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BMC基因组学。2008; 9点165分。
2008年4月11日在线发布。 doi（操作界面）：10.1186/1471-2164-9-165
预防性维修识别码：PMC2329642型
PMID：18405356

人类ABC转运蛋白假基因家族：转录和基因假基因干扰的证据

Armin P Piehler公司,通讯作者1 玛丽特·赫勒姆,1 尤尔根·J·温泽尔,2 埃伦·卡明斯基,三 卡里·本特·福斯·豪格,1 彼得·基鲁夫,1和沃尔夫冈·卡明斯基4
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补充资料

摘要

背景

假基因是人类基因组的组成部分。然而，到目前为止，人们对一些假基因转录活性的现象很少关注。最近，我们证明啮齿动物睾丸特异性ATP结合盒（ABC）转运蛋白Abca17的人类直系同源物是一种普遍转录的假基因(ABCA17P公司). 本研究的目的是建立人类基因组中所有ABC转运蛋白假基因的完整清单，并鉴定转录活性的ABC转运蛋白伪基因。此外，我们检验了ABC转运蛋白假基因与其亲本蛋白编码等价物之间存在调控相关性的假设。

结果

系统生物信息学分析表明，人类基因组中存在22个ABC转运蛋白假基因。我们在第15和16号染色体上分别鉴定了两个簇，它们包含了几乎一半的假基因（n=10）。EST和mRNA数据库的可用信息以及RT-PCR表达谱表明，大部分ABC转运蛋白假基因（45%，n=10）具有转录活性，其中一些表达为选择性剪接变异体。我们证明弹性假黄瘤基因的两个假基因ABCC6公司,ABCC6P1型和ABCC6P2型，被转录。ABCC6P1型和ABCC6公司具有几乎相同的启动子序列，并且它们的组织特异性表达谱惊人地相似，这增加了它们形成基因-假基因双转录单位的可能性。有趣的是，转录假基因的靶向敲除ABCC6P1型导致了ABCC6公司mRNA表达水平。

结论

相对于其他已知基因家族，人类基因组中包含的ABC转运蛋白假基因数量少得惊人。它们在染色体上分布不均匀。重要的是，ABC转运蛋白假基因的很大一部分是转录活性的。下调ABCC6公司靶向抑制其假基因表达的mRNA水平ABCC6P1型首次为转录的假基因及其在人类基因组中的蛋白质编码对应物之间的调控相互依赖性提供了证据。

背景

人ATP结合盒（ABC）转运蛋白形成了一个结构高度相关的膜转运蛋白大家族。根据序列相似性，人类ABC转运蛋白家族被分为7个亚家族，即ABC A-G，由48个成员组成。ABC转运体在细胞膜上转运广泛的底物，如脂类、糖、肽、离子和抗癌药物等外源性物质[1,2]. 缺陷的ABC转运体导致单基因疾病，并导致复杂疾病的发展[三]. 14个人类ABC转运蛋白基因的突变到目前为止已与一系列无关的遗传性疾病联系在一起，这一事实突显了ABC蛋白的生理重要性[2].

除了ABC转运蛋白的蛋白质编码基因外，人类基因组中还含有几个ABC转运蛋白假基因[4]. 然而，人类基因组中存在的ABC转运蛋白假基因的确切数量仍不清楚。一般来说，假基因是指基因组中与一个或多个同源基因高度相似的非功能序列。这种功能缺失是由于转录或翻译失败，或者产生了与功能基因编码的蛋白质功能不同的蛋白质[5]. 伪基因被认为是由基因复制和复制基因的随后退化引起的，或者是由同源基因的逆转录mRNA逆转录到基因组中引起的。后者是无内含子的，被称为“加工”假基因[6].

在过去的几年里，我们和其他人提供了证据证明存在转录活性的ABC转运蛋白假基因[7-9]. 例如，我们最近证明了啮齿类动物睾丸特异性ABC转运蛋白Abca17的人类同源基因是一个假基因(ABCA17P公司)它被转录成多达20个可供选择的剪接变体[9]. 这些结果提出了一种有趣的可能性，即ABC转运蛋白假基因转录物可能具有生物功能，而不是为蛋白质生物合成提供遗传蓝图。

在本研究中，我们应用综合生物信息学方法来识别人类基因组中的所有ABC转运蛋白假基因，并系统地搜索转录假基因的证据。我们在ABC转运体家族中共鉴定出22个假基因，其中一个重要亚组分（n=10）具有转录活性。我们找到了之前已知的两个基因转录的证据ABCC6公司假基因ABCC6P1型和ABCC6P2型并报告其基因结构。此外，我们首次证明了ABCC6P1型及其翻译的对应物弹性假黄瘤基因ABCC6公司.

