层粘连蛋白-1的α链是独立分泌的，并驱动其β链和γ链伙伴的分泌

摘要

基底膜是细胞相关的异质聚合物，对组织发育和维护至关重要。这些细胞外基质的功能既有结构功能又有信息功能，基底膜充当基质、过滤器和固相激动剂(1–三). 这些基质的主要成分是层粘连蛋白糖蛋白家族的不同成员，每一个都是由α、β和γ链亚基通过长臂线圈结构域连接而成的异源三聚体(4)，每个都具有共享和独特的功能，每个都有自己的空间和时间表达模式。

了解亚单位链组装和分泌对于理解发育和修复过程中亚型诱导和链转换的调控非常重要。虽然有助于形成线圈的物理化学相互作用的信息(5–10)在体外，对链子组装和分泌的规律知之甚少体内在本研究中，我们开发并应用了一种解剖层粘连蛋白组装和分泌的策略，使我们能够在接近零的背景中选择性地表达所有三个亚单位。我们研究了层粘连蛋白1（α1β1γ1），这是最广泛表征的亚型，其活性依赖于正确的翻译后修饰、亚单位结合和结构域折叠(5,11–14). 我们报告了一个令人惊讶的发现，α链亚单位可以在没有亚单位伙伴的情况下分泌。与之前的模型相比，我们发现即使在某些组合中，双链层粘连蛋白可以组装，但它们也不能分泌。我们还发现α链的表达和组装对于其他亚单位的分泌至关重要。因此，我们提出α链驱动其β和γ链伙伴的分泌，这是一种可能用于调节基底膜形成的机制。

材料和方法

结果

层粘连蛋白单链α链、β链和γ链的表达。

为了研究单个链在没有正常伴侣的情况下的命运，我们选择了一种内源性层粘连蛋白链表达较低的可转染细胞系。在对野生型293细胞的初步评估中，通过SDS/PAGE分析的条件培养基中未检测到分泌的层粘连蛋白，并用考马斯蓝染色或用抗E8抗体在Western blot中染色。抗E4或当我们使用抗E8抗体过度暴露免疫印迹时，只检测到几乎完全局限于细胞组分的内源性层粘连蛋白β链的微量水平。仅α链的表达式（图。​（图11一)克隆细胞（分泌部分）显示出完整的（≈380-kDa）和较小的物种（主要是175和150kDa的）的混合物。对于α-转染细胞，检测到完整大小的α-链带是一个小物种，含有大量的小物种。与细胞组分相比，培养基中含有绝大多数重组蛋白，表明大多数α链蛋白被分泌。通过在N或C末端瞬时表达含有FLAG表位序列的α链，并用FLAG特异性抗体检测蛋白质，分析了α链裂解产物的性质（图。​（图11b条). 对于N末端标记的α链，在≈380，275（α₂₇₅)和175（α₁₇₅)检测到kDa。对于C端FLAGα链，在≈380、175和150 kDa（α₁₅₀)检测到。由于FLAG表位的存在固定了一端的位置，并且由于α1链的预测蛋白质质量与碳水化合物约为380 kDa，因此可以推断，所有三个快速迁移带的裂解位点都位于α链的线圈区域。用编码β链和γ链的cDNA瞬时稳定转染野生型细胞，并在免疫印迹中进行评估（图。​（图11c和数据未显示）。在还原条件下，用抗E8抗体检测显著β和γ物种的表达，分别对应约200 kDa和约190 kDa的预期大小。在细胞瞬时或稳定转染β+γcDNA的情况下，观察到两条紧密迁移的抗E8反应带。无论细胞是否表达层粘连蛋白β、γ或β+γ，所有或几乎所有这些蛋白链都位于细胞内部分。在非还原条件下，β链中不到一半的部分以两倍分子质量的速度迁移较慢，反映出存在一些二硫键二聚体。相反，当γ链单独表达时，没有观察到形成二聚体或二聚体。对于稳定表达β链和γ链的细胞，大多数层粘连蛋白链在非还原条件下以二聚体形式迁移，消耗所有单体γ链物种，但保留一部分单体β链。虽然二聚体可能含有ββ和βγ二聚体的混合物，但单体与二聚体的比例较高，并且没有单体γ链，这表明βγ二聚体比ββ二聚体更受青睐。总的来说，这些数据表明，层粘连蛋白β和γ链，无论是单独表达还是共同表达，都不能分泌，ββ和βγ，而不是γγ，二聚体聚集在细胞间室中。

