小鼠肿瘤氧合和糖酵解活性的低场顺磁共振成像

摘要

介绍

当肿瘤生长到可检测的大小时，它在关键代谢物如氧气、葡萄糖、生长因子和其他营养物质中表现出明显的异质性(1). 在正常组织中，这种梯度距离血液供应约400μm，而在肿瘤中，这些梯度距离血液供给约200μm(2). 肿瘤表现出高水平的葡萄糖摄取和乳酸生成，反映出由于癌基因的激活或肿瘤抑制基因的缺失而向有氧糖酵解的转变(1,三–5). 这导致线粒体耗氧量减少，这可能是对低氧条件的适应性反应，使肿瘤细胞能够释放出稀少的氧气，以允许其他依赖氧气的关键细胞过程继续进行(6).

肿瘤内血管功能低下导致微环境变化(7). 肿瘤缺氧是因为新生血管变异，支持不良的血流模式(8). 虽然肿瘤可以诱导血管生成，但所形成的血管在结构和功能上都异常，导致肿瘤灌注的区域异质性显著。因此，肿瘤进展与血管生成和缺氧之间存在矛盾关系(9). 肿瘤中的纵向氧梯度是由于缺乏多余的小动脉网络导致扩散受限缺氧所致(10). 红细胞流量的波动会导致血管内氧变化，导致缺氧再氧(8). 红细胞流量的不稳定性实际上可能是肿瘤中的常态，导致氧分压的普遍不稳定（氧合；pO₂). 因此，血管淤滞可能不是短暂缺氧的唯一过程。被归类为放射生物学缺氧（pO）的肿瘤₂<10 mmHg）与不良治疗结果相关(11–13). 缺氧对肿瘤行为有着深刻的影响，利用缺氧预测肿瘤治疗反应的努力越来越重要(14,15). 缺氧的先验知识在治疗计划中具有重要价值，如使用缺氧细胞毒素和适当的放疗分期(13). 因此，能够无创定量监测活体组织氧状态的可靠技术将在临床前研究和最终在肿瘤学临床应用中发挥作用(16).

有几种方法可以监测组织pO₂在活体受试者中(16). 迄今为止，氧感应电极在人类肿瘤中提供了最多的数据(14,17,18). 在这个过程中，将细针电极插入可触及的肿瘤部位和pO₂沿2–3个特定轨迹在多个位置进行测量。而pO的电极测量₂是定量的，它本质上是一种侵入性程序，仅限于容易到达的肿瘤部位(19). pO₂尽管存在异质性肿瘤pO，但来自电极的信息仅限于针道沿线的组织₂所有方向的图案(15). 肿瘤pO₂也可以使用硝基杂环类药物进行评估，这些药物在生物还原性激活后会贪婪地结合缺氧细胞，并通过免疫组织化学分析的活体组织切片或通过正电子发射断层扫描的非侵入性方法进行量化¹⁸F-标记的硝基杂环类药物(20–22). 然而，激活与缺氧细胞结合的药物所需的特定酶反应的依赖性使得这些技术难以精确定量。根据最近针对临床应用开发/评估的方法总结(16)，pO的理想特性₂监测技术是：（a）该技术是非侵入性的，能够检测人体深处的部位；（b） 定量pO₂可在pO中精确测定₂范围为0–20 mmHg；（c） 该技术能够提供纵向测量、解剖学配准的pO₂三维地图，具有有用的空间和时间分辨率。

电子顺磁共振（EPR）是一种类似于核磁共振的光谱技术。EPR检测具有未配对电子的顺磁性物种，如过渡金属络合物和自由基。随着三芳甲基自由基（TAM）探针作为体内相容顺磁性示踪剂的最新可用性(23)，正在探索EPR成像（EPRI）来绘制活体动物的组织氧(24–26). TAM与溶解顺磁性氧的碰撞相互作用导致TAM谱线宽度变宽。TAM的EPR光谱展宽与氧浓度呈线性关系，提供了EPR测定组织pO的定量能力₂(27). 此外，使用磁场梯度，如在MRI中，可以在活体中获得TAM示踪剂的空间分布(28). 通过提取pO₂-依赖EPR线宽，pO₂可以生成主体内的贴图(25).