结果

人类基因组包含22个ABC转运蛋白假基因

为了鉴定人类ABC转运蛋白的同源物，我们基于已知的48个人类和5个小鼠ABC转运蛋白基因的序列进行了全基因组搜索，而人类基因组中尚未记录到其同源物(阿布卡14-阿布卡17,抗体cg3). 该策略依赖于BLAST同源性搜索（截止E值：0.001），其中ABC转运体核苷酸参考序列被用作查询序列。这些与人类基因组的一个版本（2006年3月组装，NCBI Build 36，hg18）进行了比较，在该版本中，ABC转运体查询序列的已知外显子被屏蔽。我们的搜索算法产生了3322841次主要点击。详细的序列分析表明，已知的人类ABC转运蛋白cDNA中有很大一部分（33/48，69%）含有重复性成分（附加文件1). 然后，我们排除了所有可归因于重复元素的点击，并根据其染色体位置对剩余的点击进行分类（n=174）。当相邻的点击（i）与相同的编码ABC转运蛋白基因的蛋白质表现出最大的相似性，（ii）定位在彼此之间的距离小于0.1 Mb，以及（iii）与匹配的编码ABC转运体的蛋白质核苷酸序列定位在相同的5'→3'顺序时，将其合并为单个假基因候选。在没有相邻命中的情况下，使用EMBOSS包中更严格的比对工具“matcher”将旁边的0.1 Mb基因组区域与相应的ABC转运体核苷酸序列进行比对。这种方法可以保证以最小的速度忽略更为远缘相关的ABC转运蛋白假基因。在相应ABC转运蛋白核苷酸序列的至少一个完整外显子上具有>70%同一性的命中被认为是同源的，并通过上述标准（i-iii）进行评估。当合并的hits包含蛋白质编码基因的至少两个同源外显子，并且具有缺陷的阅读框架，从而无法翻译成满足功能性ABC全尺寸或半尺寸转运体最低结构要求的多肽时，被视为假基因。利用这一策略，我们在人类基因组中共鉴定出22个位点，这些位点代表编码ABC转运蛋白基因的蛋白质退化拷贝。它们与蛋白质编码对应物的cDNA在159–3754 bp范围内的相似性大于70%，并且包含各自亲本基因的两个至19个外显子的同源物。我们发现的ABC转运蛋白假基因可以归属于所有七个亚家族，即ABC A-ABC G（表​（表1）。1). 我们发现，在基因组中，除Chrs外，它们通常存在于含有编码ABC基因的蛋白质的染色体上（第1、2、3、4、7、10、14、16、21章）。分别为15和22，其中不存在编码蛋白质的ABC转运蛋白基因（图​（图1）。1). 值得注意的是，22个ABC转运蛋白假基因中有一半分别位于第15（n=4）和16（n=7）染色体上。有趣的是，chr短臂上的七个假基因。16（16p11.2-p13.3）按顺序聚集在30Mb的段内电话-ABCA17P公司——ABCC6P2型——ABCC6P1型——ABCA14P公司——ABCA15P1型——阿布卡15p2——ping 1P3-cer（证书）.

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人类ABC转运蛋白假基因和蛋白编码基因的染色体分布人类ABC转运蛋白家族的假基因在人类基因组中广泛分布。图中显示了人类基因组中ABC转运蛋白假基因（每条染色体的右侧）及其亲本蛋白编码基因（左侧）的染色体定位（彩色箭头）。双亲基因和假基因由相同的箭头颜色代码表示。转录的假基因呈绿色阴影。底部显示了16p染色体上ABC转运蛋白假基因簇（30Mb）的特写视图。箭头表示chr上假基因的5'->3'方向。16p和相邻假基因之间的距离是详细的（Mb）。ABCA14P公司,ABCA15P1型和ABCA15P2型分别代表仅在啮齿动物中报告的功能对等物的假基因（Abca14、Abca15）。表意文字是使用彩色染色体软件生成的[41]。

表1

人类基因组中的ABC转运蛋白假基因

父母基因ψ-基因符号染色体带染色体位置*处理转录证据选择性剪接转录物加入号码**
ABCA10公司ABCA10P（ABCA11）第16.3页408750–411669++三AK024359
ABCA3/Abca17abca17便士16页13.32330924–2416701-+20DQ266102型
澳大利亚广播公司4ABCB4P公司第4季度32.1158955613–158956084+--
澳大利亚商业银行10ABCB10P1型15季度11.220240777–20244535++第DB511925号
澳大利亚广播公司10P215季度13.126321621–26325378+--
ABCB10P3型15季度13.126552813–26550744++第BP260092公司
ABCC2型ABCC2P（ABCC13）21问题11.214568083–14593875-+-AY344117型
ABCC6公司ABCC6P1型第16页第12.3页18490076–18511541-+-BC075833号
ABCC6P2型16页13.1114822152–14826050-+-BC015978号
ABCD 1ABCD1P1第111页第2页91392363–91396515---
ping 1P2第11.1页38934556–38938703---
ping 1P3第16页第1.2页32392919–32397074---
ABCD 1P422季度11.115248418–15252575---
ABCE1公司ABCE1P1型1季度31.2190481983–190483713+--
ABCE1P2型第7页15.323566974–23570537++第AY962469年
ABCF2型ABCF2P1型第11.2页88448934–88451415+--
ABCF2P2型7季度11.271206102–71208540---
ABCG2公司ABCG2P1型14季度24.376895512–76896054+--
ABCG2P2型23年第15季度67101380–67103614++第CR610432号
阿布卡14ABCA14P公司第16页第2.2页21210041–21219286---
阿布卡15ABCA15P1型16页12.221257276–21257846---
阿布卡15p216页12.121857685–21863768-+2DR731461号文件

