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发展。作者手稿；PMC 2008年4月10日提供。
以最终编辑形式发布为：
发展。2000年3月；127(6): 1173–1183.
数字对象标识：10.1242/dev.127.6.1173
预防性维修识别码：项目经理2292107
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院43286
PMID：10683171

内胚层结节相关信号与中胚层诱导爪蟾

埃里克·阿吉乌斯,*‡ 迈克尔·欧尔盖施拉格,* 奥利弗·威塞利,卡罗琳·坎普，以及E.M.德罗伯茨§
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

总结

在爪蟾内胚层在囊胚期对中胚层的诱导作用已有大量文献报道，但内源性诱导信号的分子性质尚不清楚。Cerberus的羧基末端片段，命名为Cer-S，提供了一种中胚层诱导的特异分泌性拮抗剂爪蟾节点相关（Xnr）因素。Cer-S不抑制其他中胚层诱导剂如Activin、Derrieère、Vg1和BMP4的信号传导，也不抑制神经诱导剂Xnr3的信号传导。在本研究中，我们发现Cer-S阻断了动物-植物Nieuwkoop型重组体中背部和腹部中胚层的诱导。囊胚期Xnr1、Xnr2和Xnr4号机组在内胚层细胞中以从背到腹的梯度表达。剂量反应实验使用cer-S标准mRNA注射支持Xnrs内源性活性梯度的存在。植物决定因子VegT和Vg1与背侧β-catenin协同作用可激活囊胚的Xnr表达。数据支持中胚层诱导的修正模型爪蟾中胚层诱导是由囊胚期内胚层释放的多个结节相关信号的梯度介导的。

关键词：中胚层诱导、Nodal、Xnr、Cerberus、TGF-β、Derrieère、Activin、VegT、β-catenin、Vg1、Cer-S

简介

两栖类胚胎为研究胚胎模式的早期阶段提供了一个非常有用的模型系统。Nieuwkoop、Slack及其同事的开创性工作导致了目前中胚层诱导和模式化的三信号模型（由Nieuwkoop，1973年;Slack，1991年a;凯斯勒和梅尔顿，1994年;希斯曼，1997). 利用囊胚内胚层和外胚层外植体的重组体，表明中胚层是通过内胚层的诱导信号产生的(Nieuwkoop，1969年;斯莱克，1991b). 内胚层被认为会释放两个信号：第一，一个均匀或腹侧的内胚层信号，诱导腹侧中胚层，如侧板、间充质和血液；第二，一个发自背侧内胚层的信号，诱导上覆中胚层的背侧组织者组织（Nieuwkoop，1969,1973;Boterenbiud和Nieuwkoop，1973年;哈兰德和格哈特，1997年;希斯曼，1997). 该模型中的第三个信号，也称为水平信号，在原肠胚形成期间来自背侧组织，能够诱导腹侧中胚层细胞中脊索、体节和肾脏等背侧组织类型的分化(Smith and Slack，1983年;哈兰德和格哈特，1997年;希斯曼，1997). Spemann的组织者分泌的许多分子被认为参与了第三个信号(De Robertis等人，1997年;哈兰德和格哈特，1997年).

该领域的最新进展是认识到内胚层诱导中胚层信号的产生依赖于母体编码的转录调节因子的活性。植物外植体耗尽β-连环蛋白反义寡核苷酸mRNA不能释放Nieuwkoop的背侧信号(Heasman等人，1994年). 最近的一项研究表明β-连环蛋白直到中囊胚转变后才释放通路(Wylie等人，1996年). 这一基于使用异慢性动植物结合物的发现对本分析很重要，因为它表明，与先前的观点相反，中胚层诱导可能由合子表达基因介导(希斯曼，1997). 寡核苷酸耗竭实验也表明VegT公司，一种转录因子，母体储存于爪蟾卵，是植物外植体释放腹侧和背侧中胚层诱导信号所必需的(Zhang等人，1998年).

尽管付出了巨大的努力，但介导前两个感应信号的分子爪蟾模型仍然未知。迄今为止，已确定了许多具有中胚层诱导活性的生长因子，如FGF、Activin、Vg1、，爪蟾结节相关因素（Xnrs）和Derrieère(松懈，1991a;史密斯，1995;汤姆森和梅尔顿，1993年;Jones等人，1995年;Sun等人，1999年). 有证据表明，激活素和FGF都不可能是内胚层释放的内源性中胚层诱导物，因为中胚层的诱导不能被卵泡抑素（激活素与BMP抑制剂）或FGF阻断抗体所阻断(斯莱克，1991b). 有趣的是，增加Activin对囊胚动物帽细胞的剂量可以诱导整个范围的中胚层衍生物，低剂量时为腹侧细胞类型，高剂量时为背侧细胞类型(格林和史密斯，1990年;格林等人，1992年;史密斯，1995). 转化生长因子β（TGF-β）超家族的其他已知中胚层诱导因子-Vg1、Xnrs和Derrière与激活素具有诱导腹侧和背侧中胚层的能力。

在小鼠和斑马鱼中，遗传研究强烈表明结节信号通路在中胚层形成中起着中心作用(Zhou等人，1993年;Conlon等人，1994年; Waldtrip等人，1998年；野村和李，1998年;Song等人，1999年;Sampath等人，1998年;Rebaglati等人，1998年;Feldman等人，1998年;Gritsman等人，1999年). 在爪蟾，迄今已鉴定出四个Xnr基因。其中三个，Xnr1、Xnr2和Xnr4号机组是中胚层诱导因子(Jones等人，1995年;Joseph和Melton，1997年;Osada和Wright，1999年).Xnr3号机组尽管与其他Xnr具有相同的序列，但由于其缺乏中胚层诱导能力，充当神经诱导剂，并且处于不同的调控控制之下，因此具有非常不同的活性(Smith等人，1995年;Ecochard等人，1995年;Hansen等人，1997年;McKendry等人，1997年). 三个中胚层诱导Xnr基因的存在，可能还有其他尚未确定的基因，使得爪蟾功能丧失研究很困难。

