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基因组研究。2008年5月；18(5): 780–790.
数字对象标识：10.1101/gr.7301508
预防性维修识别码：PMC2336799型
PMID：18316654

用于相对甲基化的综合高通量阵列（CHARM）

拉斐尔·艾里扎里,1,5 克里斯汀·拉德·阿科斯塔,2 贝尼尔顿·卡瓦略,1 郝武,1 谢里·勃兰登堡,2 杰弗里·A·杰德洛,三，4 博文,2和安德鲁·范伯格2,5
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

本研究最初旨在严格测试高通量阵列DNA甲基化分析的三种主要方法的特异性：（1）MeDIP，或甲基化DNA免疫沉淀，即抗体介导的甲基特异性分离；（2） 通过连接介导PCR富集HpaII微小片段，甲基化DNA差异扩增的一个例子；以及（3）通过McrBC进行分馏，McrBC是一种切割大多数甲基化DNA的酶。在GoldenGate甲基化分析中使用1466个Illumina甲基化探针验证了这些结果，并通过定量甲基化焦磷酸测序分析进一步解决了方法之间的差异。虽然所有三种方法都提供了有用的信息，但每种方法都有很大的局限性，特别是在MeDIP中偏向CpG岛，在HELP中相对不完全覆盖，以及在McrBC中位置不精确。然而，我们发现，采用原始的阵列设计策略，使用平铺阵列和统计程序平均来自相邻基因组位置的信息，可以获得更高的特异性和敏感性，例如，McrBC在90%特异性下的～100%敏感性。我们将这种方法称为“相对甲基化的综合高通量阵列”（CHARM）。虽然这种方法被应用于McrBC分析，但阵列设计和计算算法与分级方法无关，使其成为一种简单、通用、相对便宜的工具，适用于全基因组分析，并且可以在非常高的密度下可靠地分析单个样本，允许对个体进行局部基因组范围的表观遗传识别，而不仅仅是对样本组进行识别。此外，与其他方法不同，CHARM具有高度定量性，在应用于人类疾病研究方面具有显著优势。

甲基组被定义为基因组中DNA甲基化的综合图片，它是从个体基因水平的一个重要转移(范伯格2001). 这种观点的基本原理是，我们对已知基因启动子甲基化的关注受到了太多限制，甲基化的大部分并不是我们所看到的。尽管6年前将“甲基组”一词引入了文献，但DNA甲基化在任何功能元件的理解中取得的进展都是最小的基因组的透视图(Callinan和Feinberg 2006). 具有讽刺意味的是，DNA甲基化从基因与染色质修饰相比，其繁殖方法是众所周知的，DNA甲基化与DNA序列本身有很强的联系，即在CpG二核苷酸上特异编码，所有这些都比染色质修饰等其他类型的表观遗传信息更为重要。

为什么在理解甲基组方面进展甚微？可能有两个主要限制。首先是关于甲基化修饰在疾病中的位置的基本偏见，甚至在组织变异研究中，即主要局限于“CpG岛”，以及检测方法本身的局限性。伯德于1987年提出了CpG岛的概念(Bird等人，1987年)在脊椎动物中，CpG含量高的区域通常不受DNA甲基化的影响，但在癌症中经常被甲基化（有关综述，请参阅埃斯特勒2006). 人们普遍认为，CpG岛甲基化是理解基因组DNA甲基化的最关键目标，尽管以岛为中心的观点正在重新思考(琼斯和巴林2007). 例如，印迹基因差异甲基化区域内绝缘体蛋白CTCF的结合位点出现在约50个核苷酸的短片段中，核心相对保守～20 bp（例如。，Rosa等人，2005年). 因此，DNA甲基化的其他最小单位可能比GC-富集区小，GC含量也不同。专门针对CpG岛的传统DNA甲基化分析方法也可能遗漏对细胞核内DNA拓扑构象和基因调控重要的位点。例如，我们早先确定了不符合CpG岛定义要求但通常甲基化且在染色体末端过度表达的GC-rich区域(Onyango等人，2000年).

理解甲基组速度缓慢的第二个原因是当前技术的严重局限性，影响了当前使用的检测方法的灵敏度、特异性、吞吐量、定量和成本。最常用的方法本身可以分为三类(表1)（1）亚硫酸氢盐DNA测序。这包括亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠将胞嘧啶化学转化为尿嘧啶，然后进行PCR（其中包含T代表U），然后进行DNA测序。在提供单碱基分辨率的同时，成本是所有常用方法中最高的，一个百万碱基的序列数据需要数万美元，其本身包含40384个CpG二核苷酸分析(Eckhardt等人，2006年)因此，目前不适合对多个样本进行全基因组分析。（2） 询问特定单个CpG二核苷酸或扩增子的各种方法。其中包括MethyLight(Eads等人，2000年)、COBRA(熊和莱尔德1997)，亚硫酸氢盐焦磷酸测序(杜邦等人，2004年)和Illumina GoldenGate甲基化分析(Bibikova等人，2006年). 虽然这些方法敏感、特异且相对便宜，但都不适合分析整个基因组，其中包括约2800万个CpG二核苷酸。（3） 基于微阵列的方法。这些方法可以以极低的单位成本查询比其他方法多得多的CpG，因为定价与其他非甲基化阵列方法类似。