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图1

293细胞层粘连蛋白单链α链、β链和γ链的表达。用编码小鼠层粘连蛋白β、γ、β+γ的DNA或载体DNA（模拟）转染人293细胞。收集条件培养基（分泌级分，m）和可溶性细胞裂解物（c），并使用抗E8或抗FLAG抗体在还原或非还原（以nr表示的泳道）条件下进行免疫印迹分析。(一)野生型293细胞稳定（α*）和瞬时（α）转染αcDNA。来自克隆转染细胞的培养基显示出完整（箭头）和175-kDa/150-kDa（点）层粘连蛋白-α反应物的混合物。瞬时转染后检测到完整的α链，分泌最多；然而，大多数瞬时表达的蛋白质在175和150kDa时迁移，表明蛋白质水解过程。模拟转染后未检测到层粘连蛋白带。左车道显示了EHS-层粘连蛋白标准（注意，由于碳水化合物的微不均一性，EHS-层面粘连蛋白的β链和γ链未被分解）。(b条)层粘连蛋白α-pCIS经修饰后在N或C端含有FLAG序列，瞬时表达。FLAG（FL）表位反应性的差异强度（所有条带均与抗层粘连蛋白反应，未显示）表明，275-kDa、175-kDa和150-kDa-条带是含有N或C末端的降解产物，并且在线圈-线圈结构域中发生裂解。(c)观察到显著的β链和γ链的细胞表达，而非分泌，以及少量较小（降解）物种。在非还原条件下分析时，检测到β和βγ二聚体，而不是γγ二聚物。

α链与β链和γ链的表达。

确定β链和γ链组装和分泌是否需要α链表达。将α-pCIS转染到野生型、β稳定、γ稳定和βγ稳定克隆中（图。​（图2）。2). 当α链在β细胞中瞬时表达时，α链被检测为分泌产物（培养基），而β链仅在细胞裂解液中检测到（图。​（图22一). α链不能驱动β链的分泌，也没有证据表明链关联。相反，当表达βγ的克隆细胞瞬时转染αDNA时，检测到完整的α链和β/γ链分泌，全链增加，α₁₇₅和α₁₅₀降解产物。当细胞在瞬时条件下同时转染α、β和γ层粘连蛋白cDNA结构时（图。​（图22b条)，鉴定出三条完整的α、β和γ链。在非还原条件下的分析中，检测到与天然二硫稳定三聚层粘连蛋白迁移相对应的条带。然而，在一些转染中，在培养基中只观察到带降解带的α链（未显示）。我们考虑了不同实验的转染效率不同的可能性，在某些情况下，大多数细胞表达所有三条链（组装和分泌），而在其他情况下，不同的细胞表达不同的链（组装失败）。

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图2

α链与β链和γ链的表达。(一)用α-pCIS瞬时转染293个野生型和稳定表达β（β*）或β和γ[（βγ）*]的细胞（箭头指向转染靶细胞），并用抗E8（或如有指示，使用βγ特异试剂）评估重组蛋白的产生。在α/β共表达的情况下，在培养基中检测到α链，而所有的β链都局限于细胞部分。相反，βγ表达细胞的α转染导致所有三条链的分泌，完整α链的比例增加。(b条)野生型293细胞同时瞬时转染α、β和γcDNA。抗E8抗体检测到所有三条链的表达和分泌，几乎没有降解产物，并且分泌的蛋白的一部分迁移到二硫键三聚层粘连蛋白的预期位置。(c和d日)层粘连蛋白γ细胞（γ*）瞬时转染αDNA或与α和βDNA共转染。在还原条件下，当γ链单独表达或仅与α（α→γ*）共表达时，γ链仍保持胞内状态。然而，当α与β链和γ链[（α+β）→γ*）]共存时，在介质中检测到宽β-γ复合物（双箭头）以及完整的α链（单箭头）。同样，无论β和γ是否表达，α链都会分泌；然而，当所有三条链都被表达时，该链基本上是完整的（≈380 kDa），但当仅用γ链表达时，其明显裂解（两个点）。在非还原条件下（nr，d日)，只有当所有三条链都表达时，α链的一部分迁移与三聚体天然EHS-层粘连蛋白相似，表明一些重组链与其伙伴是二硫键。