*染色体位置参考人类基因组NCBI Build 36（hg18，汇编2006年3月）。

**登录号是指识别出的代表转录假基因的EST或mRNA序列

共有10个ABC转运体假基因（45%）是无内含子的，由重复序列直接侧翼（如UCSC基因组浏览器中的重复屏蔽轨道所确定的那样），其中大多数（n=8）也表现出多（A）尾。这些结构特征是对加工假基因的诊断[10]强烈表明它们起源于祖先功能性ABC转运体基因的逆转录转座子（表​（表11).

人类ABC转运蛋白假基因的很大一部分是转录活性的

为了评估哪些已鉴定的人类ABC转运蛋白假基因被转录，我们使用UCSC基因组浏览器分析了所有22个假基因ABC转运蛋白基因座与EST或mRNA序列的同源性。使用这种方法，在22个人类ABC转运体假基因中，有10个的101个EST和/或mRNA序列表现出最佳命中率（>99%的总体一致性）。与人类基因组中的任何其他位置相比，这些序列对其相应的假基因位点显示出更高的序列一致性。这表明人类ABC转运蛋白假基因中有很大一部分（45%）是转录活性的（表​（表1）。1). 其中，n=5（50%）为加工假基因。与我们的一致电子版结果，对跨越至少两个外显子的所有ABC转运蛋白假基因转录物的RT-PCR表达分析表明，假基因ABCA10P公司,ABCA15P2型,ABCA17P公司,ABCC2P公司,ABCC6P1,ABCC6P2型和ABCG2P2型事实上是转录的（图​（图2）。2). 有趣的是，我们在10个转录假基因中的3个中发现了选择性剪接转录物(ABCA10P公司,ABCA15P2型,ABCA17P公司).

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人类ABC转运体假基因RNA的表达RT-PCR表达谱显示ABC转运蛋白假基因ABCA10P公司,ABCA15P2型,ABCA17P公司,ABCC2P公司,ABCC6P1型,ABCC6P2型和ABCG2P2型分别按照我们的预测转录生物信息学结果。使用来自混合组织的人类cDNA进行RT-PCR。请注意ABCA10P公司,ABCA15P2型，以及ABCA17P公司表达为选择性剪接转录变体（经序列分析确认）（箭头）。

基因结构和表达谱ABCC6公司及其假基因ABCC6P1型和ABCC6P2型在各种人体组织中

两个假基因，ABCC6P1型和ABCC6P2型，已报道为弹性假黄瘤基因ABCC6公司，ABC C子家族成员[7]. 它们位于2.3 Mb着丝粒(ABCC6P1型)和1.3 Mb(ABCC6P2型)蛋白质编码的端粒ABCC6公司基因（图​（图3）。三). 当我们对这两个假基因进行详细的生物信息学分析时，我们从GenBank NCBI数据库中检索到一个含有2.7 kb mRNA的poly（a），该数据库是在哺乳动物基因收集计划期间从人类肝细胞中分离出来的[11]. 成绩单[GenBank:BC075833号]与9个假定的外显子完全同源ABCC6P1型表明该假基因具有转录活性。基因组序列和2.7 kb转录本的比较表明ABCC6P1型该基因由10个外显子组成（图​（图3）。三). 这个ABCC6P1型内含子大小在0.1至5.2kb之间。外显子1-9与亲本基因的相应外显子具有完全或接近完全的同源性（98.3%–100%）ABCC6公司相反ABCC6P1型没有显示与ABCC6公司.由于观察到外显子10中的序列差异ABCC6P1和ABCC6公司可通过RT-PCR可靠区分。此外，它允许使用RNA干扰策略选择性靶向假基因转录物。

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基因组组织ABCC6P1型和ABCC6P2型，两个转录的假基因ABCC6公司.假基因ABCC6P1型和ABCC6P2型侧翼他们的亲本基因ABCC6公司在染色体16p13上，距离分别为2.3 Mb和1.3 Mb。箭头指示转录的方向。的结构ABCC6P1型和ABCC6P2型基因及其转录本在高倍镜下显示。外显子由黑盒子表示，并按5'到3'的顺序编号。假基因外显子与其对应外显子的相似性（%）ABCC6公司外显子显示在括号中。的末端非同源外显子ABCC6P1型为蓝色阴影。红色方框突出显示了ABCC6P2型其中包含内含子2的一部分。公制比例尺指示方向。

我们还发现生物信息学第二种基因转录的证据ABCC6公司假基因，ABCC6P2型与此一致，我们使用来自20个人体组织的混合mRNA进行的RT-PCR实验证实了该假基因的表达（图​（图2）。2).ABCC6P2型由四个外显子组成，其长度在59-183bp之间，与亲本基因相应外显子的序列相似性最高（98-100%）。内含子大小ABCC6P2型范围为0.1至1.7 kb。有趣的是，Genbank mRNA数据库搜索显示0.7 kb多聚（a）尾转录本与ABCC6P2型外显子1和2加上额外的第二内含子的504bp（图​（图3）。三). 该转录本已在哺乳动物基因收集计划中独立鉴定[11]来自肾脏[GenBank:BC015978号].

