美国国家科学院院刊。1997年9月2日；94(18): 9831–9835.
靶向消融维生素D受体：维生素D依赖性佝偻病II型伴脱发的动物模型
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李彦春
*马萨诸塞州总医院和哈佛医学院内分泌科，马萨诸塞州立大学波士顿水果街15号，邮编02114；†耶鲁大学医学院细胞生物学系，地址：333 Cedar Street，New Haven，CT 06510；‡汉堡大学医学院骨病理学系，德国汉堡Martinistrasse 52，20246；和§塔夫茨大学兽医学院和人类营养研究中心，711 Washington Street，Boston，MA 02111
艾莉森·皮尔罗
*马萨诸塞州总医院和哈佛医学院内分泌科，马萨诸塞州立大学波士顿水果街15号，邮编02114；†耶鲁大学医学院细胞生物学系，地址：333 Cedar Street，New Haven，CT 06510；‡汉堡大学医学院骨病理学系，德国汉堡Martinistrasse 52，20246；和§塔夫茨大学兽医学院和人类营养研究中心，711 Washington Street，Boston，MA 02111
迈克尔·阿姆林
*马萨诸塞州总医院和哈佛医学院内分泌科，马萨诸塞州立大学波士顿水果街15号，邮编02114；†耶鲁大学医学院细胞生物学系，地址：333 Cedar Street，New Haven，CT 06510；‡汉堡大学医学院骨病理学系，德国汉堡Martinistrasse 52，20246；和§塔夫茨大学兽医学院和人类营养研究中心，711 Washington Street，Boston，MA 02111
冈特·德林
*马萨诸塞州总医院和哈佛医学院内分泌科，马萨诸塞州立大学波士顿水果街15号，邮编02114；†耶鲁大学医学院细胞生物学系，地址：333 Cedar Street，New Haven，CT 06510；‡汉堡大学医学院骨病理学系，德国汉堡Martinistrasse 52，20246；和§塔夫茨大学兽医学院和人类营养研究中心，711 Washington Street，Boston，MA 02111
罗兰·拜伦
*马萨诸塞州总医院和哈佛医学院内分泌科，马萨诸塞州立大学波士顿水果街15号，邮编02114；†耶鲁大学医学院细胞生物学系，地址：333 Cedar Street，New Haven，CT 06510；‡汉堡大学医学院骨病理学系，德国汉堡Martinistrasse 52，20246；和§塔夫茨大学兽医学院和人类营养研究中心，711 Washington Street，Boston，MA 02111
罗德里克·布朗森
*马萨诸塞州总医院和哈佛医学院内分泌科，马萨诸塞州立大学波士顿水果街15号，邮编02114；†耶鲁大学医学院细胞生物学系，地址：333 Cedar Street，New Haven，CT 06510；‡汉堡大学医学院骨病理学系，德国汉堡Martinistrasse 52，20246；和§塔夫茨大学兽医学院和人类营养研究中心，711 Washington Street，Boston，MA 02111
玛丽·B·德迈
*马萨诸塞州总医院和哈佛医学院内分泌科，马萨诸塞州立大学波士顿水果街15号，邮编02114；†耶鲁大学医学院细胞生物学系，地址：333 Cedar Street，New Haven，CT 06510；‡汉堡大学医学院骨病理学系，德国汉堡Martinistrasse 52，20246；和§塔夫茨大学兽医学院和人类营养研究中心，711 Washington Street，Boston，MA 02111