EPRI的图像提供了pO的地图₂他们缺乏MRI扫描提供的解剖学细节。因此，我们设计了一个EPRI加MRI组合系统，在两种模式下以300 MHz的共同频率运行，相应的磁场为10 mT（EPRI）和7 T（MRI）。采用共用谐振器的2种模式的顺序扫描可实现pO₂带有解剖学指导的地图。此外，从MRI收集的其他信息，如血流、血容量和水表观扩散系数（ADC），有助于更全面地了解肿瘤生理学。在本报告中，我们首次描述了脉冲EPR（也称为时域EPR）的实现和性能，即能够获得pO的临床前动物模型的氧气成像₂2D的地图几乎是实时的，3D的地图只需几分钟。此外，我们认为这可能是第一次根据pO选择感兴趣区域（ROI）₂并使用磁共振波谱（MRS）检测乳酸、胆碱等代谢物的水平，这些代谢物可能反映相同区域的糖酵解状态。这项研究的结果表明，（a）有可能在吸入的气体中使用EPR和空气/二氧化碳循环来获得与活体动物肿瘤中灌注受限缺氧有关的空间信息。（b） 血容量、血流量和pO之间的关系₂可以检查肿瘤的状态；即使在有血流的区域，也可能存在严重缺氧的情况。（c） 通过序列EPRI和MRS鉴定出高水平的乳酸指示糖酵解，即使在肿瘤的正常氧区也是如此。据我们所知，这是首次报告同时提供pO₂肿瘤特定区域的水平和乳酸水平，显示了完整动物肿瘤正常氧区有氧糖酵解的优势。

结果

本研究中使用的脉冲EPR系统（图​（图1A）1A） 已设计为达到5 ns的时间分辨率，允许跟踪pO₂-顺磁示踪剂的相关自旋动力学(29). 用含有3 mM氧敏顺磁示踪剂TAM的4管水溶液的模拟物体，与0%、1%、2%和5%的氧气平衡，以测试pO₂EPRI成像能力（图​（图1B）。1B） ●●●●。从EPR图像中，从绘制的ROI中提取光谱线宽，包括4个管子中的每一个，并根据氧气浓度绘制平均线宽值（图​（图1C）。1C） 。线宽和pO之间的线性关系₂，并且从实验结果中可以明显区分EPRI实验中3-4 mmHg的差异。随后，获得同一模型的质子MRI图像，并将其覆盖在pO上₂图像，最终生成解剖共注册的pO₂图像（图​（图1D）。1D） ●●●●。

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图1

脉冲EPR系统。

(A类)用于pO的EPRI光谱仪₂成像。氧气成像是使用在10 mT下工作的300 MHz脉冲EPR扫描仪进行的，其信号检测的时间分辨率为5 ns。(B)如图所示，氧气敏感探头TAM在不同氧气水平下平衡后，注入后获得4D（3D空间和1D光谱）EPR图像。TAM的空间分辨EPR线宽可以从EPR信号强度图像中提取，它与氧气分压呈线性关系(C类)因此，绝对pO₂地图(D类)可以通过对同一物体的序列MRI扫描获得解剖重叠。

EPR使用300 MHz的射频（RF）允许pO₂利用MRI对活物体的组织深处进行成像。对健康小鼠的尾静脉进行插管，以允许给予TAM作为EPRI的示踪剂。MRI的解剖图像（图​（图2A）2A） 来自健康小鼠的下半身和相应的pO₂EPRI地图（图​（图2B）2B） 正常肌肉组织氧合均匀（20.8±3.3 mmHg；n个= 6). 脉冲EPRI区分3至4毫米汞柱pO的能力₂这种差异及其对活体的适用性使我们有可能提供关于肿瘤缺氧的独特和临床有用的信息。图​图2C2C显示了鳞状细胞癌（SCC）荷瘤小鼠（植入右后腿）的MRI解剖图像，图​图2D2D表示相应的pO₂EPRI的地图。以前的研究表明，SCC肿瘤的大小为1cm^三表现出大量缺氧(25,30). pO无显著差异₂有或无肿瘤的正常肌肉组织之间的pO显著降低₂液位（10.5±3.6 mmHg；n个= 6;P（P）<0.01）（图​（图2E）。2E） ●●●●。