当α链在γ稳定细胞中瞬时表达时（图。​（图22c)，α链被分泌，而γ链保留在细胞内。没有证据表明形成稳定的αγ二聚体。这里注意到的一个小差异是完整α链的比例增加，可能是由于细胞内γ链的一些保护作用（在稳定的αγ克隆中也观察到）。当稳定的γ克隆细胞与α链和β链cDNA共转染时，检测到三条链的表达。在这种情况下，可以在还原条件下的介质中检测到一条重带，解释为对应于不完全解析的β和γ链物种以及完整的α链。在非还原条件下（图。​（图22d日)除了与二硫键βγ二聚体迁移相对应的抗体反应带外，现在还观察到一条与真正的EHS层粘连蛋白（αβγ）类似的带迁移[也可在EHS对照中看到；位置如所述(19)]和非二硫键二聚体。因此，所有三条链的表达都是组装二硫键三聚体和分泌该三聚体所必需的。此外，一些重组α链与其βγ伙伴是二硫键，一些非二硫键三聚体似乎也已形成。用α+β链转染γ细胞导致裂解的α链显著减少。

表达αγ和αβγmRNA和蛋白的克隆的特征。

我们考虑了内源性人类mRNA/蛋白可能对重组层粘连蛋白的组装和分泌做出重大贡献的可能性，特别是在二链和三链表达的情况下。用含有小鼠cDNA的构建物转染人类细胞，允许使用链和种特异性的RT-PCR引物来证明转染链和任何内源性人类同源物的mRNA表达。选择每个结构的不同区域进行放大（图。​（图3三和数据未显示）。pCIS构建主干的特异引物，包括每个插入cDNA的上游（未显示）和下游，以及插入小鼠cDNA的引物，通过基因组DNA PCR证明了转染细胞中存在该构建物。此外，由于来自集成结构的DNA将提供与逆转录mRNA转录物相同的RT-PCR模板，并且在RNA制剂的任何污染基因组DNA中都有高浓度的表现，将相同的引物组合用作阴性扩增对照，以证明RT-PCR中观察到的产物带并非来自污染的构建DNA。感兴趣的层粘连蛋白cDNA的5′端和3′端也用于扩增。小鼠αβγ转染细胞系的RT-PCR清楚地显示出小鼠α1、β1和γ1 mRNA的产生，而内源性人类α1、γ1或γ1 mRNA水平未检测到。αγ转染的细胞显示出小鼠γ1和α1的产生。然而，内源性层粘连蛋白mRNA的缺失并不完全。当使用每个RT-PCR的总RNA水平高出4倍时，现在可以检测到微量内源性人类β1，特别是一些γ1和可能的α1（数据未显示）。

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图3

表达αγ和αβγ链的细胞的mRNA和蛋白质特征。(一)用总RNA（DNA酶处理）或基因组DNA（D）作为模板，从小鼠α1、β1和γ1 cDNA的ORF（深灰色条）、从延伸到ORF（浅灰色条）的pCIS以及从相应的人类α1、α1和γl链（白色条）制备RT-PCR扩增产物。人类引物扩增了来自人类胎盘RNA的预期产物，而不是来自中期小鼠胚胎RNA。相反，小鼠引物扩增的是来自小鼠RNA而不是来自人类RNA的预期产品（数据未显示）。(b条)293细胞产物在琼脂糖凝胶上电泳以分析重组和内源性链特异性mRNA表达（编码条与图谱匹配；标准为2.0、1.2、0.8、0.4和0.2kb）。pCIS特异性产物表明存在重组DNA，并且RNA没有被这些DNA污染。正如预期的那样，重组小鼠链在αγ和αβγ克隆中表达，而在野生型细胞中没有表达。(c)考马斯蓝染色聚丙烯酰胺凝胶，还原条件，显示来自野生型细胞和稳定表达小鼠层粘连蛋白αγ链和αβγ链的细胞的抗E8的相应免疫印迹。用硫酸铵沉淀培养基中的分泌蛋白，或用抗E4（β1-特异性）抗体、兔IgG对照、抗FLAG（FL）抗体或小鼠IgG控制进行免疫沉淀。EHS层粘连蛋白1（5μg）用作标准。