*马萨诸塞州总医院和哈佛医学院内分泌科，马萨诸塞州立大学波士顿水果街15号，邮编02114；†耶鲁大学医学院细胞生物学系，地址：333 Cedar Street，New Haven，CT 06510；‡汉堡大学医学院骨病理学系，德国汉堡Martinistrasse 52，20246；和§塔夫茨大学兽医学院和人类营养研究中心，711 Washington Street，Boston，MA 02111
由德克萨斯州休斯顿贝勒医学院Bert W.O'Malley编辑，1997年7月1日批准
摘要
维生素D是控制矿物质离子稳态的主要类固醇激素，通过维生素D受体（VDR）发挥作用。VDR在许多组织中表达，包括一些不被认为在矿物代谢中起作用的组织。对VDR突变家族（维生素D依赖性佝偻病II型，VDDR II）的研究表明，低钙血症、甲状旁腺功能亢进、佝偻病和骨软化症。脱发不是维生素D缺乏症的特征，在某些家族中可见。我们通过靶向消融VDR DNA结合域的第二锌指，建立了VDDR II小鼠模型。尽管已知VDR在胎儿期的表达，但纯合小鼠在出生时的表型正常，并显示正常生存至少6个月。他们在21天大时出现低钙血症，这时他们的甲状旁腺激素（PTH）水平开始升高。甲状旁腺功能亢进伴随着甲状旁腺体大小的增加以及甲状旁旁腺素mRNA水平的增加。第35天出现佝偻病和骨软化症；然而，早在第15天，生长板中肥大软骨细胞区就出现扩张。与通过饮食方式导致维生素D缺乏的动物相比，像VDDR II患者一样，这些小鼠从4周龄开始出现进行性脱发。
1,25-二羟基维生素D是主要的类固醇激素，在矿物质离子稳态中发挥作用。其作用被认为由核受体维生素D受体（VDR）介导，该受体与维甲酸X受体异二聚体化，并与靶基因上的特定DNA序列相互作用。VDR在进化上非常保守，在两栖动物的早期发育中表达(1)，哺乳动物(2)、和鸟类(三,4). VDR除了在肠道、骨骼和甲状旁腺中表达外，还存在于一些组织中，这些组织被认为在矿物离子体内平衡中没有作用(5). 其在这些组织中的确切功能及其发育作用尚不清楚。
通过对维生素D缺乏动物的研究，人们对1,25-二羟维生素D的生理作用有了深入的了解(6–10)以及VDR突变的人类(11,12). 这些研究表明，1,25-二羟维生素D在肠道钙吸收中起着重要作用，缺乏活性激素或其核受体的动物会出现低钙血症、佝偻病、骨软化和甲状旁腺功能亢进。虽然在维生素D缺乏的大鼠中观察到类似银屑病的皮肤变化(13)在维生素D缺乏的情况下，在一些VDR突变的家族中未观察到脱发。
我们通过靶向消融编码维生素D依赖性佝偻病II型（VDDR II）DNA-结合域第二锌指的DNA，建立了VDDR II型的动物模型。由此产生的动物在出生时表现正常；然而，他们在出生后的第一个月内会出现低钙血症、甲状旁腺功能亢进和脱发。
材料和方法
VDR空白小鼠的生成。