表1。

DNA甲基化分析的当前方法

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有四种主要类型的基于微阵列的甲基化分析。（1） 直接杂交到CpG岛阵列。这是最早的方法之一；例如，它被用来提供关于肿瘤类型分类的有价值的数据(Gitan等人，2002年)，它仍然是一个有用的发现工具。然而，它最早的开发人员已经离开了这种方法，因为它需要关于潜在甲基化序列的预设。（2） 甲基化DNA免疫沉淀法（MeDIP），使用抗体分离甲基化DNA，然后与差异标记的总DNA对照物杂交到寡核苷酸阵列(Weber等人，2005年). （3） 使用甲基胞嘧啶敏感酶进行限制性酶消化，然后通过连接介导PCR扩增靶点。该方法的范例是HELP（通过连接介导PCR进行HpaII微小片段富集）分析(Khulan等人，2006年). DNA与MspI（抗DNA甲基化）并行消化，然后通过连接介导的PCR扩增HpaII和MspI产物，并使用单独的荧光色素将其杂交到定制阵列。由于HpaII位点占CpG的8%，这代表了该方法的固定灵敏度极限。或者，限制性内切酶消化的DNA可以直接测序，而不是与微阵列杂交(Allinen等人，2004年)尽管基因组中甲基胞嘧啶敏感性限制位点的数量相对较少，但仍有局限性。（4） 使用McrBC对甲基化DNA进行限制性酶消化，无需PCR，并对阵列进行差异杂交。DNA用McrBC消化，McrBC是一种具有杂乱切割甲基化DNA（识别序列R米C（N）55–103R（右）米C） 切割基因组中一半的甲基化DNA和所有甲基化CpG岛(萨瑟兰等人，1992年). 酶用于大小选定的（1.5–4.0 kb）DNA，以在消化后分离未甲基化（即凝胶纯化的高分子量）DNA，该DNA在高密度阵列上与经过类似处理但未用酶切割的DNA进行相对（双色）杂交。最初的方法是为拟南芥(Lippman等人，2004年)它在消除植物基因组中大量甲基化重复DNA方面具有价值。对于哺乳动物基因组应用，已经应用了一种选择算法来获得被认为代表给定甲基化目标状态的特定阵列探针(Ordway等人，2006年).

尽管所有的微阵列方法都很常用，但它们并没有直接相互比较，我们最初的目标相对温和：直接比较使用相同DNA样本和相同阵列的方法。然而，我们发现基于杂交的甲基化分析普遍存在显著的局限性，这些局限性可以通过新的统计程序和阵列设计算法在很大程度上加以克服。如本文第二部分所述，分馏方法依赖于方法，称为CHARM(c（c）全面的小时igh-贯穿一阵列第页兴高采烈的米乙基化），可检测DNA全基因组甲基化，灵敏度为～100%，特异性为90%。

结果

总体设计

在这里，我们设计了一项研究来比较三种基于阵列的甲基化检测技术，MeDIP作为基于免疫沉淀的方法的示例，McrBC分馏作为限制性内切酶分馏的示例，HELP作为差异甲基胞嘧啶敏感连接介导的PCR的示例。作为我们的测试样本，使用了两对细胞系：HCT116，一种高度甲基化的结直肠癌细胞系，以及DNA甲基转移酶I和3B双敲除细胞系（DKO），甲基化水平相对较低(Rhee等人，2002年). 这些数据还与使用Illumina GoldenGate甲基化分析的直接亚硫酸氢盐甲基化分析进行了比较(Bibikova等人，2006年)466个基因中1466个CpG位点。

对于所有三种分析类型，已经设计了特定于设计的阵列，我们遵循这些设计，这里称为标准阵列。然而，为了能够在相同阵列上进行直接比较，将样本与NimbleGen的Promoter 2阵列杂交，并设计了两个平铺阵列（参见方法），在本文中称为普通阵列。请注意，在MeDIP的情况下，其中一个常用数组与规范数组相同，即Promoter 2数组。由于设计的灵活性，NimbleGen平台在所有情况下都被使用，这些分析系统的发起人也使用了该平台。在每种情况下，采用竞争性杂交方法，按照实验方案中的描述，用Cy3和Cy5对样品进行差异标记，具体来说：（1）对于MeDIP，用Cy5对甲基富集DNA进行标记，用Cy对总DNA进行标记；（2） 对于HELP，HpaII用Cy5扩增，MspI用Cy3扩增；和（3）对于McrBC，甲基被Cy5取代，总被Cy3取代。请注意，McrBC染料waps是按照哺乳动物DNA原始出版物的建议创建的(Ordway等人，2006年). 然而，我们发现染色水的好处并不值得额外花费（参见补充图1），因此此处所示的比较不包括它们。比较实验和阵列的完整列表见表2.