Cerberus是一种头部诱导分泌因子(Bouwmeester等人，1996年)作为结节、BMP（骨形态发生蛋白）和Wnt信号的多功能拮抗剂(Hsu等人，1998年;Piccolo等人，1999年). Cerberus的羧基末端片段，称为Cerberus short（Cer-S），缺乏抗Wnt和抗BMP活性，但保留了完全的抗Xnr1活性(Piccolo等人，1999年). 在生化研究中，发现Cer-S结合Xnr1，但不结合Activin或Vg1蛋白(Piccolo等人，1999年).

在本研究中，我们使用cer-S标准试剂作为Xnr信号的特定抑制剂。在Nieuwkoop动植物重组体中，cer-S标准能够阻断背侧和腹侧内胚层碎片对中胚层的诱导。还发现内源性Xnr1、Xnr2和Xnr4号机组以分级方式在囊胚内胚层中合子表达，在背部内胚层表达最大，即在适当的时间和位置介导中胚层诱导。的表达式Xnr1、Xnr2和Xnr4号机组转录起始于中胚层，可被植物定位的决定因子协同激活素食主义者T和Vg1型(Zhang等人，1998年;约瑟夫和梅尔顿，1998年)与背行列式一起作用β-连环蛋白(Heasman等人，1994年;Schneider等人，1996年). 这些结果使我们提出爪蟾囊胚期内胚层释放的结节相关信号梯度可以提供三信号模型。

材料和方法

合成mRNA

质粒pCS2-cer-S标准，pCS2-Xnr1号机组，pCS2-Xnr2号机组，pCS2-A-Vg1型，pCS2-A鼠标节点，pCS2-tALK-4（车道4），pCS2-德里埃和pCS2-β-连环蛋白用线性化不是一、 和pCS2-VegT-En公司R（右）和pCS2-Sia-En公司R（右）用线性化囊II类；全部用SP6 RNA聚合酶转录(Piccolo等人，1999年). pcDNA-ΔN-XTcf-3型用线性化Xba公司并用T7聚合酶转录。ΔN-XTcf公司-3和德里埃质粒分别来自H·克利夫斯博士和H·L·西夫博士。pCS2型-En-VegT公司基本上按照Horb和Thomsen（1997）和pCS2-tAlk-4系列按照以下描述建造Chang等人（1997）.

胚胎操作

爪蟾通过体外受精获得的胚胎保存在0.1×Barth培养基中，并根据Nieuwkoop和Faber（1994）在4细胞期进行RNA注射。第8阶段，在1×Barth培养基中解剖植物外植体，并让其愈合10分钟。在CMFM/LCMR 1:1中切割动物帽(Piccolo等人，1999年)将其置于Terasaki平板（Nunc）中的植物外植体顶部2小时，然后通过RT-PCR处理或转移到0.3×Barth培养基中，直到36期进行组织学分析。对于环己酰亚胺（CHX）处理，在第8阶段切割瓶盖，用CHX（25μg/ml）预处理30分钟，用4 nM Vg1蛋白处理90分钟(Piccolo等人，1999年)和CHX（25μg/ml），然后进行RT-PCR处理。CHX治疗抑制[35S] 蛋氨酸和[35S] 半胱氨酸与蛋白质的结合率为94%。在半切胚上进行原位杂交，以观察内胚层细胞，如Belo等人所述(1997;http://www.lifesci.ucla.edu/hhmi/derobertis/index.html).

RT-PCR分析

用于RT-PCR的底漆组如下所示。激活素βB，288 bp，正向5′-CGATCGAGTTACATTGAC-3′，反向5′-CAATTGCAGCACGATTC-3′，30个周期。α-肌动蛋白，252 bp，正向5′-TCCTGTACGCTCTGGTCGTA-3′，反向5′-TCTCAAAAGTCCAAAGCATA-3′，20个周期。Brachyury公司(XBra系列)，319bp，正向5′-GCTGAAGTATGTGAATGGAG-3′，反向5′-TTAAGTGTAATCTCTTCA-3′，25个循环。腱蛋白(冠心病)，267 bp，正向5′-CCTCCAATCCAAGACTAG-3′，反向5′-GGAGGAGGAGCTTTGGGACAAG-3′，25个周期。德里埃，178 bp，正向5′-GACAGACAGAGAGAA-3′，反向5′-CTACAAATGATGCCT-3′，25个周期。Dickkopf1（Dkk1），255 bp，正向5′-CACACAGCAGGAGA-3′，反向5′-TCAGGAAGAGCA-3′，25个周期。伸长率α(EF1α)，221 bp，正向5′-CCTGAACCCAGGCCAGATTGGTG-3′，反向5′-GAGGGTAGAGAGAGACTCCACG-3′，20个周期。卵泡抑素，230 bp，正向5′-CAGTGCAGCGCGGAAAAAT-3′，反向5′-TGCGTGCGGTAATTAC-3′，30个周期。Frzb1号机组，200 bp，正向5′-GGAGATGCAGACTCCTCTGTCA-3′，反向5′-GACACTGGAGTAGCAGC-3′，25个周期。鹅科动物(全球供应链)，305 bp，正向5′-CACAAAAGTCGCAGAGTCTC-3′，反向5′-GGAGAGCAGAGTTGGGCCA-3′，25个周期。NCAM公司，138 bp，正向5′-GCGTGTACCTTAATAGTCA C-3′，反向5′-GGCTTTGGCTGGTTCTGAAGG-3′，25个周期。诺金，281 bp，正向5′-AGTTGAGATGTGCTCT-3′，反向5′-AGCCAAGTGTCCAG-3′，30个周期。鸟氨酸脱羧酶(ODC公司)，228 bp，正向5′-CACCTAGCTGTGTGG-3′，反向5′-CAACATGGAACTCACC-3′，25个周期。Siamois公司(新加坡)，205 bp，正向5′-AAGATAACTGATTCCTGAGC-3′，反向5′-GGTAGGCTGTATTGAAGG-3′，25个周期。Vg1型，160 bp，正向5′-ATGCCTATTGCTTCTATTTGC-3′，反向5′-GGTTTACTCA-3′，25个周期。Xnr1号机组，190 bp，正向5′-AAGTCAGTCTCTGCCAAC-3′，反向5′-AGAGGTTCCCATTTCGAC-3′，25个周期。Xnr2号机组，211 bp，正向5′-TAAGGCTCTGTTGAAGAAG-3′，反向，5′-CGGGTCTTCTGGTATCTGTC-3′，25个周期。Xnr3号机组，219 bp，正向5′-CGAGTCAAGAGGTGGACA-3′，反向5′-ATCTTCATGGACACA GA-3′，25个周期。Xnr4号机组，300 bp，正向5′-GAATGGAGGTGATGATGGTAGAC-3′，反向，5′-GACACATCATCACTGCTG-3′，25个周期。