从ROS 17/2.8细胞mRNA逆转录大鼠VDR cDNA的编码区，并通过PCR扩增，生成用于筛选129/sv小鼠基因组文库的探针（辛辛那提大学T.Doetschmann的馈赠）。经过1.2×10的筛选，分离出两个重叠克隆，其编码小鼠VDR基因第二锌指（外显子3）到终止密码子（外显码9）的序列6形成斑块的单位。5千字节Xba公司I片段，包含外显子3的内含子序列5′（包括噬菌体臂的部分聚链）和3.5kbXba公司将含有受体第4外显子和第5外显子的I片段（包括来自pUC 18的多连接子序列）亚克隆到Xho公司我和萨尔质粒pNeoTKXho的I位点（由加利福尼亚州帕萨迪纳加利福尼亚理工学院的Zhoufeng Chen善意提供）。该目标向量线性化为萨尔我通过电穿孔将其导入J1 ES细胞（由波士顿马萨诸塞州总医院En Li善意提供）。使用G418（250μg/ml）和更昔洛韦（2μM）进行8天的选择后，分离胚胎干细胞集落，并通过Southern分析筛选是否存在同源重组体。在筛选出的600个ES细胞克隆中，鉴定出17个经过同源重组的细胞系，其中16个具有单一的新霉素耐药基因拷贝。通过将重组ES细胞注射到3.5天的C57BL/6J小鼠囊胚中，并将囊胚重新植入假孕雌性小鼠，产生嵌合体小鼠。来自两个独立ES细胞克隆的嵌合体可进行生殖系传播。两个克隆的纯合受体消融后代表现出相同的表型。
动物维护。
用于产生嵌合体的小鼠来自Jackson实验室或Charles River实验室。所有小鼠都被保存在无病毒和无寄生虫屏障设施中。他们暴露于12小时的光/暗循环中，并允许自由接触高压灭菌水和食物。他们食用的普瑞纳高压灭菌啮齿类动物饮食（5010）每克含有1%的钙、0.67%的磷和4.4单位的维生素D。
血清化学。
使用大鼠甲状旁腺激素（PTH）（Corning）的双位点测定法测量甲状旁腺素水平。使用Ciba/Corning Ca测量电离钙水平2+/pH分析仪。用Cobas Mira分析仪（罗氏）测量血清磷值。
组织组织学和现场杂交。
从第70天的窝友身上整体取出甲状腺、甲状旁腺、气管和心脏，以便于标本定位，允许在同一平面上进行切片。标本在pH 7.2的PBS中的4%甲醛中固定过夜，处理后嵌入石蜡中，并用徕卡RM 202切片机切割成6μm的切片。现场杂交是使用35S-UTP标记的PTH cRNA探针由含有外显子2和3以及大鼠PTH基因相应干预序列的线性化质粒合成。用Sp6 RNA聚合酶合成正义探针，用T7 RNA聚合物合成反义探针。对于就地杂交(14)，将组织切片在65°C下培养45分钟。在脱蜡和复水后，用4%多聚甲醛在PBS中再次固定切片（15分钟），并按以下顺序处理：10μg/ml蛋白酶K在PBS（15 min）中；4%多聚甲醛在PBS中的溶液（10分钟）；PBS清洗（5分钟）；0.2 N HCl（10分钟）；PBS清洗（5分钟）；在0.3%醋酸酐中加入0.1 M三乙醇胺（10分钟）；和PBS清洗（5分钟）。然后用乙醇浓度增加（70、95和100%）对切片进行脱水，并在杂交之前进行空气干燥。
杂交在55°C、50%甲酰胺/10mM Tris·HCl、pH 7.6/1×Denhardt溶液/10%硫酸葡聚糖/600mM NaCl/0.25%SDS/200μg/ml tRNA的湿润室中进行过夜。杂交后，切片在50°C、5×SSC中冲洗，然后在50°C、2×SSC/50%甲酰胺中冲洗30分钟。然后在37°C下用10μg/ml RNase A在TNE（10 mM Tris●HCl，pH 7.6/500 mM NaCl/1 mM EDTA）中处理载玻片30分钟，并按以下顺序清洗：TNE（37°C，10分钟）；2×SSC（50°C，20分钟）；0.2×SSC，两次（50°C，20分钟）。脱水后，将载玻片风干并暴露于x射线胶片上进行放射自显影。然后将载玻片浸入NTB-2乳剂（柯达）中，并保存在4°C下，以暴露乳剂。显影后，用苏木精和伊红对载玻片进行反染色。