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图2

活体小鼠正常肌肉的EPR氧显像。

EPRI方法允许pO₂从健康小鼠的组织深处获得图谱。MRI的解剖图像(A类)健康小鼠的下半身（无肿瘤）和相应的pO₂EPRI地图(B)显示正常肌肉区域具有相对均匀的pO₂分配。解剖图像(C类)和pO₂图像(D类)也从SCC荷瘤小鼠的对侧正常腿中获得，并与健康小鼠进行比较。(E类)pO无显著差异₂正常肌肉组织之间存在或不存在肿瘤，而pO显著较低₂SCC小鼠肿瘤区域。

随着扫描仪的可用性和磁场强度的增加，使用MRI的解剖成像得到了显著改进。MRI在7 T时的工作射频为300 MHz，为MRI（7 T）和EPRI（10 mT₂EPRI使用相同的谐振器/机架。该功能允许从EPRI与MRI解剖图像可靠地对组织氧图进行配准，而无需在两个扫描程序之间移动谐振器/机架内的物体。基于这一概念，在荷瘤小鼠的实验模型中，通过脉冲EPRI、MRI解剖成像和使用血库对比剂的附加生理学研究，检验了评估肿瘤中放射生物学相关缺氧区域的能力。将荷瘤小鼠放置在谐振器中，使视野（FOV）跨越2条腿，躯干放在外面的平台上（图​（图3A）。三A） ●●●●。FOV中还包括两个含有水中TAM的试管（基准），以便两种成像设备都能检测到它们。图​图3B三B表示质子横向弛豫时间加权（T₂-加权）两条腿的轴向和冠状面MRI解剖图像（T₂是质子自旋-自旋弛豫时间）。可以清楚地看到携带肿瘤的腿，从中选择ROI。（EPRI研究在MRI之前进行，因此MRI中使用的对比剂对TAM的EPR光谱特性没有影响。）pO₂图中显示了在小鼠呼吸空气时，在同一视野中从EPRI获得的地图（轴向和冠状）​图3C。三C.来自pO₂地图上，可以看出肿瘤的显著区域是缺氧的。图​图3D三D显示了当呼吸气体转换为碳水化合物（95%O）时同一只老鼠的图像₂外加5%CO₂). pO₂EPRI的图谱显示，在这些条件下，肿瘤的很大一部分表现出氧含量增加，如频率直方图所示（图​（图3E）。三E） ●●●●。EPRI研究后，将装有小鼠的谐振器连同呼吸锥和静脉管路一起移动到机架上，并放置在7T MRI磁体中。获取解剖图像后（图​（图3B），三B） 通过尾静脉插管注入超小超顺磁性氧化铁（USPIO）溶液。USPIO，即T₂局限于血管系统的造影剂，降低血管的图像强度(31). 根据差异图像（对比剂给药前的图像-对比剂给药剂后的图像），可以计算出绝对血容量（图​（图3F）。三F） ●●●●。当与相应的解剖图像进行比较时，血量图像（图​（图3B）三B） 和pO₂图像（图​（图3，三，C和D）支持以下结论：（a）鳞状细胞癌包含非均匀血容量区域；（b） 即使在血容量较大的地区，也存在明显的缺氧；（c） 碳呼吸导致显著的pO₂肿瘤中缺氧区域的血管网络。当pO₂EPRI图像被转换为频率直方图（图​（图3E），三E） 可以看出，中值pO₂当小鼠呼吸空气时，该值从16.3±10.0 mmHg增加到35.5±17.4 mmHg，当小鼠呼吸碳水化合物时。通过碳呼吸，肿瘤区域内低于10mmHg的低氧部分的百分比也从35.1%降至7.2%。每个3D EPR图像需要8分钟才能采集，空间分辨率为1.8 mm。区分pO的能力₂误差限为±3-4 mmHg时，应能明确监测干预措施和药理学挑战引起的变化。

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图3

SCC荷瘤小鼠和正常小鼠腿部的体内氧标测，以及碳呼吸对肿瘤pO影响的可视化₂.