结果

Cer-S是Xnrs和组织者形成的抑制剂

这项调查的出发点是观察到cer-S标准mRNA微注射阻断背唇的形成和鹅绒的和其他Spemann组织者标记(图1A-D和G，车道1和2）。先前的生化研究表明，Cer-S分泌的蛋白与Xnr1蛋白（但不与其他中胚层诱导因子，如Activin、Vg1和BMP4）结合，并在亚纳米摩尔范围内抑制其活性(Piccolo等人，1999年). 为了进一步测试cer-S标准当将合成mRNA注射到胚胎中时，我们使用了一种涉及异位囊胚唇形成的分析(Lustig等人，1996年). 仔细滴定各种TGF-β家族mRNA，并测定在8细胞期向单个动物卵裂球微量注射后诱导异位囊胚唇所需的mRNA数量。如所示图2A至D’激活素(格林等人，1992年;Gurdon等人，1995年),德里埃(Sun等人，1999年)和A-Vg1型(Piccolo等人，1999年;汤姆森和梅尔顿，1993年)mRNA不受联合注射铈硫mRNA，而Xnr1号机组被阻止。除了Xnr1号机组（50 pg），Xnr2号机组（150 pg）、Xnr4（50 pg）和小鼠节点（50 pg）mRNA(Jones等人，1995年;Zhou等人，1993年;Joseph和Melton，1997年;Conlon等人，1994年)在本次分析中也被阻断（数据未显示），证明铈硫是多个Xnrs的抑制剂。在Xnrs和其他TGF-β因子之间观察到的反应差异并不是由于注射的mRNA数量的差异，因为所有mRNA都被研磨到诱导异位嘴唇所需的最小剂量。此外Xnr1号机组或第个，共个Xnr4号机组仍被联合注射150 pg抑制cer-S标准mRNA，而德里埃mRNA（150pg）不受相同剂量的cer-S标准信使核糖核酸(图2和数据未显示）。

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Cer-S是结节相关因子的分泌抑制剂，抑制Spemann组织者的形成。（A、B）cer-S标准mRNA（在4细胞期向每个卵裂球放射状注射150pg）阻断背唇的形成。（C、D）全球供应链表达式被阻止cer-S标准即使经过氯化锂处理后全球供应链表达到整个中胚层（插图）。（E，F）ΔN-XTcf-3型mRNA（800pg放射状）抑制鹅膏状的表达和联合注射Xnr1号机组（50 pg）将其恢复到整个边缘区。（G） 第10阶段Spemann组织者标记的RT-PCR分析。第一道：整个胚胎。通道2：径向注入cer-S标准（总计600 pg）抑制组织者基因。通道3：径向注入Xnr1号机组信使核糖核酸（50pg）上调组织标志物。通道4：β-catenin途径拮抗剂ΔN-XTcf-3型（800pg）抑制组织标志物，与50pg共同注射可挽救组织标志物Xnr1号机组（第5车道）。Xnr1号机组作用于β-catenin途径下游或与之平行。Siamois公司(Lemaire等人，1995年)由β-catenin途径调节(Brannon等人，1997年)独立于Xnr信号。

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Cer-S抑制Xnrs公司但不是激活素，德里埃，Vg1和Xnr3号机组.共同注入cer-S标准mRNA（150pg进入单个动物卵裂球）通过以下途径抑制异位囊胚唇的形成Xnr1号机组（50 pg，D'），但不是激活素（30 pg），德里埃（150 pg）或A-Vg1型（50 pg）mRNA（A'-D'）。Xnr2号机组mRNA（150pg）也被抑制（数据未显示）。尽管每个TGF-βmRNA的使用剂量不同，但都进行了滴定，以引起类似的生物反应。tALK4（锁定4）（800 pg）mRNA阻断了所有测试的TGF-β中胚层诱导物（A“-D”）。由于瓶状细胞的顶端收缩，异位囊胚唇在注射的动物帽部区域被视为较暗的区域(Lustig等人，1996年). （E）Xnr3号机组（1.2纳克）是一种神经(NCAM公司)但不是中胚层(α-肌动蛋白)微注射动物帽中的诱导剂（第2和第3通道）。cer-S标准mRNA（600pg）不抑制Xnr3号机组动物帽的活动（第4和第5道）。EF1α用作加载控件。