表2。

微阵列特性

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一所代表的基因组区域总数。

b条每个区域的探测数。

c（c）相同探针的总数。

d日基因组区域之间的平均基因组距离，以碱基对表示。

e（电子）区域内探头之间的平均距离；Ogha1是无限的，每个区域只有一个探针。

（f）McrBC、HELP和MeDIP各两个。

克McrBC、HELP和MeDIP各一个。

小时McrBC和MeDIP各一个。

要在测量相同数量的各种策略中进行选择，需要优化灵敏度和特异性。由于特异性可以很容易地以灵敏度为代价来提高，反之亦然，因此需要对两者进行独立评估。我们设计了实验来评估检测甲基化位点的实际情况下的敏感性和特异性。为了适当评估实验变异性如何影响特异性，对每种方法/样本类型对进行了两次技术复制（参见表2). 在两个重复中，甲基化的测量值应该是相同的，并且偏离相等的值是一种精度测量，它直接影响甲基化水平测量的特异性。使用DKO样本也有助于评估特异性。这些提供了许多对该评估有用的非甲基化位点：特异性低的方法更有可能将非甲基化部位称为甲基化位点。由于许多位点被甲基化，HCT116样本允许对敏感性进行全面评估：灵敏度高的方法更可能将甲基化位点称为甲基化位点（真阳性）。使用Illumina GoldenGate分析作为参考，与所有微阵列方法进行比较。

甲基化测量的量化

对于每个微阵列杂交，我们使用原始特征强度来形成对数比率，并用M（M），正如大多数微阵列文献中所做的那样(Allison等人，2006年). 这个M（M）-值的形成使得较大的值代表更多的甲基化证据，例如，对于MeDIP，分子中的免疫沉淀强度和分母中的总DNA强度。请注意，阵列上的每个功能都与一个M（M）-值。然后对每个阵列进行标准化，以便平均生成非甲基化区域M（M）-值为0。方法部分提供了规范化技术的详细信息。Illumina GoldenGate平台将甲基化量化为百分比。然而，原始数据文件报告了与非甲基化和甲基化假等位基因相关的Cy3和Cy5强度，因此，M（M）-价值观是以类似的方式形成的。

请注意M（M）是一个连续变量，因此可以用定量的方法评估甲基化，这在以前基于阵列的甲基化分析中是没有的。这对生物分析至关重要，因为表观遗传信息通常是染色体特异性的，例如印迹基因。此外，DNA甲基化可能具有调节基因表达的阈值效应，例如，在广泛的细胞类型中e-cadherin的阈值为～25%(Reinhold等人，2007年). 请注意，转换M（M）直接进入绝对甲基化的估计并不简单。然而，在本节稍后的部分中，我们将证明，通过简单地使用截止值，我们可以获得具有高灵敏度和特异性的策略。

MeDIP相对不精确

我们首先通过比较来评估每种方法的精确度M（M）-来自复制阵列的值，特别是研究复制阵列之间差异的分布M（M）-值：M（M）1我−M（M）2我哪里我代表一个特征，1和2代表两个重复杂交。原则上，这些值都应该为0，因为M（M）1我和M（M）2我都是相同数量的度量单位。然而，正如预期的那样，由于样品制备和阵列杂交的自然变化，观察到了差异。使用每种方法的标准阵列来研究这些差异，因为每种方法都可能在其标准阵列上进行优化，我们希望看到除了常见阵列之外，每种方法处于最佳状态。

这些差异的标准偏差（SD）是一个有用的总结，它直接关系到M（M）-人们应该从甲基化状态没有差异的样品中获得期望值。对于McrBC，DKO和HCT116样品的标准偏差（SDs）分别为0.20和0.15(表3). 对于HELP方法，两个样品的SD均为0.27。最后，对于DKO和HCT116样品，MeDIP显示出最差的精度，SDs分别为0.55和0.60(表3). 这些结果是针对M（M）-从规范数组中获得的值。精度的图形评估如补充图2所示。

表3。

微阵列方法精度的全球评估

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通过探针计算的重复阵列甲基化测量值之间差异的标准偏差（SD）用于量化精度，数值越低表示精度越高。

McrBC和HELP可以区分DKO和HCT116

通过比较M（M）-HCT116和DKO样品的值，即分别为高度甲基化和高度非甲基化参考样品。因此，预期M（M）-DKO样本的值应主要集中在0，HCT116应转换为大量正值。图1证明MeDIP方法几乎无法区分全球范围内甲基化程度不同的两个细胞系，尽管在个别基因座上可以清楚地看到差异（下文讨论）。McrBC和HELP阵列在全局区分DKO和HCT116样本方面表现更好，而HELP在更大程度上表现更好。

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密度估计（平滑直方图）M（M）-比较DKO（灰色）和HCT116（棕色）样本的值。请注意M（M）分布掩盖了各个站点的差异。