(A类)这是一幅卡通，展示了携带肿瘤的腿和正常腿的位置，以及EPRI和MRI联合使用的谐振器中的基准点(B)T型₂-加权解剖图像（轴向和冠状），其中可以清楚地区分肿瘤区域。明亮的小圆圈是EPRI和MRI联合登记的位置标记（基准）(C类)氧化铅₂呼吸医用空气时的图像（轴向和冠状）。(D类)氧化铅₂换气后30分钟的图像（轴位和冠状位）。(E类)pO直方图₂在同一只小鼠的肿瘤区域呼吸医用空气（蓝色）和碳水化合物（红色）。中值pO净增加₂在吸入二氧化碳时发现。(F类)冠状切片的血容量图像，肿瘤中心可见一条垂直运行的大血管。根据USPIO注射前后图像强度的差异计算血容量，因此取消了位置标记的图像强度。白线表示ROI。

将这些信息与MRI叠加的能力提供了研究pO之间关系的能力₂以及其他生理特性，如血容量和血流量，可以通过MRI常规获得。结果如图所示​图44这些能力的典型例子都是从同一种动物身上获得的。pO的轴位和冠状位图像₂EPRI的分布如图所示​图4D。4这些图像显示了轴位和冠状位的缺氧核心区域。在EPRI数据收集之后，进行了MRI研究，以获取解剖信息（图​（图4A）。4A） ●●●●。除了来自MRI的解剖信息外，血管造影可以可视化ROI中的主要血管（图​（图4B），4B） ，ADC图（图​（图4F）4F）(32,33)，这是通过动脉自旋标记获得的细胞数和血流的指标(34,35)（图​（图4G），4G） 共收集到个。扫描后，通过尾静脉插管给药USPIO混悬液以评估血容量（图​（图4，4、C和E）。图中所示的图像​图4，4通过MRI和pO的各种方式获得₂地图（图​（图4D），4D） ，就灌注相关参数和相应pO之间的关系对肿瘤生理学进行更全面的评估₂.在pO中₂EPRI的地图显示，轴位和冠状位切片上确定的缺氧核心在空间上是一致的，并且与动脉自旋标记研究的相对低水平血流相一致（图​（图4G）4G） 以及缺乏主要血管（图​（图4B）。4B） ●●●●。血容量图像表示SCC肿瘤中的微血管密度（图​（图4，4、C和E）。图像数据表明，虽然低血容量与pO降低相关₂，血容量增加并不一定意味着pO增加₂ADC值可定量了解水分在组织微环境中沿扩散敏化梯度方向的扩散情况。由于水扩散的主要限制因素是细胞膜和核膜，因此ADC值对肿瘤细胞数、细胞内和细胞外含水量之比、细胞的极性和坏死的存在等固有特征敏感(32,33). ADC图（图​（图4F）4F） 与周围正常组织相比，肿瘤内的水扩散明显受限。与pO相比，ADC值在整个肿瘤区域的分布非常均匀₂分布与血流水平不均匀。辐射诱导的坏死导致ADC增加，在ADC中可以比肿瘤大小的变化更早地观察到变化，这使其成为肿瘤治疗反应的早期替代标志物(32,33). 实施与MRI图（如治疗前后获得的血容量和血流量）相结合的氧标测将有助于了解放射治疗的氧依赖性疗效。pO散点图₂图中显示了肿瘤区域ROI中的血容量和血流量​图5，5，A和B，以及平均pO₂计算了4只荷瘤小鼠在不同血容量分数下的数值（图​（图5C）5C） 和血流（图​（图5D）。5D） ●●●●。pO₂脉冲EPRI获得的值与肿瘤血管呈正相关，但不是线性相关，其中肿瘤缺氧明显只存在于血液灌注较弱的区域。值得注意的是，在血容量和血流量较高的地区，肿瘤的氧合状况相对较好。