Xnr3号机组是一种与Xnrs相关的基因，起神经诱导剂的作用(Hansen等人，1997年). 这个发现cer-S标准mRNA不抑制神经诱导Xnr3号机组(图2E，比较车道3和5）强烈支持以下观点cer-S标准是中胚层诱导结节相关因子的特异性拮抗剂。此外cer-S标准mRNA（600 pg）诱导动物帽子中的N-CAM(图2E，车道4）与之前的发现一致(Piccolo等人，1999年)那个铈硫缺乏抗BMP活性。尽管cer-S标准mRNA不阻断已知TGF-β中胚层诱导物的信号传导-激活素，德里埃，Vg1和骨形态发生蛋白4-目前尚不可能排除存在一种尚未发现的TGF-β中胚层诱导物，该诱导物可能被cer-S标准.在本研究中，请牢记此警告cer-S标准mRNA被认为是一种特异性抗Xnr试剂。

这个cer-S标准注入实验(图1A-D和G（第1和第2通道）表明，原肠胚期Spemann组织者的形成需要结节相关信号。在倒数实验中，径向注射Xnr1号机组4细胞胚胎每个卵裂球中的mRNA足以增加组织者标记基因的表达醋栗、冠心病、诺金、卵泡抑素、Frzb1、Dkk1和鹿属(图1G，车道3）。由于组织者组成需要活动β-连环蛋白通路(希斯曼，1997)，我们接下来问Xnr1号机组当这条通路被阻断时，能够挽救组织者组织的形成。微量注射特定抑制剂β-连环蛋白通路，ΔN-XTcf-3(Molenaar等人，1996年)，阻止了组织者的形成，可以通过联合注入Xnr1号机组信使核糖核酸(图1E、F和G，车道4和5）。

这些结果表明，Xnr信号对于Spemann组织者组织的形成是必要和充分的爪蟾原肠胚。The ability ofXnr1号机组用mRNA拯救胚胎组织ΔN-XTcf-3进一步表明Xnrs作用于β-catenin下游或平行，介导其某些生物活性。斑马鱼的遗传和微量注射实验结果与这种可能性一致(Fekany等人，1999年;Feldman等人，1998年).

Cer-S阻断Nieuwkoop重组体中胚层诱导

在爪蟾Spemann组织者组织是由背部内胚层诱导的。研究这一诱导事件的经典方法是Nieuwkoop动物-植物结合物。因此，我们使用了这个实验范式(Nieuwkoop，1969年;Wylie等人，1996年)研究内源性中胚层诱导信号的性质(图3A).

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Nieuwkoop动植物结合物中的Cer-S阻断了内源性中胚层诱导信号。（A） 实验设计。（B） 微量注射tALK4（锁定4）信使核糖核酸(500pg在8细胞期进入每只动物的卵裂球）阻断动物帽对内源性中胚层诱导信号的反应（比较第3和第4栏）。瓶盖与内胚层接触2小时，并与无内胚层培养的对照动物瓶盖进行比较（第2道）。EF1α是RNA回收的控制。（C） 1-4巷，未注射动物帽的Nieuwkoop重组体与注射有卵泡抑素（2 ng）或cer-S标准（600 pg）mRNA。请注意，在通道4中cer-S标准背部挡块(gsc、chd)，腹侧(Xwnt-8号机组)和泛中胚层(Xbra公司)标记，而在3号车道卵泡抑素mRNA只有轻微的背向作用（总结合物n个=45，两个实验）。这一数额卵泡抑素mRNA足以消除联合注射试验中激活素mRNA的活性（未显示）。5巷，背内胚层（Nieuwkoop中心）优先诱导组织者标记全球供应链和冠心病(n个=16，三个独立实验）。第7巷，腹侧内胚层诱导腹侧标记物Xwnt-8号机组和泛中胚层标记Xbra公司(n个=17). 6号和8号车道，cer-S标准内胚层片段中的信使核糖核酸可防止背侧和腹侧中胚层的诱导(n个=15个）。在第8阶段和第8.5阶段之间制备接合物，并在两小时后收获RNA。（D-G）在对照条件培养基或20nM Cer-S存在下缀合的植物片段的外部和组织学形态(Piccolo等人，1999年)蛋白质和培养至36期。请注意，对照组的切片包含肌肉（mu）、脊索（no）和一些神经组织（ne），而在蛋白质处理的样品中，动物帽仍然是非典型表皮（ae）和内胚层（en）(n个=26，三个独立实验）。（H） 用对照卵母细胞条件培养基（通道1）或增加Xnr1蛋白剂量（通道2-5）处理动物帽2小时(Piccolo等人，1999年). 增加Xnr1蛋白的浓度首先诱导腹侧中胚层标记，然后诱导背侧中胚叶标记，在培养2小时后产生阈值。

我们首先询问内胚层分泌的TGF-β样信号是否是中胚层诱导所必需的。为此，截短的激活素型IB受体(Chang等人，1997年)tALK4在接收信号的动物帽细胞中表达。如所示图3B,tALK4（锁定4）mRNA阻断泛中胚层标记物的诱导Xbra公司通过内源性内胚层信号。这意味着接触仅2小时后Nieuwkoop共轭物中就需要TGF-β信号传导，但无法区分涉及哪种因子，因为tALK4能够阻断中胚层诱导因子的信号传导激活素，德里埃，A-Vg1和Xnr1号机组(图2A“至D”).