接下来，我们测试了两者之间是否存在监管相关性以及在何种程度上存在监管相关性ABCC6公司和ABCC6P1为此，我们通过实时PCR对这两个基因在不同人类组织中的表达进行了分析。表达水平标准化为看家基因β-肌动蛋白的表达。我们观察到类似的基因表达模式ABCC6公司和ABCC6P1型在肝脏和肾脏中表达水平最高（图4A、B类). 在大多数组织中ABCC6公司mRNA水平略高于ABCC6P1型然而，ABCC6P1型是骨髓和胎脑中的主要转录物（图​（图4C）。4摄氏度). 当表达水平归一化为另一个看家基因亲环素B时，也得到了类似的结果（数据未显示）。

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ABCC6公司及其转录的假基因ABCC6P1型在多种人体组织中共同表达.的相对转录水平ABCC6公司（A）和ABCC6P1型（B）通过实时RT-PCR在20种不同的人体组织中检测到与看家基因β-actin相对应的基因。两者的最高表达ABCC6公司和ABCC6P1型在成人肝脏（参考=100%）、肾脏和胎儿肝脏中观察到。（C）ABCC6公司/ABCC6P1型转录比率。请注意ABCC6公司和ABCC6P1型在所有研究的组织中共同表达ABCC6公司表达水平平均比ABCC6P1型比率以对数刻度（以2为基数）显示。

The striking co-expression of theABCC6公司和ABCC6P1提出了两个基因的转录受类似调节元件控制的可能性。当我们比较这两个基因的5'调控区序列时，我们发现它们在起始密码子上游的前2.5kb内，即包含假定核心启动子的区域，具有98.9%的总序列相似性（附加文件2). 值得注意的是，72个潜在转录因子结合位点中有68个，我们在预测的ABCC6P1型启动子区域完全完整。特别是NF-κB共有结合序列（位置-233bp），已知可赋予高水平ABCC6公司HepG2肝癌细胞中的表达[12]，在假设中是完全保守的ABCC6P1型启动子区。三个结合位点，分别是糖皮质激素反应元件（GR，位置-2116 bp）、八聚体结合因子（oct-1，位置-1746 bp）和GATA-3共识位点（位置-1269 bp），显示出单碱基交换。此外，USF结合位点（位置-622 bp）表现出非单体缺失，从而破坏了相应的一致序列。有趣的是，单碱基交换在预测中产生了5个新的转录因子结合位点（SRY-2381 bp，C/EBPb-1223 bp，GATA-2-1124 bp，AML-2-464 bp，C/EBP-316 bp）ABCC6P1型发起人。

比较ABCC6公司启动子序列ABCC6P2型5’UTR显示的同源性（99.6%）比观察到的更高ABCC6P1型在72个转录因子结合位点中，共有71个位点是完全保守的，这表明ABCC6P2型表达模式与ABCC6公司和ABCC6P1型分别是。然而，我们无法量化ABCC6P2型实时PCR的表达水平，因为转录本的小尺寸及其与ABCC6公司和ABCC6P1型阻碍特定检测ABCC6P2型mRNA。

靶向敲除假基因ABCC6P1型导致ABCC6 mRNA表达下调

这个ABCC6公司/ABCC6P1型基因-假基因对的独特之处在于：（i）两种成分都表现出相似的表达模式，（ii）它们（假定的）启动子区域具有广泛的相似性，（iii）在chr上的位置在空间上非常接近。16p12.这些特征的结合提出了一个问题，即：ABCC6P1型和它的paralogABCC6公司为了解决这个问题，我们测试了沉默ABCC6P1型对…有影响ABCC6公司表达式。为此，一种针对非同源外显子10的siRNA-介导的基因敲除方法ABCC6P1型被使用，允许选择性沉默ABCC6P1型但不是ABCC6公司在几个外显子10特异性siRNA中，我们选择了一个可以在HepG2肝细胞中获得最有效基因沉默的siRNA。敲除效应分别归一化为看家基因β-actin和亲环素B。使用这种方法，平均69%（SD 4%，95%-CI:65–73%）的ABCC6P1型在六个独立的实验中获得了假基因（图​（图5，5，车道3）。重要的是，击倒ABCC6P1型导致显著减少ABCC6公司mRNA表达。的剩余表达式ABCC6公司当归一化为β-actin时，与亲环素B相比，分别为84%（SD 7%，p=0.003，95%-CI:76-91%）和82%（SD 11%，p=0.01，95%/CI:72-93%）（图​（图5，5，车道4）。无重大变化ABCC6公司或ABCC6P1型当使用非特异性siRNA或仅使用脂质转染剂时，观察到HepG2细胞中的表达水平（阴性对照，数据未显示）。相反，GAPDH公司-特异性siRNA（阳性对照）相对于β-肌动蛋白和亲环素B显示了89%（95%-CI:87-97%）的敲除率（图​（图5，5，车道2）。使用ABCC6P1型siRNA靶序列（21 bp）作为诱饵，在整个启动子区域和所有的外显子和内含子中始终显示不匹配>5 bpABCC6公司因此，siRNA介导的抑制ABCC6公司不能归因于两个基因中共同序列基序的“共同靶向”。我们的发现ABCC6P1型对…有抑制作用ABCC6公司从而表明ABCC6P1型其亲本基因是相互依赖的。