现场特定方法的比较

全球区分样本甲基化的能力远不如在高基因组分辨率下检测甲基化的功能重要。因此，根据我们和其他人的研究，我们将Illumina平台作为参考标准，在单个CpG水平上比较了每种方法的性能(Bibikova等人，2006年;Ladd-Acosta 2007年)以及补充图3所示的本研究数据。对于每种方法/阵列组合，Illumina平台分析的每个CpG与一个CpG相匹配M（M）-从微阵列数据中获得的值。我们现在描述如何为每种方法获得这种映射。对于McrBC方法，我们预测了在每个ACG或GCG切割后产生的基因组片段的开始和结束。这些被称为McrBC段。对于Illumina平台上代表ACG或GCG的每个探针，我们分配了两个部分：在该CG上结束和开始的部分。接下来，对于微阵列上的每个探针，我们确定包含它的McrBC片段。最后，中值M（M）-映射到每个Illumina探针的所有微阵列探针的值被分配为微阵列M（M）-值。根据作者的建议，McrBC标准阵列在21143个位置使用了三到四个重复探针(Ordway等人，2006年). 因此，每个Illumina探针至少使用四个探针。HELP方法使用了类似的方法，除了在CCGG位点发生解理(Khulan等人，2006年). HELP标准阵列在每个HELP段中使用14–15个平铺探针。MeDIP的标准阵列是启动子2阵列，代表12892个启动子区域。我们将这些启动子区域内的每个CpG与该区域内最近的探针进行匹配。然后，我们能够将Illumina探针代表的CpG（包含在启动子区域之一）映射到一个微阵列探针M（M）-值。图2使用分别对应于MeDIP、McrBC、HELP和CHARM阵列上特定CpG的587、57、51和1188 Illumina CpG来演示此比较。所有平台覆盖的CpG集合太小，无法提供有意义的结果，因此我们基于不同数组类型映射的不同集合进行比较。

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方法特异性甲基化测量与参考数据的比较。对于HCT116（棕色）和DKO（灰色）样品，M（M）-根据高通量方法的值绘制M（M）-来自Illumina参考平台的值。为了说明CpG观测值与预期值的比值，在每个探针周围形成了一个500-bp的窗口；该比率（乘以10）显示在每个点的内部。计算回归线，并显示比率<0.6（蓝线）和>0.6（红线）的探针。

HELP和MeDIP的灵敏度在很大程度上取决于CpG含量

图2绘图M（M）-每个微阵列平台的值与相应的M（M）-从Illumina平台获得的值。将HCT116和DKO样本的值合并。为了清楚起见，单位为英寸图2，每种方法的数据均来自一个HCT116和一个DKO阵列。所有其他阵列（即复制品）的结果相似，如补充图4所示。图2通过CpG密度将点分层。在每个微阵列探针周围计算500-bp区域的观察值与预期值之比，如图2（比率用颜色表示，每个点内有一个小数字）。在这个窗口中，我们将CpG的预期数量定义为Cs的比例乘以Gs的比例。观察到的预期比率只是CpG比例除以CpG预期比例。请注意，CpG岛的传统定义要求该比率大于0.6。将探针分为两组：低CpG密度（比值≤0.6）和高CpG浓度（比值>0.6）。每个组都拟合一条回归线（低密度组和高密度组分别用红色和蓝色线表示）。Illumina之间的相关性M（M）-值和微阵列M（M）-值显示在表4。虽然McrBC在高密度组和低密度组中表现出相似的敏感性，但HELP在低CpG密度组中的敏感性高于高CpG浓度组。

表4。

微阵列平台与Illumina GoldenGate参考数据之间的相关性（这些数据是根据图2)

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一微阵列和Illumina之间的相关性范围M（M）-值。范围覆盖所有复制。

b条微阵列和Illumina之间的相关性范围M（M）-观察到的CpG比大于0.6的区域内的探针值。

c（c）微阵列和Illumina之间的相关性范围M（M）-观察到的CpG比小于0.6的区域内的探针值。

当前与分段特征相关的方法存在严重偏差

对于HCT116样本，我们将M（M）-根据段大小从McrBC和HELP规范数组中获得的值，以生成图3A。因为在这个样品中，人们预计会有许多甲基化的CpG，许多是大的M（M）-期望值与分段大小无关。然而，与大碎片和小碎片有关的地层中，大碎片的数量要少得多M（M）-价值观高于中等规模的细分市场。特别注意，HELP方法对与小于300 bp片段相关的CpG没有敏感性。McrBC方法对与大于1500 bp片段相关的CpG不敏感。McrBC和HELP分别在200–600和700–1200 bp的片段中观察到最佳结果。MeDIP的段大小是不可预测的，因此，此方法不包括在本图中。

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DNA片段长度相关偏见。(A类)M（M）-HCT116样本的值由McrBC预测的DNA片段大小分层(左边面板）和帮助(正确的面板）酶消化。(B类)对于这三种方法，每个探针周围都形成了一个500-bp的窗口，计算了CpG的观测值与预期值的比值M（M）-值由这些比率显示。仅包括与McrBC的大小在50到600 bp之间的片段以及HELP的大小在600到1200 bp之间的碎片相关的探针。

我们还评估了这种分层方法对CpG密度的影响。如中所示图2，我们在每个探针的位置周围形成了一个500-bp段，并计算了观测值与预期值的比值。然后根据观察到的与预期的比率对其进行分层(图3B). 正如第一次注意到的图2HELP方法对高CpG密度的灵敏度较低，而MeDIP方法对低CpG浓度的灵敏度低。