接下来，我们通过显微注射来测试内胚层信号是否需要结节相关因子cer-S标准mRNA进入早期胚胎的植物极。这些胚胎的内胚层外植体在第8至8.5阶段制备，与未注射的动物帽重组，仅在与植物外植体接触2小时后进行分析；即，在体内发生中胚层诱导的时期(Wylie等人，1996年). 在动物帽片段中进行PCR，如下所述Wylie等人（1996年）; 为了控制解剖的准确性，对植物碎片进行了中胚层标记物分析Xbra公司和Xwnt8型，未在未注入或cer-S标准注射mRNA的植物外植体（未显示）。人们发现，在这些Nieuwkoop重组体中cer-S标准不仅抑制了组织者标记的诱导鹅绒的和冠心病，也包括腹侧标记Xwnt8型和泛中胚层标记Xbra公司(图3C，比较车道2和4）。作为阴性对照，我们使用卵泡抑素信使核糖核酸(图3C，车道3），Activin和BMPs抑制剂(哈兰德和格哈特，1997年)，未能阻止中胚层诱导，与之前的工作一致(斯莱克，1991b).

由于背部和腹部内胚层具有不同的诱导活性(Boterenbiud和Nieuwkoop，1973年)，我们使用背植物或腹植物内胚层外植体扩展了这些结果，在动物帽重组体中分别诱导了主要为背或腹中胚层(图3C，车道5和7）。的表达式cer-S标准内胚层mRNA通过背侧和腹侧内胚层片段抑制中胚层诱导(图3C，第6和第8车道）。

当内源性中胚层诱导信号在囊胚期释放时(Wylie等人，1996年)，我们测试了此时添加Cer-S蛋白是否可以阻止中胚层诱导。在20 nM Cer-S蛋白存在下重组动植物外植体(Piccolo等人，1999年)中囊胚（8期）。由此产生的结合物既不能形成背部中胚层，也不能形成腹部中胚层(图3D-G).

在互惠获得功能实验中，将Xnr1蛋白添加到第8阶段的动物帽子中，并孵育2小时。低浓度（2 nM）Xnr1蛋白诱导腹侧中胚层，高剂量（6 nM(图3H，3-5车道）。这些结果证实并扩展了Jones等人（1995），曾注射过Xnr2型mRNA。这里提出的功能丧失和获得实验表明，与淋巴结相关的信号对于在囊胚期诱导背部和腹部中胚层是必要的和充分的。

Xnrs在囊胚内胚层的分级表达

为了确定Xnrs是否在合适的时间和地点表达，以调节囊胚期的内源性诱导活动，我们重新检查了它们的表达模式。使用RT-PCR分析，Xnr1、Xnr2和Xnr4号机组发现在中胚层之后表达，与中胚层转变时转录的早期合子基因同时开始积累(图4A)例如涎腺(Lemaire等人，1995年;Brannon等人，1997年)和Xnr3号机组(Hansen等人，1997年;McKendry等人，1997年)它们是早期β-catenin信号传导的直接靶点。特定于组织者的标记，例如鹅科动物Xnrs后开始表示(图4A). 在第9阶段，当中胚层诱导发生时，胚胎解剖显示Xnr1、Xnr2和Xnr4号机组转录物在胚胎的背半部和植物区富集(图4B). 以前，在囊胚内胚层中检测到Xnr的表达，但被认为是一致的(Jones等人，1995年;Yasuo和Lemaire，1999年;Clements等人，1999年). 我们的结果表明，囊胚内胚层可能存在由多个结节相关因子组成的背腹梯度。

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内源性Xnrs在适当的时间和地点表达，起到中胚层诱导剂的作用。（A） RT-PCR分析不同发育阶段基因表达的时间进程(Nieuwkoop和Faber，1994年). 中胚层诱导剂Xnr1、Xnr2和Xnr4号机组同时启动合子表达Siamois公司和Xnr3号机组（在中囊胚后立即表达，是β-catenin调节的直接靶点）。ODC公司用作加载控件。（B） 9期胚胎解剖显示Xnr1、Xnr2和Xnr4号机组在内胚层表达，且在背侧高于腹侧。Vg1型在植物极中统一表示。（C-F）Xnr1号机组囊胚期胚胎的原位杂交显示出内胚层的表达梯度。（C） 第8期胚胎显示背部植物块（箭头）中有少量细胞核染色。（D） 8.5级囊胚，其中Xnr1号机组这种表达已经扩展到邻近的植物细胞。（E） 9期囊胚分级显示Xnr1号机组在胚胎内胚层表达。（F） 在Murray溶液中清除的9期胚胎的外部视图，以便可视化Xnr1号机组植物半球染色。在这个胚胎中，腹部侧的动物帽着色较多，可以清楚地与着色较少的背部侧区分开来。请注意Xnr1号机组在背侧的表达持续时间更长，并且达到比腹侧内胚层更高的水平。

为了证实囊胚内胚层中存在分级Xnr信号Xnr1号机组采用更灵敏的原位杂交程序对胚胎进行了重新检查，其中胚胎被固定和半切，以便于探针穿透内胚层细胞。如图所示图4C,Xnr1号机组在胚胎一侧的大卵黄内胚层细胞表面的中囊胚开始表达。使用具有明显背腹极性的定期切割色素胚胎，我们确定这些细胞位于背侧。表达细胞对应于表面细胞，其中细胞核移位β-连环蛋白由首次发现Schneider等人（1996）在8.5阶段，Xnr1号机组转录物扩展到更深的相邻细胞(图4D). 在第9阶段，Xnr1号机组在整个植物体中检测到表达，但仍显示从背向腹的梯度表达(图4E). 在第9阶段，这种分级表达也可以在用Murray溶液处理后变得透明的胚胎的外部视图中看到(图4F). 原肠期Xnr1号机组如前所述，在内胚层中无法检测到转录物，而是在背缘区发现转录物(Jones等人，1995年和数据未显示）。