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转录假基因的沉默ABCC6P1型下调ABCC6公司.靶向siRNA介导的抑制ABCC6P1型HepG2细胞中的表达导致假基因转录水平显著下调（69%，95%-CI:65-73%）（第3通道）。mRNA水平归一化为β-actin（黄色条）和亲环素B（蓝色条）。ABCC6P1型沉默与ABCC6公司mRNA表达（84%，p=0.003，95%-CI:76-91%，黄色条；82%，p0.01，95%-CI：72-93%，蓝色条，车道4）。阳性对照（击倒GAPDH公司)如图所示（车道2）。数据来自六个独立的实验。击倒实验前的相对表达水平设置为100%（车道1）。

讨论

在我们的研究中，我们报告了22个人类ABC转运蛋白假基因的存在。据估计，人类基因组中的假基因总数约为20000个[13-15]而预测的蛋白质编码基因数量为20000–25000个[16]. 这一估计表明app的全基因组基因/假基因比率。1:1. 鉴于存在48个有功能的人类ABC转运蛋白，ABC转运蛋白基因/假基因比率约为。2:1. 因此，人类基因组中ABC转运体假基因的数量明显低于目前确定的基因假基因家族中假基因的预期平均频率[17-19].

我们的结果表明，ABC转运蛋白家族的假基因在染色体上分布不均匀。大约一半的ABC转运蛋白假基因（n=11）分布在多条染色体上，而另一半则聚集在chr上。分别为15和16。其中，七个假基因位于chr的短臂上。16个位于30Mb片段内（16p11.2-p13.3），三个加工（无内含子）假基因聚集在chr长臂上。15.在chr上的ABC转运体假基因簇。16p由三个蛋白编码的ABC转运蛋白基因、六个重复的假基因和一个加工的假基因组成。在各种脊椎动物的其他基因家族中观察到假基因的聚集，包括细胞色素P450酶组、α-珠蛋白以及免疫球蛋白重基因和轻基因的可变基因片段[17,20,21]. 这些基因簇通常由来自同一基因家族的蛋白质编码基因和假基因组成，这可能反映了假基因化是一种与基因复制事件高度相关的机制。基因和假基因在空间上的接近性表明，基因复制是最近发生的进化事件，因为尚未发生跨基因组的扩散。鉴于此，可以合理地假设ABC转运蛋白假基因位于chr上。15和16确实是基因复制和先前功能性ABC转运体基因随后的假基因化的结果。值得注意的是，啮齿类动物基因组中含有以下蛋白质编码基因：阿布卡14,阿布卡15[22]和阿布卡17[23]. 因此，可以想象，这些完整基因的人类直系同源基因在复制后的一段时间内是有功能的，然后才最终失效。至于chr 16上的另外两个复制假基因ABCC6P1和ABCC6P2，目前尚不清楚它们是由亲本ABCC6基因的完全复制引起的，因此可能暂时维持了它们的功能，还是仅复制了该基因的片段ab ovo公司.

与未加工假基因的情况不同，加工假基因的染色体分布通常是随机的，每条染色体的假基因数量与染色体长度成比例[15]. 这与加工假基因起源于先前存在的转录物的非定向逆转录转座子的观点一致。有趣的是，chr上的假基因簇。15含有三个加工假基因(ABCB10P1型-三)它们彼此非常接近（它们的亲本基因ABCB10型位于chr上。1). 因为不太可能ABCB10P公司聚类是三个独立的反转录转座事件的结果，目标是同一个染色体片段，即三个染色体片段中的两个澳大利亚商业银行10假基因很可能是由基因复制引起的。我们进行的同源性分析确实表明ABCB10P1型可能起源于澳大利亚商业银行10通过逆行转位过程。有趣的是，他们还强烈支持以下观点：澳大利亚广播公司10P2因重复而产生ABCB10P1型和ABCB10P3型是重复的结果澳大利亚广播公司10P2（附加文件三). 因为澳大利亚广播公司10P2和ABCB10P3型很可能是由于一个已经失效的加工假基因的复制引起的，可以合理地假设这些假基因从来没有编码蛋白质的能力。据我们所知ABCB10P公司因此，簇代表了人类基因组中加工假基因增殖的第一个例子。