基因组加权平滑显著提高了单个CpG准确性的一般限制

图2还表明，在单个CpG水平上，微阵列和Illumina参考测量之间的一致性留下了很大的改进空间。注意，即使是表现最好的基于微阵列的方法McrBC，微阵列中的变异性M（M）-这些值表明，如果使用单个探针级数据或单个段数据，那么这些方法在实践中都没有用处。特别要注意的是M（M）-参考标准（Illumina，虚线垂直线右侧）称为甲基化的CpG值与大多数M（M）-参考标准称为非甲基化值（Illumina，虚线垂直线左侧），即在-0.75和0.75之间Y（Y）-轴。

相邻CpG的甲基化状态往往高度相关(Eckhardt等人，2006年)促使我们引入了一种新的基因组加权平滑甲基化分析策略：考虑到图图3。我们方法的一个新方面是，我们将来自基因组序列的信息与微阵列数据相结合。通过描述实验室协议诱导的每个片段，可以量化相关微阵列数据的效用。然后，该信息用于通过分配权重来调整平滑步骤中使用的平均值。有关我们的新平滑策略的详细信息，请参阅方法部分。为McrBC和HELP方法设计的规范阵列使用多个阵列特征来探测上述McrBC和HELP段的选定子集。规范设计中的这些段不是连续的，因此无法使用这些数组中的数据进行平滑处理。因此，为了实现基因组加权平滑，我们使用每种方法将样本杂交，不仅杂交到它们的标准阵列，而且杂交到表2即Promoter 2和Imprinting数组。图4，A和B，显示了结果M（M）-高度非甲基化区域和高度甲基化区域的值（实际甲基化状态由Illumina参考方法确定）。

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M（M）针对所有三种方法的基因组上的相邻位置绘制的值。这些点是观察到的M（M）-值。这个M（M）-对McrBC和HELP相同预测片段中的探针值进行平均，并在图中分别用橙色和绿色线表示。使用窗口大小为7的运行中位数对数据进行平滑处理，结果显示为黑色曲线。CpG位置在顶部情节。(A类)Illumina平台测定的甲基化缺失片段。(B类)Illumina平台确定的甲基化程度高的片段。Illumina探针和测量的甲基化百分比显示在底部情节。

图4展示了基因组加权平滑的优势。在这个图中，M（M）-数值是根据基因组上的位置绘制的。要点是M（M）-每个探针的观察值。平均值M（M）-相同McrBC和HELP段中探针的值分别用橙色和绿色线表示McrBC与HELP。使用基因组加权平滑（如上所述）获得的结果显示为黑色曲线。注意，对于McrBC和MeDIP方法，probelevel和segment的范围M（M）-与非甲基化相关的值(图4A)和甲基化(图4B)区域重叠；平滑的结果则不然。例如，对于McrBC，段M（M）-非甲基化和甲基化区域的值分别为-0.75至0.5和-0.75至3。对于非甲基化和甲基化区域，从平滑获得的值分别为-0.2至0.25和0.6至2.5。在平滑过程中执行的平均大大降低了噪声，并且平均是局部的，即在小区域中执行的，这一事实允许我们保持区分的能力。补充图5显示了各种其他地区的示例，说明了这种方法的价值。

HELP方法有时在相同的位点上产生矛盾的结果，这些结果在典型设计中不明显，但在普通阵列设计中很容易看到(图4; 补充图5）。这可能解释了与参考方法不一致的原因(图2). 因为HELP段对于中所示的区域较小图4，这是预期的结果，因为图3证明HELP方法对小碎片不敏感。补充图5显示了其他几个示例。

CHARM，用于相对甲基化的综合高通量阵列

基于上述数据，特别是基因组加权平滑和阵列设计的重要性，我们开发了一个新的基于阵列的DNA甲基化分析平台。新方法独立于平台，它结合了新型阵列设计和统计程序的设计，这些程序从相邻基因组位置执行基因组加权平均。下面提供了更多详细信息。

我们的方法的第一个组成部分是一种新的分片阵列，专门设计用于最大化分析CpG的数量。基于上述原因，我们不想限制对CpG群岛的关注。相反，我们能够可靠地检测甲基化状态的CpG检测数量被最大化。例如，由于我们依赖于平滑，因此未对分离的CpG进行分析。对平滑处理中包含的不同探针数量的仔细分析表明，至少需要15个探针强度才能获得有用的结果（未显示数据）。创建阵列的步骤如下：

  1. 我们鉴定了基因组中的所有CpG。丢弃任何300 bp无CpG的区域。
  2. 我们删除了具有多个匹配的探测，包括NimbleGen定义的模糊匹配(http://www.nimblegen.com/products/chip/index.html)到基因组。
  3. 连续探针之间间隙≥300 bp的任何区域被分为两个新区域。
  4. 我们丢弃了任何少于15个探针的区域。
  5. 我们尽可能平铺区域，使用50个35 bp的间隔。还可以通过计算区域内每个探测器的CpG比率，并为比率较高的探测器分配更高的优先级，优先考虑将经济限制为单个阵列。

