等人，2003年;伊藤，2002;斯坦伯格等人，2006年;Xia等人，2000年). 相反，PICK1在海马LTD中的作用至今仍存在争议。有充分证据表明PICK1调节培养海马神经元AMPAR的表面表达(Chung等人，2000年;Hanley和Henley，2005年;Perez等人，2001年;Sossa等人，2006年;Terashima等人，2004年); 然而，这些研究并没有直接测试PICK1在海马突触诱导LTD中的作用。事实上，只有两项研究试图直接测试海马LTD对PICK1的需求，这些结果相互矛盾。这两项研究都使用了肽的急性细胞内应用来阻断PICK1-PDZ结构域的相互作用；在一项研究中，这种操纵对LTD没有影响(Daw等人，2000年)在另一项工作中，观察到LTD的部分阻塞(Kim等人，2001年). 然而，主要基于竞争性抑制PICK1-PDZ结构域相互作用的肽的急性输注的功能分析可能难以解释，因为该肽阻断了PICK1-PDZ结构域与所有结合伙伴（GluR2/3、PKC、mGluR7等）的相互作用也可能阻断其他类似PDZ结构域蛋白的相互作用(Sheng和Sala，2001年). 此外，肽块的作用只能在相对较短的时间内观察到，因为可以保持全细胞记录（<2小时），因此无法轻易评估较长时间尺度的作用。因此，本研究首次直接测试了海马LTD对PICK1的需求，即在海马脑片CA1锥体神经元中在较长时间尺度上特异性调控PICK1功能。我们发现PICK1急性敲除或PICK1基因缺失，以及pep2-EVKI的病毒表达，防止海马NMDAR依赖性LTD，这是幼年海马LTD的主要形式(杜德克和贝尔，1992年;Kemp等人，2000年;马伦卡和熊，2004年;Mulkey和Malenka，1992年). 然而，尽管对于LTD来说是必要的，但PICK1并没有模仿或屏蔽LTD（A.Terashima和J.Isaac，未发表的观察结果），这与其模仿LTP的能力形成了对比。值得注意的是，之前的工作中，将pep2 EVKI或类似肽急性注入CA1神经元，导致LTD没有阻断或仅部分减少(Daw等人，2000年;Duprat等人，2003年;Kim等人，2001年). 在本研究中，我们表明，pep2-EVKI的病毒表达可预防LTD。目前与以往研究结果之间的差异可能是由于肽表达的持续时间不同，这表明，在急性输液实验中，长时间阻断PICK1-PDZ结构域相互作用具有未观察到的额外作用。

PICK1对突触强度的双向调节

PICK1如何双重参与海马LTP和LTD？最近的工作表明，PICK1在其N末端有一个钙结合域，其占有率双相调节PICK1-GluR2相互作用：游离钙从静止增加到15µM将增加PICK1对GluR2~5倍的亲和力，而游离钙的进一步增加会降低这种相互作用的亲和力(汉利和亨利，2005年). 这种双峰钙敏感性可以使PICK1能够对LTD和LTP的AMPAR转运进行差异调节，因为这两种现象都依赖于细胞内钙的增加，但达到不同的水平。LTD诱导过程中钙的相对较小的升高可能促进PICK1介导的含有GluR2的AMPAR的内化，而与LTP诱导相关的更大更快的钙变化可能会触发细胞内储备池释放含GluR2的AMPAR，最终并入条件突触以维持增强。事实上，先前的研究表明PICK1在介导细胞内AMPAR释放中发挥作用(Daw等人，2000年). 此外，对培养海马神经元的研究支持这样的观点，即PICK1是突触可塑性的钙传感器，因为PICK1的N末端钙结合域是NMDA诱导的AMPAR内化所必需的，AMPAR是培养中的一种LTD形式(汉利和亨利，2005年). 此外，PICK1可以根据NMDAR激活水平不同地调节培养物中AMPAR的表面表达，大量钙升高产生依赖于PICK1的表面AMPAR增加，少量钙升高导致依赖于PICK1的表面AMPAR减少(Hanley和Henley，2005年;Sossa等人，2006年). 综合考虑，证据支持一种模型，即PICK1作为钙传感器，能够将不同的时空钙谱转换为适当的AMPAR转运事件，从而产生突触效能的双向可塑性。