重要的是，我们获得了表明该应用程序的生物信息学证据。一半（45%）的人类ABC转运蛋白假基因具有转录活性。与此一致，我们基于RT-PCR的调查表明，在预测的转录活性假基因中，至少有7个是转录的。到目前为止，对假基因转录现象的关注很少[6]由于假基因通常被认为是无功能的基因组遗迹。然而，最近的一些研究对这一观点提出了挑战。例如，一项专注于人类基因组中加工假基因转录的综合研究表明，app的一个亚组分。识别出的所有加工假基因中有5%是转录的[24]. 此外，对人类chr的假基因转录进行了分析。22使用生物信息学/微阵列相结合的方法证明，在该染色体上鉴定的假基因中，多达20%是转录活性的[25]. 潜在转录假基因所占比例之高令人惊讶，这对假基因的传统观点提出了质疑，并提出了一种有趣的可能性，即转录的假基因可能在基因组中发挥特定的生物功能。这一概念得到了最近两项研究的支持，这两项研究为假基因功能提供了实验证据。Korneev等人报道了一种基因及其转录的假基因的直接干扰，证明了反义假基因抗NOS其转录物与无操作系统，抑制其亲本基因的蛋白表达[26]. 另一项研究强调了这样一个事实，即假基因表达可以发挥与人类祖先基因无关的生物功能西斯特非编码RNA基因，启动X染色体失活，并通过蛋白质编码基因的假基因化在正常人中进化长x3[27].

为了测试转录的ABC转运体假基因与其蛋白编码对应物之间是否存在调控相关性以及在何种程度上存在调控相关性，我们选择了弹性假黄瘤基因，ABCC6公司，及其转录的假基因ABCC6P1型这种基因-假基因对似乎是干扰研究的理想候选，因为ABCC6公司和ABCC6P1型在其转录物中表现出近乎完美的序列同源性，但同时，由于其最终外显子（外显子10）的非同源性差异，RT-PCR仍然可以区分ABCC6P1型此外，这种序列差异允许使用siRNA方法选择性靶向假基因转录物。mRNA表达谱ABCC6公司和ABCC6P1型研究表明，这两个基因在广泛的人体组织中持续共表达，主要表达于成人肝脏、肾脏和胎儿肝脏（按此顺序）。我们观察到的ABCC6的组织表达模式与最近一项涉及79个人类组织的全基因组基因表达研究一致[28]. 遗憾的是，这项工作不包括假基因ABCC6P1的表达数据。我们的发现ABCC6公司和ABCC6P1型在它们各自的核心启动子区具有近乎完美的同一性，再加上观察到的共表达模式，强烈表明基因-假基因对的表达是由相同的转录因子机制控制的。

有趣的是，我们发现选择性击倒ABCC6P1型导致减少ABCC6公司mRNA表达表明ABCC6P1型其亲本基因是相互依赖的。在这一点上，所观察到的基因-假基因干扰的调节机制仍然是推测性的。众所周知，mRNA的稳定性和降解在很大程度上取决于特异性顺式-信使核糖核酸分子中的作用元件。这些在UTR和mRNA编码区都能发现的相互作用的不稳定元素受到了反式-促进mRNA衰变的作用机制[29]. 来自具有广泛序列同源性的不同基因的转录物（如基因-假基因对），因此包含相同的不稳定顺式元素，可能会竞争这种序列同源性反式-作用元件。因此可以想象ABCC6公司和ABCC6P1由于其高度序列相似性和拓扑接近性，转录物竞争相同的细胞RNA降解途径。因此ABCC6P1型因此，成绩单可能会导致ABCC6公司mRNA降解率。更详细地描述ABCC6公司和ABCC6P1型转录单位。知识ABCC6公司/ABCC6P1型调节相互作用可能与临床医学有潜在的相关性，因为ABCC6公司是弹性假黄瘤综合征的潜在基因缺陷。

结论

在本研究中，我们确定了人类基因组中存在22个ABC转运蛋白假基因。结合生物信息学和实验结果表明，这些假基因中有很大一部分（45%）是转录的，我们首次为人类基因组中选择性剪接假基因RNA的表达提供了证据。此外，我们还表明ABCC6P1型，弹性假黄瘤基因的假基因之一ABCC6公司与ABCC6在多种组织中共同表达ABCC6P1型表达影响ABCC6公司强烈暗示了ABCC6P1型以及它的祖先基因。伪基因转录和功能的新概念最近在伪基因的重新定义中得到了反映，即“来自功能基因但不能编码与原始基因相同类型的功能产物的基因组序列”[30]. 因此，最近提出了将其亚类化为（i）具有某些中间功能的“鬼”假基因，即类似于功能基因并转录和/或功能，以及（ii）缺乏任何功能的“死”假基因。我们在这里展示的结果有力地支持了这种关于假基因生物学的新的差异化观点。

方法

人类ABC转运蛋白假基因的生物信息学鉴定

为了鉴定人类基因组中的所有ABC转运蛋白假基因，我们检索了人类基因组的完整序列[31]来自UCSC基因组浏览器的染色体（2006年3月组装，NCBI Build 36，hg18）[32,33].