这种阵列设计将改进任何方法的检测策略，因为它有助于平滑策略和分析更多的CpG。与有问题的片段相关的探针（例如，HELP分析中非常小的片段）可以在分析阶段移除。然而，我们选择McrBC作为该方法的应用，因为它具有先前描述的优越的敏感性和特异性。接下来，还使用CHARM设计和MeDIP分析对样品进行了杂交。我们没有继续使用HELP分析，主要是因为其检测位点数量有限（HpaII依赖性）。

为了检测CHARM方法中的甲基化区域M（M）-如方法部分所述，将值归一化，并如上所述，使用基因组加权平滑处理。图2D显示平滑的M（M）-根据参考绘制的CHARM获得的值M（M）-值。比较图2D具有图2，A–C，演示了CHARM如何极大地改进了使用其他方法获得的结果。

尽管将甲基化状态作为一个连续变量来处理可能是有用的(Rakyan等人，2004年)，单个CpG的状态是强双峰的。因此，除了比较方法之间的定量结果外，还必须确定区分高度甲基化序列和高度非甲基化序列的能力，这是分子生物学中的一个常见问题，例如，在生成受疾病表观遗传调控或改变的候选基因列表时。这种二进制分类也使我们能够构造接收机工作特性（ROC）曲线(图5). ROC曲线将二元分类器系统（甲基化或非甲基化）的灵敏度与（1−特异性）作为判别阈值（值M（M）)变化多样。为此，如果来自Illumina平台的所有探针在该区域中的比例大于90%，则基因组区域被定义为“甲基化”。同样，非甲基化区域被定义为所有探针<10%的区域；100个Illumina探针组满足这些标准。如果平滑M（M）-这些区域中的任何一个区域的值都高于预定阈值，该区域被视为甲基化。考虑了各种阈值，每个阈值定义了ROC曲线中的一个点。使用CHARM后结果大大改善。注意，对于90%的特异性，McrBC敏感性从不使用CHARM的60%提高到使用CHARM时的100%。

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ROC曲线显示了基因组加权平滑的优势。我们考虑了Illumina平台上代表的所有基因区域。为了计算ROC，对高度甲基化和非甲基化区域进行了比较。如果该区域的所有探针在参考Illumina平台上显示甲基化百分比>90%，则该区域被视为真阳性。如果该区域的所有探针报告的百分比<10%，则视为真阴性。要使用窗口大小1从微阵列数据定义阳性M（M）-选择了个值。如果区域内的任何探针强度高于该截止值，则定义为阳性。然后对窗口大小为51的运行中值进行分析，并以相同的方式定义为阳性，只是使用了平滑结果，而不是单个探针强度。显示了McrBC和MeDIP的结果。对于给定的阈值，真阳性率定义为微阵列数据超过该阈值的真阳性区域的百分比。假阳性率的定义与真阴性区的定义相同。

最后，我们注意到，CHARM方法与MeDIP、HELP或非光滑McrBC不同，是高度定量的，这意味着阵列上测量的甲基化与参考甲基化平台（Illumina）之间存在线性关系，如图2。与其他方法相比，CHARM将这两个值进行比较的相关系数明显更好(表4)ROC曲线也是如此(图5).

讨论

总之，这项工作有两个主要结果。首先，我们已经表明，所有三种常用的基于阵列的DNA甲基化分析方法都有很大的局限性。在MeDIP的情况下，该检测具有相对较差的特异性，并且该方法不敏感，尤其是在CpG岛以外。HELP虽然在全球范围内准确区分了明显不同的细胞类型，但由于对HpaII限制位点的依赖性，它并没有涵盖许多CpG二核苷酸，并且通常与参考方法不一致。在这三种方法中，McrBC表现最好，但正如ROC曲线所示，在90%的特异性下，灵敏度仅为60%。其次，由于相邻的CpG已被证明是密切相关的，我们开发了一种新的基因组加权平滑算法来测量原始微阵列数据中的甲基化。将这种新方法与最稳健的甲基化DNA分离方法（McrBC）相结合，我们设计了最适合甲基化检测的定制阵列，如结果部分所定义。这种方法被称为“相对甲基化的综合高通量阵列”（CHARM）。CHARM提供了相对廉价的全基因组高精度和准确度分析的可能性。在NimbleGen HD2阵列上，可以用这种方法研究210万个功能。该方法是数据驱动的，因为它使用了对1466个CpG位点的独立评估。此外，阵列上的基因组覆盖是由基因组序列驱动的，而不是基于对甲基化位点（例如启动子）可能位置的任意假设，这些甲基化位点可能会丢失大量调控序列。即使采用这种无偏见、非促性腺激素驱动的选择策略，87%的Illumina选择的甲基化癌症组1基因仍存在于HD2阵列中。