我们得出结论，Xnrs在正确的时间和地点表达，以参与内胚层诱导中胚层。在以下情况下Xnr1号机组原位杂交表明，不仅可以通过增加背侧mRNA水平，还可以通过延长其在背内胚层的表达时间来建立活性梯度。

cer-S标准阻碍Xbra公司剂量依赖性表达

为了测试Xnr活性的可能梯度，我们检测了Xbra公司增加剂量的表达cer-S标准.植物注射cer-S标准mRNA在4细胞期进入每个卵裂球(图5A)导致了Xbra公司原肠胚期边缘区的表达(图5B-F). 最高浓度（每卵裂球150 pg）Xbra公司表达被废除。这个实验设计遵循了Thisse和Thisse（1999），他将其用于通过以下方法抑制斑马鱼中胚层的形成抗病毒素，一种TGF-β型分子，可以阻断激活素和节点通过与激活素受体的相互作用发出信号(Meno等人，1999年). 使用lacZ公司mRNA作为谱系示踪剂，发现在中等剂量下Xbra公司在胚胎腹侧被抑制(图4F). 由于低剂量抑制腹侧和高剂量抑制背侧，这些结果强烈支持Xnr活性存在背腹梯度的观点。

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注射cer-S标准mRNA剂量依赖性降低原肠胚中Xbra的表达。胚胎在4细胞期径向注入植物极，然后进行处理Xbra公司10.5期原位染色。（A） 对照未注射胚胎，Xbra公司表达为中胚层环。（B-E）胚胎注射越来越多的cer-S标准mRNA，显示Xbra公司表达域。（F） 胚胎注射400 pgcer-S标准mRNA在4细胞期lacZ公司在32细胞期将示踪剂mRNA导入卵裂球C4。在该侧视图中，白色箭头表示lacZ公司在腹侧（注意动物帽中的色素也标记腹侧），黑色箭头指向Xbra公司背侧转录本(n个=51). （G） RT-PCR分析爪蟾胚胎注射600 pgcer-S标准mRNA。RNA是从未注射的对照或cer-S标准-在8.5（车道1、2）、9.0（车道3、4）和9.5（车道5、6）阶段每隔一小时注射胚胎。序号1，2和4转录本最初不被抑制cer-S标准（通道1、2），但在后期减少（描述了Nodal相关基因表达的正反馈回路；Meno等人，1999年). 重要的是德里埃、Vg1、VegT和Xnr3号机组保持不变，以及激活素βB仅部分减少。请注意cer-S标准mRNA抑制Xbra公司还有那个cer-S标准可以抑制Xbra公司即使在存在德里埃，激进分子和Vg1型抄本。

最近的研究涉及爪蟾胚胎已经表明，内胚层发育的某些方面需要细胞与细胞的相互作用(Yasuo和Lemaire，1999年;Clements等人，1999年). 测试是否cer-S标准mRNA影响已知TGF-β中胚层诱导候选基因的中胚泡后表达，我们分析了放射状注射150 pg的胚胎cer-S标准mRNA。如所示图5G，的初始表达式Xnr1、Xnr2和Xnr4号机组未被禁止cer-S标准在8.5期，但在囊胚后期下降。这种抑制作用可以用斑马鱼结节相关基因的正反馈回路来解释(Meno等人，1999年). 重要的是德里埃(Sun等人，1999年)没有受到影响，并且激活素βB(Dohrmann等人，1993年)仅部分减少了cer-S标准mRNA注射。成绩单等级VegT，Vg1和Xnr3号机组没有受到影响，而Xbra公司在囊胚期被cer-S标准信使核糖核酸(图5G).

这些微量注射实验表明Xbra公司通过cer-S标准在完整的胚胎中。值得注意的是，中胚层形成的阻滞是在假定的中胚层诱导mRNA持续表达的情况下发生的激活素derrière和Vg1型囊胚期(图5G). 结果表明，中胚层诱导爪蟾要求内生活动梯度为Xnrs公司。

产妇决定因素β-连环蛋白，VegT和Vg1型调节Xnr表达

寡核苷酸缺失实验表明，两种母体mRNA，β-连环蛋白和VegT公司在Nieuwkoop结合物中产生合子中胚层诱导信号所必需的(Wylie等人，1996年;Zhang等人，1998年). 为了研究这些细胞内分子是否在囊胚期作为Xnr表达的上游调节器，我们进行了如下所示的增益和损失功能分析：图6在第9阶段Xnr1号机组在整个胚胎中增加了β-连环蛋白mRNA和显性负性降低ΔN-XTcf-3mRNA注射(图6A，4-6车道）。β-catenin途径对Xnr表达的这种需求是暂时的，在第10阶段不再出现(图6A，车道7-9），表明存在额外的、β-catenin独立的调控机制。