实验程序

构造和病毒

使用的Sindbis病毒如前所述(Terashima等人，2004年). 识别出特异性击倒PICK1的shRNA物种，并将其包装成慢病毒，商业化（美国医药来源，马里兰州弗雷德里克，美国）。此外，还提供了一种干扰shRNA控制慢病毒。shRNA的表达由人类U6启动子驱动，所有病毒也编码GFP作为标记。对于慢病毒感染神经元，病毒浓度为~1×107在112700 g、90 min、4°C条件下超速离心每ml颗粒。免疫细胞化学测试了在培养的分离海马神经元中敲除内源性PICK1表达的效率，如下所示。使用标准技术从E18大鼠制备低密度海马培养物(罗氏和胡加尼尔，1995年). 在DIV 5-7，神经元感染慢病毒，并再培养7天。然后用4%多聚甲醛/4%蔗糖在PBS中固定神经元15分钟，使其渗透，并与10%正常山羊血清孵育1小时。然后用抗PICK1一级抗体（亲和生物试剂）和Alexa 568-共轭（红色）抗兔二级抗体（分子探针）孵育神经元。使用63x油浸物镜在蔡司LSM510共焦显微镜上采集绿色（GFP）和红色（PICK1）通道的图像。以0.4µm的间隔收集了一系列光学切片，并显示了最大投影。免疫细胞化学分析表明，当病毒高水平表达（由高水平GFP荧光测定）至少四天时，T197 shRNA物种（T197）可以有效地敲低海马神经元内源性PICK1，必须在实验分析前七天感染神经元。

急性海马切片培养与病毒感染

对于所有Sindbis病毒表达实验，均使用培养1至2天的海马切片（“急性切片培养”）。如前所述制备切片并培养(Terashima等人，2004年). 简单地说，在改良的细胞外溶液（mM）中，从Wistar大鼠幼鼠（10-12天龄）制备横向海马切片（300µm厚）：4 KCl，26 NaHCO三，1氯化钙2，5 MgSO4，10葡萄糖，5抗坏血酸，248蔗糖，95%O饱和2/5%一氧化碳2在27°C下恢复30–60分钟后，将Sindbis病毒压力喷射到CA1锥体细胞层的一个区域，并将切片置于标准无菌培养基中，并在使用前在35°C下培养20–48小时。

一周切片培养与病毒感染

对于所有突触生理慢病毒shRNA表达实验，使用一周的海马切片培养，因为慢病毒介导的shRNA需要七天才能有效地敲低PICK1的表达。使用McIllwain组织切碎器从P7岁大鼠制备海马切片（350µm厚）。切片后恢复1小时后，将慢病毒压力喷射到CA1细胞体层的一部分，并将切片移植到放置在1 ml MEM（GIBCO编号61100–061）中的膜（Millicell-CM，0.4µm孔径）上，该膜含有2.5 mM谷氨酰胺、30 mM Hepes和5 mM NaHCO三，30毫米d日-葡萄糖，0.5 mM我-抗坏血酸，2mM CaCl2，2.5 mM硫酸镁4，1µg胰岛素和20%马血清(Musleh等人，1997年). 切片在使用前在35°C下培养7天。

电生理学

使用标准技术从CA1锥体神经元进行全细胞斑贴灯记录(Pelkey等人，2005年;Terashima等人，2004年)在2-3周龄小鼠的急性脑片中，或在培养的大鼠海马脑片中。对基因型盲法进行敲除小鼠和WT同窝小鼠的实验。在培养切片中的记录中，被感染的神经元被鉴定为表达GFP的神经元，近距离未感染的神经元用于切片内对照(Terashima等人，2004年). 记录期间的细胞外溶液如下（mM）：125 NaCl，3.25 KCl，1.25 NaHPO4，25氯化钠三，2.5氯化钙2，1.3硫酸镁4（或1.5 mM氯化镁2)，10-15葡萄糖，0.1苦曲霉毒素（或0.005荷包牡丹碱），用95%O饱和2/5%一氧化碳2.