这些实验表明MeDIP和HELP可能存在哪些固有局限性？使用MeDIP方法获得的结果几乎无法区分HCT116和DKO样品。一个可能的原因是免疫沉淀（IP）步骤不是特定的，即未甲基化的CpG通过IP过滤器。这与检测偏向于非常高的CpG含量的观察结果一致。此外，请注意，无论通过过滤器的段数是多少，IP样品都会被CpG富集。这可能会导致交叉杂交问题，例如，具有更多CpG的探针可能仅因为与高CpG含量样品的交叉杂交而导致更高的强度。在表达阵列中，已经表明，在靶标标称量较低的情况下，背景噪声，如交叉杂交，会大大降低灵敏度(Irizarry等人，2006年). 如果甲基化阵列中也存在同样的现象，那么人们会认为，在具有少量CpG（低靶量）的区域，如MeDIP阵列中所示，灵敏度较低。

虽然HELP方法在全球区分高度甲基化HCT116和相对非甲基化DKO方面优于其他方法，但在单一CpG水平上，HELP方法的表现几乎不优于MeDIP。这一明显矛盾的一个可能解释是，HELP方法取决于扩增片段能力的差异，但PCR步骤并不总是如预期那样扩增。例如，在CpG密集区，预期扩增的较小片段可能太小，PCR无法正常工作。这种现象发生的证据是，HELP的微阵列数据有时在图中出现翻转，例如图4：片段甲基化扩增与预期相反。值得注意的是，HELP的规范设计仔细选择了不太可能发生这种现象的区域。但如前所述，这大大限制了该方法的覆盖范围。已经并且很可能会进一步开发更复杂的后处理算法，以纠正测量误差(Khulan等人，2006年). 然而，即使使用此处所做的最小后处理，也可以获得与参考测量值非常好的一致性，如图2更重要的是，在检测甲基化位点时具有良好的敏感性和特异性，如图5和补充图6。CHARM还绕过了基因组甲基化分析的一个主要问题，即检测CpG含量相对较低区域变化的重要性。如图所示，MeDIP无法检测到这些区域的甲基化。HELP在这些区域的局限性在于，它很可能会漏掉这些区域，并且无法平滑数据以获得高精度，因为根据定义，人们无法观察到相邻段的数据。

McrBC分馏最初用于植物基因组分析(Martienssen等人，2005年)随后用作甲基化CpG岛的发现工具(Ordway等人，2006年)，但它还没有得到普遍使用。最初的全基因组阵列设计代表数千个片段，每个片段有一个探针。在微阵列和其他使用杂交的技术中，不同探针的测量结果之间的差异很大一部分是由于序列效应(Wu和Irizarry 2005). 平均复制探针不会减少这种可变性，因为它们具有相同的序列。因此，重复四次的单个探针提供的数据精度相对较低Ordway等人（2006）McrBC分馏在CpG岛内也在一定程度上受到区分高度甲基化和高度非甲基化序列的能力的影响，尽管它仍然优于仅在CpG岛内工作的MeDIP（补充图6）。

CHARM的未来工作包括开发预处理算法，以纠正序列和分段效应。由此产生的方法应能提高CpG岛内CHARM的性能。最后，我们注意到，虽然CHARM提供了最先进、成本效益高的甲基化分析，每测量约1/20便士，但第二代测序通常会降低阵列的相对效用，尤其是在达到1000美元基因组的目标时。目前，通过第二代测序完成基因组覆盖，例如在亚硫酸氢盐处理后，每个样本的成本将是这个数量的数百倍。另一种方法是分离DNA，然后进行测序，降低目标基因组的复杂性，就像对特定染色质标记所做的那样(Mikkelsen等人，2007年). 这些方法具有相当大的前景，但也提出了一个有趣的问题，即捕获什么。这里显示的数据表明，在捕获策略中必须非常小心，CHARM分析是实现这一目标的重要一步。此外，捕获策略还使用杂交，因此在完整的全基因组测序变得便宜之前，仍然必须处理与杂交相关的偏差。

方法

细胞培养和基因组DNA分离

HCT116细胞（美国型培养物收集）和DNMT1/DNMT3B（DKO）细胞(Rhee等人，2002年)在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的McCoy 5A改良培养基中培养。从HCT116和DKO细胞系中分离出基因组DNA，并使用制造商指定的MasterPure DNA纯化试剂盒（EpiCentre）进行制备。

McrBC分析样品制备

制备基因组DNA（10μg），McrBC消化和凝胶分馏完全按照出版的方法进行(Ordway等人，2006年). 如所示表2使用McrBC制备的HCT116和DKO样品在Ogha1阵列（规范型）、Promoter 2阵列（通用型）、Imprinting阵列（通用）和新型CHARM阵列上进行分析。

HELP分析样品制备

HCT116和DKO样品的制备如前所述Khulan等人（2006年）在John Greally的实验室中，为了避免任何技术处理问题（纽约阿尔伯特·爱因斯坦医学院），每个样品总共使用20μg(Khulan等人，2006年). 如前所述，用Cy3-或Cy5-共轭寡核苷酸和随机引物标记LM-PCR产物(Selzer等人，2005年). 如所示表2使用HpaII和MspI制备的HCT116和DKO样品在HELP启动子阵列（标准）、启动子2阵列（通用）和印迹阵列（通用的）上进行分析。

MeDIP分析样品制备

MeDIP分析是根据公布的方法进行的(Weber等人，2005年). 如所示表2使用MeDIP制备的HCT116和DKO样品在Promoter 2阵列（标准）、Imprinting阵列（通用）和CHARM（通用）阵列上进行分析。作为阳性对照，使用Sat2的实时PCR验证MeDIP(Jiang等人，2004年).