从15日龄和35日龄小鼠分离股骨、胫骨和腓骨，并在4°C的4%甲醛中固定18小时。在接触放射照相术（FaxitronContact，Faxitron，F.R.G.）和脱水后，将未钙化的骨骼嵌入甲基丙烯酸甲酯中，并在旋转切片机（Jung，Heidelberg，F.R.G）上制备5μm切片，如前所述(15). 切片用甲苯胺蓝、von Kossa或Goldner三色染色，并用蔡司显微镜（Carl Zeiss）进行评估。
结果
通过删除编码受体DNA-结合域第二锌指的基因组DNA的5-kb片段，生成VDR空（−/−）小鼠（图。). VDR消融的动物占杂合交配后代的22%，表明受体消融不会降低胚胎存活率。逆转录酶（RT）-PCR证明从野生型（+/+）和杂合型（+/−）小鼠的肠道和肾脏分离的RNA中存在野生型VDR转录物。通过−/−RNA生成截短的RT-PCR产物。序列分析表明，编码第二锌指的131 bp DNA缺失，导致帧移位，随后是下游12 bp的终止密码子。−/−动物在出生时与它们的+/+和+/-窝友无法区分；然而，从24天大的时候起，它们的生长速度就没有它们的+/+和+/-室友快，91天大时体重减轻了10%（图。一). 他们的胫骨和股骨大约比+/+和+/-窝友短15%。+/-小鼠的表型正常。尽管VDR−/−动物在第21天之前钙含量正常，但从那时起，它们逐渐出现低钙，使电离钙水平比其+/-和+/+窝友低约25%（图。B类). 伴随着低钙血症的发展，从第21天起，在−/−小鼠中观察到血清免疫反应性甲状旁腺素水平的逐渐增加（图。C). 第16天血清磷水平正常（+/+小鼠为9.6±0.2 mg/dl对9.5±0.9 mg/dl）；然而，随着免疫反应性甲状旁腺素水平的增加，−/−小鼠在第21天变得低磷酸盐血症（6.5±0.5 vs.10.5±0.6 mg/dl）。对第70天小鼠的甲状旁腺进行的检查显示，腺体大小以及PTH mRNA含量显著增加，评估方法如下：就地杂交（见图。). 根据连续切片上显示的腺体最大直径和腺体显示的切片数量，70天龄VDR消融小鼠的甲状旁腺大小增加了10倍以上。
VDR消融的靶向策略。(一)VDR消融靶向载体的构建。根据人类基因的结构和小鼠基因第3外显子到第9外显子的序列特征，显示了VDR基因的示意图。外显子编号并用实心框表示。显示了以下酶的部分限制性图谱：R，生态RI；X、，Xba公司我；S中，囊IXba公司星号表示的I位点来自噬菌体臂。5千字节Xba公司第3外显子和3.5-kb的I片段5′Xba公司以小鼠VDR基因第3外显子的I片段3′为靶序列。这个囊我-Xba公司I片段被用作鉴定同源重组体的探针。(B类)杂合交配后代尾部DNA的基因组Southern分析。DNA被消化生态RI并与外部探针杂交，如一野生型等位基因产生22-kb片段，同源重组产生的突变等位基因生成15-kb片段。野生型小鼠用+/+表示；杂合，通过+/-；和纯合受体消融小鼠，通过−/−。