从转染α1-C-FLAG cDNA或与α+β链cDNA共转染的γ细胞中获得无血清条件培养基，并在双抗生素选择下进一步克隆。通过免疫沉淀和考马斯蓝染色对表达的蛋白质进行表征（图。​（图3三c). 如前所述，对于α-瞬态/γ-稳定细胞，检测到α-γ细胞的α链是培养基中完整和裂解产物的混合物，而γ链仍留在细胞裂解液中。在细胞中检测到γ链，但在条件培养基中未检测到。与之形成鲜明对比的是，三链转染细胞分泌所有三条链。当蛋白从野生型细胞、αγ转染细胞和αβγ转染的细胞调节的培养基中沉淀硫酸铵时，考马斯蓝染色显示，野生型培养基中没有与层粘连蛋白链迁移相对应的条带。相比之下，α带和深色染色更快的迁移带（用图左侧第三泳道附近的点表示）。​图3三c)在αγ细胞条件培养基中观察到。最引人注目的是来自αβγ细胞的培养基，其中检测到显著完整的α、β和γ链。抗E4和抗FLAG抗体的免疫沉淀证实了考马斯蓝染色凝胶中条带的性质。虽然抗E4抗体没有从野生型条件培养基中沉淀蛋白，也没有从αγ细胞培养基中析出次要条带，但它从具有完整α、β和γ迁移的三链转染培养基中共沉淀了三条主要条带。抗-FLAG抗体进一步从αγ细胞中沉淀出完整的α、175-kDa和150-kDa-降解的α带，但未发现β或γ链。相反，αβγ细胞的抗FLAG免疫沉淀物包含对应于迁移到α、β和γ链的主要条带，以及α链降解产物的显著减少量（与αγ细胞相比）。Western免疫印迹（未显示）证实了硫酸铵沉淀和免疫沉淀中链的解释，我们计算出培养基中含有≈1μg/ml重组蛋白。

重组层粘连蛋白α亚单位和重组层粘联蛋白结构的表征。

通过FLAG亲和层析纯化来自αγ稳定转染细胞的条件培养基，并通过SDS/PAGE进行分析（图。​（图44 左侧考马斯蓝染色）。αγ细胞的游离α链蛋白由完整的α和α组成₁₅₀碎片（以及在≈66 kDa处迁移的带，用▪, 可能是中等白蛋白）。α-γ细胞α-链制备物的电镜外观与三聚层粘连蛋白的电镜外观显著不同，因为存在大量带有球状结构域的柔性线状杆。这些杆状物的长度约为80 nm，一端含有一个大的细长球状物，另一端含有三个较小的球状物。这些球状物之间的间距使得沿着杆状物长度方向的最大球状物为40–50 nm。较大的球对应于G结构域，带球的杆段对应于α链短臂，因为其与天然层粘连蛋白中的α链短手臂相似(13). 由于80 nm比α链短臂和长臂的组合长度（≈120 nm）短，重组α链的卷曲区域似乎处于紧凑的自折叠状态。相比之下，β链没有观察到这种加厚的单链卷绕区(20). 还发现了第二批分子，其数量约等于第一批分子，由球状结构（15-20纳米）组成，有时呈逗号形状（未显示）。这些在外观上与包含线圈和G结构域远端部分的重组远端α1链相同(11)和被解释为代表C末端150-kDa降解产物。通过SDS/PAGE观察到重组层粘连蛋白由完整的α链、β链和γ链组成（图。​（图44 赖特). 通过旋转阴影电子显微镜，αβγ链的制备被视为由十字形结构组成的场，其形态无法与天然层粘连蛋白的形态区分开来。