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的合子表达Xnr1号机组由β-catenin、VegT和Vg1调节。（A）Xnr1号机组被上调β-连环蛋白（200 pg）并被Δ抑制N-XTcf-3型放射状注射胚胎9期（4-6道）mRNA（800pg）。然而，在第10阶段，Xnr1号机组即使在ΔN-XTcf-3型; 这与这些腹化胚胎腹侧中胚层的形成是一致的。产妇Vg1型不受影响。（B） 4细胞期放射状注射800pg全胚胎VegT-En公司R（右）mRNA（通道2），2 ngtALK4（锁定4）（车道3），或120 pgSia-En公司R（右）（车道4），并在第9阶段通过RT-PCR进行分析。Xnr1号机组需要VegT活性和TGF-β样信号传导才能在囊胚期表达。Xnr1号机组囊胚的表达不依赖于Siamois活性，因为它不会被Sia En公司R（右）mRNA。（C） 动物帽实验表明VegT公司mRNA（200pg）能弱诱导Xnr1号机组并与β-连环蛋白（100 pg）mRNA（通道4和5）。β-连环蛋白mRNA本身无法诱导Xnr1号机组动物帽（3号通道）。（D） 在第8阶段用4 nM Vg1蛋白处理动物帽2小时诱导Xnr1号机组，以及β-连环蛋白（100 pg mRNA）增强了这种诱导（2-5通道）。用环己酰亚胺阻断蛋白质合成后获得了相同的反应（通道6-9），表明Xnr1号机组是Vg1蛋白的主要反应基因。虽然结果仅适用于Xnr1号机组显示成绩单，Xnr2号机组和Xnr4型还对A、C和D的所有样本进行了分析，结果具有可比性（未显示数据）。

注射由融合到VegT转录因子的雕刻（En）阻遏物结构域组成的显性负结构(Horb和Thomsen，1997年),VegT-En公司R（右），压抑的表达Xnr1、Xnr2和Xnr4号机组第9阶段胚胎(图6B，车道1和2以及未显示的数据）。这表明在调节Xnr表达时需要VegT。在动物帽外植体中VegT公司（但不是的β-连环蛋白单独）导致Xnr1号机组第9阶段(图6C). 通过共同注射β-连环蛋白和VegT公司mRNA(图6C，车道4和5），表明VegT公司和β-连环蛋白协同行动。

注入tALK4（锁定4）信使核糖核酸(Chang等人，1997年)在整个胚胎中发现Xnr1、Xnr2和Xnr4号机组在囊胚期也需要TGF-β样信号(图6B，车道3和数据未显示）。该信号的最佳内源性候选分子是Vg1，其mRNA是母体的，并且均匀地定位在鸡蛋的植物极中（如VegT）(凯斯勒和梅尔顿，1994年). 显微注射卵母细胞分泌成熟Vg1蛋白(Piccolo等人，1999年)添加到第8阶段动物帽子中2小时。在此期间，Xnr1号机组mRNA由Vg1蛋白诱导，这种反应在β-连环蛋白-注射外植体(图6D，车道4和5）。Xnr1号机组诱导是对Vg1蛋白的主要反应，因为它也是在25μg/ml环己酰亚胺存在下发生的(图6D通道8和9），在这些实验中抑制了94%的蛋白质合成。结果表明，植物性细胞质决定簇如VegT公司和Vg1型可能通过直接或间接与背侧决定簇协同作用，在囊胚内胚层中产生中胚层诱导的Xnrs的梯度表达β-连环蛋白.

讨论

cerberus短试剂提供了一种多重Xnrs拮抗剂，用于研究中胚层诱导的机制爪蟾我们发现，首先，Cer-S无论是作为注射mRNA还是作为在囊胚期添加的可溶性蛋白，都能够阻断内胚层外植体释放的背侧和腹侧中胚层诱导信号。其次，内源性Xnrs在囊胚期间在内胚层以分级方式表达。Xnr1的表达开始于中囊胚的背侧，并从那里扩展到内胚层的其余部分(图4C-E). 因此，背部内胚层（也称为Nieuwkoop中心）表达Xnr1号机组不仅在更高的水平上，而且在更长的时间内比在囊胚期的腹侧内胚层。第三，微量注射cer-S标准mRNA进入胚胎后会导致剂量依赖性抑制Xbra公司内源性存在下胚胎的表达德里埃，激进分子和Vg1型mRNA(图5). 自腹侧Xbra公司在低剂量下被阻断，在高剂量时被阻断cer-S标准mRNA，这一结果符合Xnr活性梯度对中胚层诱导的要求。第四，产妇决定因素，如VegT，Vg1和β-连环蛋白在囊胚期可以协同Xnr表达的合子激活。

这些结果表明，经典的3信号模型(松懈，1991a;希斯曼，1997)用于中胚层诱导爪蟾可以按照中所示的方式进行修改图7母体活动，如背侧β-连环蛋白和植物性VegT和Vg1，在中胚层诱导发生的第9阶段，在由多个Xnr组成的内胚层中协同建立合子背侧到腹侧梯度。在高Nodal-related浓度下，需要胚胎背侧的功能性β-catenin通路，Spemann组织者（表达基因，如索丁，诺根和Frzb1号机组)由早期原肠胚在上覆细胞中诱导。在腹侧，VegT和Vg1将导致产生较低水平的结节相关信号，以及腹侧中胚层（表达基因，如Xwnt8型和骨形态发生蛋白4)将被诱导。同样，在紫外线照射腹面化的胚胎中(希斯曼，1997)或ΔN-XTcf-3(Molenaar等人，1996年,图6A)均匀分布的VegT和Vg1产物将产生低水平的Xnrs，足以在原肠胚期诱导腹侧中胚层。

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囊胚期中胚层诱导模型，由内胚层中表达的多个结节相关基因组成的背腹梯度。这个简化模型关注内胚层信号的性质，但没有涉及重要调节器的功能，例如β-连环蛋白和暹罗在胚胎的边缘区。该模型具有预测价值，因为它可能有助于解释β-连环蛋白，Vg1，Xnr1和Xnr2，诺根和腱蛋白当在紫外线集中的胚胎中过度表达时，mRNA可能通过一条连续的途径拯救背部发育。