MaskSeq程序的独立版本用于屏蔽所有人类参考ABC转运体基因的外显子。为此，使用所有人类ABC转运蛋白的参考核苷酸序列登录号列表，从UCSC基因组浏览器的Table Browser应用程序中检索编码ABC转运蛋白基因的人类蛋白的外显子坐标[34]. 设计了一个Perl脚本，用于从表浏览器输出中提取外显子坐标并重新格式化，以便在程序MaskSeq中应用。

除了所有人类参考ABC转运蛋白序列外，我们还下载了所有已知小鼠ABC转运蛋白的参考核苷酸序列，这些转运蛋白在人类基因组中没有明显的同源对应物(阿布卡14,阿布卡15,阿布卡16,阿布卡17,抗体3). 使用BLAST应用程序的本地安装（版本2.2.14），针对ABC转运体外显子屏蔽的人类基因组，对参考ABC转运器核苷酸序列进行同源性搜索。在该校准中，E值为0.001，表格输出格式为“-m8”。为了消除来自重复序列的点击，使用数据库Repbase（11.12版）应用RepeatMasker程序（3.1.6版）识别查询ABC转运体核苷酸序列中的重复序列。使用内部编写的Perl脚本来排除完全位于重复序列中的所有点击，以及那些延伸到重复序列侧翼区域的小于30 bp的点击。然后，当相邻的点击与相同的蛋白质编码基因产生最高同源性，并且当它们与同源的ABC转运体核苷酸序列处于相同的5'→3'方向时，其余的点击沿着染色体排序，并合并为单个候选假基因。在没有相邻命中的情况下，使用EMBOSS软件包中更严格的比对工具“matcher”将单个命中两侧0.1 Mb的基因组区域与相应的ABC转运体核苷酸序列进行比对。这种方法可以识别更为远缘相关的假基因。在各个ABC转运体核苷酸序列的整个外显子上显示>70%一致性的点击也被认为是同源的，并进行了进一步评估。当（i）检索到的序列与一个蛋白质编码基因的至少两个外显子具有同源性，以及（ii）合并的命中包含序列畸变，无法将其翻译为功能性ABC转运体时，合并的命中被归类为候选假基因。随后，使用UCSC基因组浏览器分析所有潜在的假基因[33]排除候选假基因是已知蛋白质编码基因的一部分的可能性。此外，利用UCSC基因组浏览器的人类mRNA和EST轨迹搜索已识别的ABC转运蛋白假基因的转录。当一个同源mRNA或EST序列与假基因的总体显示>99%，但人类基因组中没有其他位点时，该位点被视为候选转录活性假基因（“最佳命中”）。

使用EMBOSS包算法计算序列相似性和多序列比对[35,36]. 利用tfsearch（1.3版，阈值得分85.0，分类：脊椎动物）确定潜在转录因子结合位点[37]和TRANSFAC数据库（3.3版）[38].

假基因转录的确认

使用Omniscript RT Kit（Qiagen），在20μl RT反应中，在寡核苷酸-dT引物存在下，对1μg混合总RNA（人类总RNA主面板II，Clontech）的等分部分进行反转录。使用HotStarTaq DNA聚合酶试剂盒（Qiagen）扩增cDNA。循环条件为94℃30s、54–60℃30s和72℃30s-3 min，然后在72℃下进行最后延伸步骤10 min。利用以下引物集验证假基因的转录：ABCA10P公司5'-GATTTTGCCAGAGCCTCTCACC-3'，5'-GAGTGATTTGCTTGGA-3’，阿布卡15p25'-AACTGGCATGGACCACCAGAG-3'，5'-CTTCCACAAATGCCAAAC-3'，ABCA17P公司5'-TCACGCACTGTCTTTTTTG-3'，5'-CCAGTACATGGAACTGATG-3'，ABCC2P公司5'-GCCTGGATTCAGAAATTGCAT-3'，5'-GCC CACAGAGAAAGCATAA-3'，ABCC6P1型5'-CCCCACGAAGAAGG-3'，5'-TTCGAAACCTTGGCTCA-3'，ABCC6P2型5'-CCCCACGACAGAG-3’、5'-TCTGTTGGGAGACCGT-3’和ABCG2P2型5'-GGTACTCCGCTGACACCTTC-3'，5'-TTTTCAACTGGTTTTGACCA-3’。PCR产物在GelStar上分离和分析®（Cambrex）染色0.8–1.5%琼脂糖凝胶。去除感兴趣的条带，并使用QIAquick提取DNA®凝胶提取试剂盒（Qiagen）。使用Microcon纯化产生单个条带的PCR运行®YM-30柱（Millipore）用于后续序列分析。纯化的扩增产物按先前公布的方法进行测序[39]. 使用FinchTV v.1.3.1（Geospiza Inc.）程序和UCSC基因组浏览器分析序列数据。