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图4

重组层粘连蛋白α亚单位和异源三聚体层粘连素1的旋转阴影电子显微照片。分泌的FLAG标记的重组α链和层粘连蛋白经亲和纯化、旋转阴影处理，并在考马斯蓝（C.B.）染色凝胶中进行分析(左侧)，并通过电子显微镜检查(居中和赖特). 自由α链(居中)为线性结构，正常短臂（箭头表示球状），短臂终止于G域。完全重组αβγ链复合物(赖特)具有层粘连蛋白的典型外观。

讨论

层粘连蛋白1与层粘连素家族的其他成员一样，是一种由三个不同亚单位组装而成的大型复杂多域糖蛋白。通过选择合适的哺乳动物细胞受体、表达载体、表位标签和顺序转染协议，我们建立了一种新的策略，在近零背景下表达重组层粘连蛋白链的不同组合，因此能够解析关联规则并导出到细胞外空间。根据这些对293个细胞的研究，并结合早期的研究，提出了组装/分泌的工作假设（图。​（图5）。5). 当单独表达时，发现α链作为单体分泌。通过电子显微镜将纯化的蛋白质显示为含有正常α链短臂的线性分子，该短臂连接到终止于G结构域的缩短的长臂状结构。其中一些蛋白质在卷曲-卷曲区域内被裂解，可能是由于部分正常埋藏的七肽序列暴露于细胞内或细胞外蛋白酶。β链和γ链，无论是单独表达还是共同表达，都不分泌，而是留在细胞内。β链形成细胞内二聚体，而γ链没有。当两条链都被表达时，βγ二聚体形成并似乎是首选。在没有β链的情况下，α链不会驱动γ链的分泌，同样，在没有γ链的情况也不会驱动β链的分泌。然而，如果β链和γ链被表达，那么这三个链都组装成三聚体，分泌到培养基中，伴随着α链降解的大幅减少。

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图5

层粘连蛋白亚基组装和分泌的工作假设。293细胞仅表达层粘连蛋白β或γ链，导致非二硫键链在细胞内滞留，β链二聚化，而γ链则不会。β和γ共表达导致异二聚体在细胞内滞留。α链的表达导致单体链的分泌，并伴有部分蛋白水解裂解：不发生带β而不带γ或带γ而不带β的组装。所有三条链的共同表达导致完整三聚体层粘连蛋白的分泌。α链是唯一可以自由分泌的链，它驱动成对βγ链的分泌。

长臂的线圈结构域对层粘连蛋白三链的组装至关重要(5–10). 二硫键桥接并稳定最近端区域的所有三条链，并连接长臂最远端区域的β链和γ链。F9细胞的生物合成标记显示层粘连蛋白合成过程中存在βγ中间产物(16)、和在体外对三条链的C末端卷曲螺旋段进行的研究表明，β和γ链段形成卷曲螺旋二聚体，在添加α链片段后，卷曲螺旋二聚体可以重组形成αβγ段异源三聚体(7–10). 在使用合成和原核重组片段的研究中，还发现ββ和βγ二聚体都可以形成，后者优先于前者(9,10,21). 此外，可以检测到α链和γ链较弱的同源关联(21). 链特异性的明显降低归因于蛋白质相对较短的长度，预计全长链不会出现这种情况。因此，令人惊讶的是，ββ和βγ二聚体的组装体内即使对于全长链，异二聚体中间体也受到青睐，尽管并不强烈。然而，另一个在体外在转染细胞中没有发现相关性，我们的数据表明，在293细胞中，β链和γ链及其缺乏α链的复合物的细胞输出被禁止。