VDR消融小鼠的生长和血清化学。(一)所有三种基因型的雄性小鼠在2至13周龄期间每周称重一次。野生型（方形）和杂合型（圆形）小鼠的生长速度相似；然而，纯合消融（钻石）小鼠在断奶后（21天大时）体重增长较慢。所有数值均基于三到五只动物，误差代表SEM。没有误差条表示SEM小于0.6的点。女性体重曲线的形状相似。(B类)从2周龄到13周龄，每周进行一次电离钙测量（以mmol/L为单位，校正pH值）。第14天在异氟醚麻醉下通过心脏穿刺获取样本。所有其他样品都是通过切尾获得的。野生型（方形）和杂合型（圆形）小鼠具有相似的水平，而纯合型小鼠（菱形）在断奶后出现低钙血症。所有值均表示基于三到五只动物的测量值的平均值和SEM。没有误差条表示SEM小于0.01的点。电离钙值无性别差异。(C)使用大鼠甲状旁腺素（PTH）测定法测量免疫反应性PTH值。野生型（正方形）和杂合子小鼠（数据未显示）的iPTH值在所有阶段均小于18pg/ml。维生素D受体消融小鼠（钻石）的iPTH水平在15和19日龄时与杂合子和野生型同卵鼠的iPTHs水平无明显区别，但到21日龄时开始升高。所有数值均基于同一基因型三只小鼠血清的平均值和扫描电镜。
现场用大鼠PTH探针对VDR消融小鼠的甲状旁腺进行杂交。(一)70日龄+/+小鼠甲状旁腺苏木精和伊红反染亮视野切片的25倍放大就地PTH mRNA(B类)暗场曝光一. (C)70日龄母鼠甲状旁腺苏木精和伊红反染亮视野切片的25倍放大就地PTH mRNA(D类)暗场曝光C。使用感测探头未观察到信号。
第35天胫骨的接触X线摄影显示，沿骨干（箭头）的皮质宽度减少，生长板扩张和扩张（箭头），与佝偻病一致（图。B类). 此时骨骼的组织学分析显示von Kossa评估的骨矿化减少（图。D类矿物染色黑色）和Goldner三色染色（未显示）。第35天检查生长板（图。F类)显示出明显的紊乱，血管（箭头）、基质（箭头）和肥大软骨细胞带增加。第15天同窝婴儿的胫骨和椎骨接触X线摄影和组织学检查未显示骨矿化缺陷（未显示）；然而，此时对生长板的检查显示，每根柱的肥大软骨细胞数量增加了15%（图。H（H），括号内）。在这两个时间点，+/-动物的骨骼与+/+对照组的骨骼无法区分。
VDR消融小鼠胫骨的接触放射学和组织学。(一)35天龄对照小鼠胫骨的接触x光片。(B类)35天大的同窝出生的−/−的胫骨的接触x光片。(C)35天龄对照小鼠胫骨非脱髓鞘切片的von Kossa染色。(D类)一名35天龄母鼠胫骨非脱髓鞘部分的von Kossa染色。(电子)甲苯胺蓝切片通过35日龄对照小鼠的生长板。(F类)甲苯胺蓝切片穿过35日龄−/−窝鼠的生长板。(G公司)甲苯胺蓝切片通过15日龄对照小鼠的生长板。(H（H）)甲苯胺蓝切片通过15日龄母鼠的生长板。
在4周龄时，VDR−/−小鼠开始出现口周和眶周脱发。如图所示。在接下来的3个月里，这种脱发会累及全身。与VDDR II家族不同，在−/−小鼠中可以均匀观察到脱发，但雌性小鼠的脱发进展比雄性更快。VDR−/−小鼠皮肤的组织学分析显示，毛囊扩张，形成真皮囊肿。
3.5个月龄VDR消融小鼠的外观。小鼠的基因型从左到右分别为野生型、杂合型和纯合型。
70天后处死的小鼠的大体和显微镜尸检仅显示上述病理变化。
讨论
尽管VDR在胚胎发育早期广泛表达，但在VDR−/-小鼠或VDDR II患者中未观察到重大发育异常。与饮食中维生素D缺乏的动物和VDDR II患者一样，VDR−/-小鼠在出生后出现低钙血症。鉴于观察到大鼠在出生后的前18天通过不饱和1,25-二羟维生素D非依赖机制发生肠道钙吸收，−/−小鼠出现低钙血症的时间并不意外(6). 这种不饱和成分一直减少到35天大，逐渐被依赖于1,25-二羟维生素D的饱和成分所取代，产后18天可以检测到。有趣的是，延迟1周断奶（第28天）无法防止生长迟缓和低钙血症的发生。在−/−小鼠中观察到的血清免疫反应性PTH水平的增加与低钙血症的发展相关；然而，未来的研究将需要解决这种增加是否仅仅是低钙血症的结果，或者是否缺乏抗增殖药物(16)和转录重压(17–19)1,25-二羟维生素D对甲状旁腺的影响也起作用。