细胞培养

HepG2细胞购自ATCC（编号HB-8065），并在含有2 mM L-谷氨酰胺和厄尔BSS（1.5 g/L碳酸氢钠，0.1 mM非必需氨基酸，1.0 mM丙酮酸钠，90%；胎牛血清，10%）（含2%青霉素/链霉素）的ATCC完全生长培养基（Eagle's培养基）中的标准条件（5%CO2，37°C）下培养。

siRNA介导的HepG2细胞ABCC6P1基因敲除

21个mer-siRNA是使用怀特黑德生物医学研究所的siRNA设计工具设计的[40]靶向假基因第10外显子序列ABCC6P1型该外显子与其亲本基因没有同源性（序列一致性<20%）ABCC6公司从而允许选择性瞄准ABCC6P1型siRNAs包括阳性（沉默剂GAPDH公司siRNA）和阴性对照（Silencer阴性对照#1 siRNA）购自Ambion，Inc.。筛选了几个siRNA后，以下siRNA产生了最高的敲除率ABCC6P1型在所有进一步的实验中使用：分别为Sense 5'-CUCCCAGGAUAAAAUCAUU-3'和antisense 5'-UGAUUAUCCCUGGGAGUU-3'。使用1.5μl siRNA（20μM）与3μl siPORT™NeoFX™转染剂（Ambion）在100μl OPTI-MEM缓冲液（Invitrogen）中复合，对HepG2细胞进行反向转染。培养10分钟后，将siRNA/脂质复合物与900μl的105细胞/ml HepG2细胞置于培养基中，并置于12孔板中。在标准条件下培养24小时后，对细胞进行裂解，提取RNA（MagNA Pure LC RNA Isolation Kit–High Performance，Roche）并在纳米液滴上进行定量®分光光度计。所有的siRNA实验都是重复进行的，六个独立的siRNA实验的结果ABCC6P1型击倒率>60%用于统计分析。

定量RT-PCR

用于基因表达谱ABCC6公司和ABCC6P1型在不同的人类组织中，从克隆泰克的人类总RNA主面板II的每种组织类型中提取1μg总RNA，为了定量siRNA实验中的转录水平，使用Omniscript（Qiagen）和oligo-dT引物逆转录HepG2细胞的150–250 ng总RNA。为了定量所选基因的转录水平，在7900HT快速实时PCR系统（应用生物系统）上使用标准条件进行实时PCR。使用了以下TaqMan-primer/探针（Applied Biosystems）：ABCC6P1（由Applied Biosystems设计）：正向引物5'-CACTCACTGCCTGGTGTA-3'，反向引物5'-CTCCCTGGAAATCATGATGTAGT-3'，FAM-reporter探针5'-CTGGGATGCCTTCTG-3'（靶向外显子边界9/10ABCC6P1型),ABCC6公司（检测ID:Hs01081199_m1，靶向外显子边界25/26ABCC6公司)，亲环素B(PPIB公司)（测定ID:Hs00168719_m1），β-肌动蛋白（ACTB）（化验ID:Hs99999903_m1），GAPDH公司（分析ID:Hs99999905_m1）。所有RT-PCR实验至少进行两次。

基因/假基因表达水平的统计分析和计算

使用ΔΔ-ct方法计算两个看家基因β-actin和亲环素B的相对转录水平。使用SPSS软件包计算平均值、p值和置信区间。

作者的贡献

APP、MH、PK、WEK设计了该研究。EJ、KBFH、PK、WEK监督了该项目。APP和JJW进行了生物信息分析。APP、MH进行了细胞培养、siRNA和基因表达实验。APP、MH、JJW、KBFH、WEK对数据进行了分析。APP、MH、EJ、WEK准备了手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。

补充材料

附加文件1：

ABC转运蛋白参考核苷酸序列中的重复元素。

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附加文件2：

以下5’UTR区域的比较ABCC6公司,ABCC6P1型和ABCC6P2型5’上游区域之间的整体同源性ABCC6公司和那些ABCC6P1型和ABCC6P2型分别为98.8%和99.5%。转录因子共识结合位点以绿黑色显示。重要的是，所有潜在的转录因子结合位点ABCC6公司除少数例外（糖皮质激素反应元件GR-2116 bp、八聚体结合因子oct-1-1746 bp、GATA-3共识位点-1269 bp和USF结合位点-622 bp），也存在于ABCC6P1型和ABCC6P2型非同源核苷酸是黑白的，是ABCC6公司显示为（+1）。

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附加文件3：

成员之间的相似性（%）澳大利亚商业银行10基因假基因簇。

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致谢

这项工作得到了挪威赫尔斯∅st RHF（200500428-243）和德国德意志联合会（KA 1078/4-1）的资助。我们感谢Runa Marie Grimholt提供的专家技术援助。

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文章来自BMC基因组学由以下人员提供BMC公司