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图4

pO的融合₂图像来源于EPRI和其他MRI流相关图像数据。

(A类)MRI T₂-加权解剖图像显示SCC肿瘤的选定ROI。(B)基于MRI T的肿瘤区域轮廓的MRI血管造影₂-加权解剖图像。(C类)MRI冠状动脉血容量图像。(D类)轴向和冠状pO₂EPRI绘制的地图(E类)MRI轴向血容量图像。(F类)MRI ADC图像（轴向）。(G公司)使用动脉自旋标记技术获得的MRI血流图像。

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图5

基于体素的pO相关性分析₂EPRI状态和MRI灌注相关参数。

pO₂根据血容量绘制SCC肿瘤区域ROI的EPRI值(A类)和血液流动(B)MRI图像中相应体素的值。基于体素的pO₂取4只不同荷瘤小鼠不同血容量分数的平均值(C类)和血流值(D类). 数据表示为平均值±标准偏差。

目前大多数癌症治疗策略和诊断工具都是基于在许多人类癌症细胞系中常见的特征表型。肿瘤的一个常见表型是有氧糖酵解，也称为“Warburg效应”(三,4,36). 肿瘤细胞主要通过将葡萄糖直接代谢为乳酸来满足其能量（ATP）需求，即使在有足够氧气的情况下，正常组织也不例外，正常组织通过将葡萄糖代谢为线粒体中的二氧化碳和水，通过氧依赖途径产生大部分ATP。图​图6A6A显示了3种不同的ROI（2.5×2.5×2.5 mm^三立方体）对于MRS，根据pO选择的位置₂状态（图​（图6B），6B） ，以及核磁共振成像的血容量水平（图​（图6C）。6C） 。从所选ROI获得的MRS光谱中可以清楚地看到典型的代谢物峰，如乳酸、肌酸和总胆碱（图​（图6D）。6D） ●●●●。pO较高的肿瘤区域₂（22.8 mmHg）含有明显高水平的乳酸，表明在正常的肿瘤区域有氧糖酵解过程占优势。如图所示，放射生物氧合区（>10 mmHg）的平均乳酸峰面积显著高于缺氧区（<10 mmHg）​图6E。6E.乳酸含量的差异可以用血供和营养供应有限来解释，即根据这些区域的血容量差异估计缺氧区域的葡萄糖供应有限。图中描述的研究​图22–6，通过图中的标准模型验证​图1，1表明pO中有价值的生理信息₂我们首次开发的脉冲EPR氧成像技术可以令人满意地提供图像。氧状态可以与从MRI/MRS获得的大量相关生理和代谢信息相结合，以获得对肿瘤生理学的更全面了解。

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图6

pO的图像₂肿瘤中的分布和代谢物水平。

(A类)T型₂-SCC荷瘤小鼠的MRI加权解剖图像和MRS的ROI位置(B)EPRI pO公司₂同一动物的地图和为MRS选择的相应ROI(C类)使用USPIO的切片血容量图像和对应的1–3号MRS ROIA类–C类对应于中的数字1–3D类. (D类)从具有不同pO的3个不同肿瘤区域获得的代表性MRS光谱₂和血容量水平。(E类)从放射生物学低氧（<10 mmHg）和常氧（>10 mmHg）区域获得的MRS光谱的平均乳酸峰面积。即使在氧合良好的肿瘤区域也检测到高水平的乳酸生成。BV，血容量；Cr，肌酸；乳酸；tCho，总胆碱。

讨论

本研究开发了一种使用脉冲EPRI定量测定组织pO的方法₂分布敏感，尤其在肿瘤放射生物学缺氧区。本研究中基于脉冲EPR的技术的实施，结合最近可用的具有长期有效质子横向弛豫时间（T₂*)使这种能力成为可能(29). 使用氧敏EPR示踪剂TAM，在不同pO水平下平衡来自定义的模型物体的基于EPRI的脉冲图像₂，用于提取pO₂通过监测T的氧依赖性缩短值₂*TAM的。合成的氧气图表明可以监测pO的变化₂±3 mmHg。这种能力使得在绝对pO上区分肿瘤中放射生物学缺氧区域成为可能₂此外，由于10 mT的EPRI和7 T的MRI之间的射频是通用的，因此在300 MHz调谐的共振器可用于EPRI与MRI。这为pO提供了有用的功能₂图像应可靠地覆盖来自MRI的解剖和其他生理信息，如血容量、血流灌注等，而无需从谐振器中取出物体。因此，有可能理解绝对组织pO之间的关系₂与灌注相关参数的水平。