Illumina GoldenGate分析样品制备

通过使用EZ DNA甲基化金试剂盒（Zymo Research）实现了500 ng基因组DNA的亚硫酸氢盐转化。所有HCT116和DKO样本均按照之前在Illumina GoldenGate甲基化癌症小组I中所述进行处理(Bibikova等人，2006年). 据报告，β值为0–1.0表示每个CpG位点的甲基化百分比，分别为0%至100%。β值是通过使用阵列上的阴性对照减去背景，并取甲基化信号强度与甲基化和非甲基化信号之和的比值来计算的。

使用焦磷酸测序进行定量甲基化分析

根据制造商的建议，使用EpiTect试剂盒（Qiagen）处理一微克基因组DNA的亚硫酸氢盐。亚硫酸氢盐处理基因组DNA导致非甲基化胞嘧啶核苷酸变为胸腺嘧啶，而甲基化胞苷保持不变。这种差异被检测为每个CpG位点的C/T核苷酸多态性。

设计CpG无偏引物，PCR扩增三个基因中的38、16和14个CpG位点，HLA-F、KCNK4、，和HLTF公司（以前称为SMARCA3型)，显示MeDIP、McrBC和Illumina分析的甲基化相互冲突（补充表1）。在标准条件下进行巢式PCR。根据制造商（Biotage）的规定，在PSQ HS 96热测序仪上分析扩增子，并使用Pyro Q-CpG软件对CpG位点进行定量，甲基化程度从0%到100%。

微阵列设计

奥加1是McrBC方法的标准数组：21143个McrBC段由每个探针表示。每个探针使用三到四个复制。这些片段的位置由设计者根据转录起始位点和CpG岛选择，如他们的论文所述(Ordway等人，2006年). HELP启动子数组是HELP方法的标准数组。Promoter 2阵列是NimbleGen的非现成产品之一，有12892个启动子区域。印迹拼接阵列代表了我们小组选择的23个研究印迹基因的区域。区域大小从133475 bp到13096022 bp不等，大小为50 bp的探针之间的间隔为47 bp，偶尔会出现较大跳跃，以避免重复元素。表2提供了这些阵列的摘要。

数据分析

规范化

如上所述，用于量化甲基化的基本测量是在处理和控制通道中观察到的强度的对数比率。现有的统计方法使用未经调整的对数比率，假设线性染料对数尺度效应，并通过简单地减去中位数，在ANOVA模型中拟合并消除这些效应来消除这些效应(克尔和丘吉尔2001). 这些方法无法纠正M（M）与A类地块。在表达式数组中，黄土归一化已被广泛且成功地用于解决此问题(Yang等人，2002年). 这个过程的基本思想是假设大多数探针基因没有表达M（M）=0并且A类-相关偏差是一个光滑函数。使用黄土回归估计并消除偏差。这种方法在表达式数组中取得了成功。然而，因为在甲基化实验中，我们预计许多位点会被甲基化，所以不能再做出这种假设了。如果这里使用了黄土标准化，那么我们定义M（M）=0作为未分解站点的平均值，则会错误地强制M（M）许多与甲基化相关的探针=0。

因此，我们开发了一种不需要假设M（M）对于大多数探针，=0。该方法利用基因组序列信息和我们对片段选择方法的了解来选择我们所称的伪保孔探针，我们可以对其进行假设M（M）= 0. 然后，我们将为表达阵列开发的黄土归一化程序应用于伪保持基因，获得校正曲线，并使用该曲线进行校正M（M）-所有探测的值。这种方法的另一个优点是，它提供了一种灵活的方法，使为表达式数组开发的现有技术适应甲基化数据。本规范化程序的详细信息见Bolstad等人（2003年）.

基因组加权平滑

获得平滑的M（M）-在任何给定的基因组位置，我们平均所有M（M）-与相关位置之间预先指定的距离内的值。使用加权平均值，并根据以下结果确定权重：图3。请注意，过程的这一部分依赖于方法。提供平均值的间隔称为“平滑窗口”，其长度称为“窗口大小”。存在许多平滑算法，每种算法的平均方式不同，例如，分配与距离相关的权重。对于本文给出的结果，运行中值算法(Tukey 1977年;Hardle and Steiger 1995年)由于其简单性和对异常值的鲁棒性，使用了51个探针（~1500bp）的窗口大小。

致谢

这项工作得到了NIH拨款HG003233的支持。我们感谢John Greally和Masako Suzuki执行HELP结扎和扩增步骤，以确保我们没有错误地执行该程序。

脚注

[补充材料可在线获取，网址为网址：www.genome.org.]

文章在印刷前在线发布。文章发布日期为http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.7301508.

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文章来自基因组研究由以下人员提供冷泉港实验室出版社