我们的分析表明，α链可以作为单链表达和分泌，一旦与β链和γ链结合，它也可以驱动其分泌。这表明α链具有其序列和结构所特有的性质，而这些性质在其链伴侣中不存在。阻止β和γ链分泌的决定因素不太可能位于近端短臂内，因为重组β1（VI-IV）由293个细胞分泌（未发表的观察结果），而β和γ分泌的障碍似乎更可能位于线圈本身的区域。虽然仍然是一个悬而未决的问题，但至少可以确定候选层粘连蛋白α链分泌决定簇。除了α链是三条链中最大的外，它也是最基本的，尤其是在G域中(12). α链似乎也是糖基化程度最高的(5,22)，其中许多站点位于线圈中。一种可能性是，α链中唯一存在的碳水化合物结构，特别是卷曲线圈的N末端部分，允许其分泌。虽然人们可能怀疑这些庞大的碳水化合物基团也可能影响卷曲，但使用缺乏碳水化合物的C末端肽进行的自组装研究表明，碳水化合物不是这方面的主要决定因素(21). 插入杆状病毒的相同全长αcDNA导致α链表达，但在感染Sf9昆虫细胞后未能导致分泌（数据未显示）。相反，这些相同的细胞表达和分泌型重组αG结构域，带有或不带有线圈序列的末端（C末端）2/5(11,12). 这些昆虫细胞具有二硫键异构化和添加N-连接碳水化合物所需的必要翻译后酶，但它们缺乏将甘露糖型低聚糖转化为复合低聚糖的能力(11). 我们认为，α链的复杂碳水化合物是游离α链和组装层粘连蛋白的细胞输出的决定因素之一。

我们观察到β链和γ链的分泌需要α链的共同表达。此外，有证据表明这种现象并不局限于293个细胞(23–26). 在成纤维细胞上生长的上皮细胞中，层粘连蛋白α链表达受到抑制，导致层粘连素分泌消融，β链和γ链在细胞内积聚(24)层粘连蛋白α1链似乎是肾上腺皮质细胞分泌β和γ链的限制因素，βγ链在细胞内的滞留表现为摩尔过剩(26). 这些发现使人们不太可能像曾经提出的那样，存在缺乏α链的层粘连蛋白(23). 当前研究的一个意外且对比性的发现是，α链在缺乏正常β链和γ链伴侣的情况下表达，是以游离单体的形式分泌的。当细胞内α链浓度超过可用βγ复合物浓度时，我们可以预测这一事件，从而提高组织细胞在某些情况下分泌游离α链的可能性。如果是这样的话，这些分子的功能将与层粘连蛋白的功能大不相同。我们的发现还表明，整个层粘连蛋白的分泌可能由α链基因产物控制。有趣的是，十多年前库珀和麦昆(27)提出α链可能调节层粘连蛋白的细胞外分泌和基膜积累；他们发现，当细胞外层粘连蛋白首次出现时，层粘连素的α链在16细胞桑椹胚期的β链和γ链之前表达。在肾上腺皮质中，发现促肾上腺皮质激素（ACTH）在细胞内β链和γ链摩尔过量的情况下通过诱导α链合成来上调层粘连蛋白-1的分泌(26). 因为在某些发育阶段，层粘连蛋白细胞外积累先于其他基底膜成分(28)我们推测α链的调控可能用于触发基底膜组装。

总之，我们已将重组策略应用于层粘连蛋白的组装和分泌分析，揭示了新的组装规则，并确认了基于在体外研究。我们还表明，有可能产生生化数量的完全重组三聚体细胞外基质分子用于研究。据我们所知，这是首次将这种多亚单位细胞外糖蛋白组装或处理为重组实体。从早期的研究中，我们得出结论，用原核或杆状病毒表达系统无法实现这些目标：这些其他系统似乎无法提供分泌所需的翻译后修饰。我们采用的哺乳动物表达策略克服了这些困难，现在可以用于进一步分析组装以及阐明和绘制层粘连蛋白亚型的不同功能，这些亚型在很大程度上不可用作分离成分。此外，它还为解剖正常层粘连蛋白功能的分子基础和评估含层粘连蛋白质突变的功能改变开辟了一条途径，如在美罗华缺乏型先天性肌营养不良症等疾病中发现的功能改变。

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