pO₂肿瘤EPRI图谱显示pO的分布不均匀₂级别。有些区域氧合相对良好，也有明显的缺氧区域。有趣的是，吸入碳水化合物后，pO显著增加₂在解剖和灌注相关图像中识别的主要血管周围发现。这些区域可能代表短暂缺氧组织的区域(37). 主要血管远端区域的pO没有增加₂，这可能是由于存在纵向pO₂梯度(10). 当血管氧含量保持较低时，氧的径向扩散距离变短。Sorg等人使用窗口室模型证明，高氧气体对组织pO有影响₂靠近传入供血血管，但对下游血管几乎没有影响(38). Dunn等人报道了糖原以位置依赖的方式产生的血管收缩作用，导致肿瘤血流量减少(39)这也可能是pO缺乏改善的原因₂通过碳呼吸。pO₂从小鼠呼吸空气和碳水化合物获得的图像可以转换为频率直方图，类似于电极或光学探针获得的数据，它们不能提供pO的空间信息₂而是采样区域的一般分布。中值pO₂与早期结果一致，呼吸二氧化碳时肿瘤的数值显著高于呼吸空气时的数值(30).

肿瘤缺氧空间分布的先验信息有可能提高调强放射治疗（IMRT）的疗效，它可以调节来自多个方向的入射辐射束的强度，并可用于实现与靶肿瘤产生的剂量分布的更高程度的空间一致性。一般来说，在IMRT中，剂量分布被调整为在主要靶区具有高剂量辐射，而在肿瘤周围特别关键的结构中具有低剂量辐射。在一些初步研究中，pO₂基于信息的逆IMRT计划据说可以提高均匀辐射的治疗效率(40–42)但其益处尚不明确，需要更多调查。在以前的研究中，pO₂信息来自侵入性Eppendorf电极或MRI图像，假设肿瘤中的MRI对比剂（如Gd-DTPA）浓度与氧张力有关(41,42). 通过脉冲EPRI技术进行的绝对和快速的3D氧气映射可以帮助验证pO的有用性₂-基于IMRT。

最近，肿瘤pO的暂时改善₂通过抗血管生成药物来提高放射治疗的疗效越来越受到重视(43). pO的组合₂通过EPRI获得的图谱和通过MRI获得的灌注加权图像将有助于更好地了解肿瘤的氧气状态及其与其他血流和代谢谱的关系，从而有可能更详细地规划抗癌药物和放射的联合治疗。

肿瘤中能量产生从氧化磷酸化转变为糖酵解，为利用正电子发射断层扫描术诊断癌症提供了巨大的机会¹⁸氟脱氧葡萄糖。由于乳酸是糖酵解的最终产物，在正常组织中很少观察到强峰值，因此它提供了可靠的MRS标记物来区分肿瘤和正常组织的存在。有趣的是，在临床MRS中，对于乳酸是否是非氧化糖酵解的最终产物，以及乳酸的存在是否与低pO相关，存在着相当大的争议₂肿瘤中可能存在的水平或缺氧(44,45). EPR氧显像和MRS在本研究中的结合清楚无创地显示，即使在氧合良好的区域，肿瘤也会产生乳酸。因此，氧显像的非侵入性工具有助于准确了解本研究中显示的肿瘤代谢。

总之，这是一种快速、无创的获取pO定量图谱的方法₂在肿瘤区域，提出了与解剖学相结合的精确识别放射生物学缺氧区域以及短暂缺氧与慢性缺氧的方法。这种方法提供了这种能力，因此可能代表一种潜在的临床有用的模式，可以通过单独放疗或联合化疗来帮助实体肿瘤的治疗规划。此外，该方法也有助于更好地理解pO之间的关系₂状态和肿瘤特异性表型，如有氧糖酵解。

方法

致谢

脚注

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