有趣的是，我们在−/−小鼠中观察到的生长板异常早于紊乱的矿物离子稳态的发展，这一现象早在15天大时就已观察到。这些数据表明，尽管1,25-二羟维生素D的受体依赖性作用对正常胚胎发生没有必要，但它们可能在生长板的发育和成熟中起作用，甚至在正常的矿物离子内环境中也起作用。然而，到35天大时，观察到骨矿化减少，生长板出现严重异常。尽管−/−动物的骨体积没有减少，但到第35天，未矿化骨（类骨）的数量增加了15倍。钙素标记研究表明，这是由于矿物沉积受损所致。
功能性VDR的缺失已被证明是VDDR II疾病的分子基础。这些家族中的大多数特征性突变涉及受体DNA-结合域的点突变（参考文献综述）。23). 一些家族已被描述为受体的激素结合域发生点突变；然而，这些个体与那些具有DNA-结合域突变的个体之间没有明显的表型差异。我们引入的突变删除了DNA结合域的第二个锌指，导致帧移位，随后是提前终止密码子。这种突变产生的转录物明显不稳定（+/-小鼠中没有这种突变就证明了这一点），这让人想起人类VDR突变，导致荷尔蒙结合域中过早终止密码子，也被认为产生不稳定的mRNA转录物(24). VDDR II的特点是婴儿期出现低钙血症，伴有佝偻病、骨软化和继发性甲状旁腺功能亢进。VDDR II可在某些家族中观察到完全脱发。一些研究人员认为脱发的发展与更严重的1,25-二羟基维生素D耐药性有关(20). 它在这些家族中的存在与佝偻病的发展平行；然而，全脱发不是饮食维生素D缺乏症的特征，也不与其他低钙血症综合征相关。与VDR−/−小鼠一样，受影响的婴儿在出生时没有脱发，而是在婴儿期发展为渐进性脱发(12).
VDR在外根鞘角质形成细胞和毛囊毛乳头中表达(21). −/−小鼠和VDDR II家族继发性脱发的发生表明，VDR在毛发周期中而不是在初生毛发生长中起关键作用。在小鼠模型中，研究表明，在生长后期和退化期，毛囊中VDR的表达增加，与角质形成细胞的增殖减少和分化增加相关(21). 1,25-二羟维生素D对角质形成细胞分化和增殖的影响得到以下几个方面的支持在体外研究（参考文献。22). 虽然角质形成细胞能够合成1,25-二羟维生素D，这表明毛囊存在自分泌或旁分泌调节，但脱发不是饮食中维生素D严重缺乏的特征，也不是维生素D依赖性佝偻病I型患者家族中无法合成1α-羟基维生素D代谢物的特征。与核受体超家族的一些成员不同，VDR没有被证明具有配体诱导的转录活性；因此，在VDR缺乏而非配体缺乏的情况下发生脱发仍不清楚。阐明脱发的分子基础可能会揭示VDR对毛囊具有1,25-二羟维生素D非依赖性作用，或维生素D代谢物在皮肤中高浓度存在，即使在严重缺乏维生素D的情况下，也在头发周期的调节中起重要作用。
致谢
我们感谢H.Juppner博士和H.M.Kronenberg博士批判性地审阅了手稿，感谢E.Schipani博士和J.Lie博士就以下方面提出的建议就地杂交和组织学。我们感谢W.Simays的技术支持和J.Maclaughlin的磷测定。这项工作得到了国立卫生研究院拨款DK-46974（给医学博士）的支持。
脚注
本文直接（轨道II）提交给诉讼办公室。
缩写：甲状旁腺素；VDDR II，维生素D依赖性佝偻病II型；维生素D受体；ES细胞，胚胎干细胞；+/+，+/−，分别消融了野生型、杂合型和纯合型VDR。
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