为了从小鼠切片中记录细胞外场电位，将充满细胞外溶液的贴片电极放置在放射层记录场EPSP，并通过电刺激轴突诱发反应放射层频率为0.1Hz。无GABAA类细胞外液中含有受体拮抗剂。监测了两条独立的通路，其中只有一条接受了两个100 Hz，1s tenani（间隔20 s）的LTP诱导方案。

对于急性切片中CA1锥体神经元的全细胞记录，使用以下细胞内溶液（mM）：135 CsMeSO4、8 NaCl、10 HEPES、0.5 EGTA、4 Mg-ATP、0.3 Na-GTP、1–5 QX-314、0.1精胺、pH 7.2、285–290 mOsm。在急性切片LTD实验中，通过电刺激轴突诱发EPSC放射层以0.2 Hz的频率，并在−70 mV的保持电位下记录。通过将300个1 Hz的刺激与−40 mV的维持电位配对，在两条独立路径中的一条诱导LTD。对于急性切片LTP实验，以0.5 Hz的频率在−60 mV的保持电位下诱发EPSC。通过将50–100个刺激以0.5或1 Hz的频率与-10 mV的保持电位配对来诱导LTP。在急性切片LTP实验的子集中，使用了以下成分的细胞内溶液：100 Cs-葡萄糖酸盐、5 CsCl、0.6 EGTA、5 MgCl2，8氯化钠，2 ATP2Na、0.3 GTPNa、40 HEPES、0.1精胺和1 QX-314，pH 7.2–7.3、285–290 mOsm。对于这两种细胞内溶液的LTP实验，也获得了类似的结果，因此将数据合并。

对于急性培养切片中CA1锥体神经元的全细胞记录，使用以下细胞内溶液（mM）：135 CsMeSO4通过电刺激轴突诱发EPSCs，8 NaCl，10 HEPES，0.5 EGTA，4 Mg-ATP，0.3 Na-GTP，1–5 QX-314，0.1精胺，pH 7.2，285–290 mOsm放射层频率为0.2 Hz，保持电位为−70 mV。LTP通过将100个1 Hz的刺激与0 mV的保持电位配对来诱导。LTD通过将300个1 Hz的刺激与−40 mV的保持电位配对来诱导。

对于一周培养切片中CA1锥体神经元的全细胞记录，除了细胞内溶液中含有磷酸钠（0.6 mM）外，使用与急性培养切片相同的溶液，细胞外溶液中Ca浓度2+和镁2+包括4mM和2µM的2-氯腺苷。仅记录到表达高水平GFP的神经元，表明shRNA表达水平较高。通过将3 Hz刺激与0 mV的保持电位配对3分钟来诱导LTP(Boehm等人，2006年)和LTD，通过将300个1 Hz的刺激与−10 mV的保持电位配对(Rial Verde等人，2006年).

使用Axopatch 200B或Multicalmp 700A放大器（Axon Instruments）收集数据，在5 KHz下过滤并在10 KHz下数字化。对EPSC幅值、直流电流、输入电阻和串联电阻进行连续在线监测。如果串联电阻偏差超过20%，则终止记录。

电生理分析

如前所述，在使用病毒过度表达的实验中，估计AMPAR校正的变化(Terashima等人，2004年); 简单地说，在−70 mV的电压下采集了三个平均EPSC（每个平均连续3个EPSC），与在+40 mV的电流下采集的两个平均EPSCs（每个平均持续3个EPSCs）交错。校正指数表示为EPSC−70/EPSC公司+40在病毒表达实验中图1如前所述，在相同的刺激位置和强度下，将感染细胞和相邻未感染细胞的AMPA EPSC在−70 mV的振幅进行比较(Terashima等人，2004年).

用于分析WT和PICK1 KO动物EPSCs的I–V关系(图4D)，使用从EPSC开始到1.4 ms的斜率测量值估计EPSC的AMPA分量。NMDA分量是在EPSC开始后75 ms测量的振幅。AMPA:NMDA比率计算为−60 mV时EPSC的峰值（AMPA）与在+40 mV时EPSC开始后75 ms测量的NMDA分量的振幅之比。对于使用来自PICK1 KOs的全细胞记录的LTP实验子集，平均EPSC（5个单独事件）使用在−60 mV和+40 mV下收集的数据，通过确定在−60mV和+40 mV的保持电位下获得的EPSC的初始斜率（起始到1.4 ms）的比率来测量RIs。配对后3-5分钟内获得的RI值表示为在含精和无精细胞内溶液的基线记录期间配对前获得的对照RI值的百分比。在用于表示目的的图形中，刺激人工制品被截断或减去。使用学生的吨-测试（视情况成对或不成对），P（P）<0.05被认为是显著的。在图中*表示P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.005.

致谢

由Wellcome Trust（A.T.、G.L.C.、J.T.R.I.）、NINDS校内项目（J.T.R.I、K.W.R.）和NICHD校内项目支持（K.A.P.、C.J.M.）。我们非常感谢R.Huganir博士提供PICK1 KO小鼠。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们提供这份手稿的早期版本。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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