模型的一个特别吸引人的方面图7这可能有助于解释爪蟾胚胎学。令人惊讶的是，大量的微注射分子能够拯救（通常是完全拯救）因干扰受精卵的皮层旋转而导致的紫外线腹侧化表型(希斯曼，1997). 抗紫外线基因产品包括多种分子，如β-连环蛋白（以及该信号通路的其他成员；哈兰德和格哈特，1997年),Vg1型(汤姆森和梅尔顿，1993年),Xnr1号机组和Xnr2号机组(Jones等人，1995年),诺金(Smith和Harland，1992年)和腱蛋白(Sasai等人，1994年). 尽管人们可以认为，这些不同的基因通过不同的冗余路径发挥作用，但如果将其视为连续基因激活级联的一部分，则其共同的紫外线消除活性可能更容易被解开。从这个角度来看β-连环蛋白或Vg1型将导致囊胚内胚层中Xnr的高水平表达，进而介导上覆细胞中Spemann组织者的诱导，激活诸如诺金和腱蛋白在原肠期执行背侧模式(图7).

这种基因激活的顺序模型必须被认为是对体内情况的过度简化。很可能是多种信号通路协同作用形成原肠胚的模式。例如，我们的模型没有考虑β-catenin及其靶基因的作用涎腺和Xtwn公司(Lemaire等人，1995年;Laurent等人，1997年)可能存在于边缘区域本身。众所周知，同源异型盒基因的启动子鹅科动物活跃于背部中胚层(Steinbeisser等人，1993年)，包含Siamois和Xtwn结合位点(Watabe等人，1995年;Laurent等人，1997年)除了TGF-β反应元件外。然而，在胚胎中β-连环蛋白和表达涎腺被抑制剂ΔN-XTcf-3阻断Xnr1号机组mRNA足以激活鹅科动物和其他组织者标记(图1). 此外，在动物帽实验中，Xnr1蛋白能够诱导腹侧和背侧中胚层标记物，在低纳米范围内具有锐利的阈值(图3H). 由于Activin、Vg1和Derrieère不受Cer-S的抑制，因此本实验不探讨这些分子是否可以与Xnrs在体内中胚层模式中合作。

在许多脊椎动物的中胚层形成中，结节相关分子的关键作用有充足的遗传支持。在小鼠中，基因突变节点导致胚胎中胚层组织严重缺乏(Zhou等人，1993年;Conlon等人，1994年). 有人认为，因为一些突变胚胎含有Brachyury公司表达，小鼠结节参与维持而不是启动中胚层诱导(Conlon等人，1994年). 在爪蟾，目前的结果表明，在内胚层最初诱导中胚层时需要Nodal-related信号。斑马鱼中有两个Nodal-related基因，独眼巨人和斜视迄今为止已确定(Sampath等人，1998年;Erter等人，1998年;Feldman等人，1998年;Rebaglati等人，1998年). 这两种突变都会影响轴性中胚层，在双突变体中，这种影响是协同的，导致鹅膏状的在组织者中的表达与头躯干中胚层的缺失(Feldman等人，1998年). 在独眼巨人;斜视双纯合子Brachyury公司表达式持续存在，如爪蟾胚胎注射中等剂量的cer-S标准mRNA。在爪蟾，高剂量cer-S标准可以阻止Xbra表达式。这两个物种之间的差异可能是由于斑马鱼突变体中残留的Xnr信号，或者是由于斑马鱼突变体转录控制的细微差异Brachyury公司例如，有报道称抗病毒素取消中胚层的表达蜗牛1和第1级在某些条件下Brachyury公司注射斑马鱼胚胎中持续表达(Thisse和Thisse，1999年).

在爪蟾，一个蛋白水解突变Xnr2号机组被证明在爪蟾导致背前内胚层标记物的抑制和中胚层标记的部分抑制(Osada和Wright，1999年). 由于显性负性Xnr2结构仅在注射细胞中有效，微注射mRNA的分布可能在所见差异中起作用，本文报道了更强的作用cer-S标准mRNA。Cer-S是分泌到细胞外空间的多种Nodal-related信号的拮抗剂，可实现更均匀的分布，在较高水平上导致中胚层诱导完全丧失。应该提到的是Jones等人（1996）据报道，Xnr2在动物帽外植体中只能在短范围内发出信号，而在加工和分泌增强的结构中，这个范围增加了。我们的结果表明，Xnrs可以从植物外植体扩散到动物帽重组体。内胚层内源性Xnrs可能比动物帽中外源性表达的Xnr2更有效地加工、分泌和运输。

Xnr介导的中胚层诱导模型爪蟾(图7)得到了最近一项研究的有力支持Kofron等人（1999年）.英寸VegT公司-耗尽的胚胎中胚层的诱导受到抑制，可以通过表达Xnr1号机组Nieuwkoop结合物植物片段中的mRNA。此外，他们证明了VegT公司响应站点存在于Xnr1号机组发起人。

值得注意的是，使用增加Activin浓度的研究先前证明，TGF-β家族成员的分级剂量足以诱导腹侧和背侧中胚层并形成其模式(格林和史密斯，1990年;格林等人，1992年). 此处显示的结果表明爪蟾这种中胚层诱导因子的梯度可以由囊胚期内胚层表达的多个结节相关信号提供。

致谢

我们感谢A.Clevers博士、D.Kessler博士、D.Melton博士、H.Sive博士和C.V.E.Wright博士慷慨赠送质粒。我们感谢C.V.E.Wright、E.Delot、H.Hing、T.Hummel、G.Monteillet-Agius、I.Salecker、D.Schmucker和实验室成员对手稿进行了批判性审查，并感谢A.Cuellar提供的技术援助。E.A.是ARC研究员和HHMI助理。M.O.由DFG和HFSPO支持，O.W.由FFWF和HFSPO支持。这项工作得到了NIH拨款R37 HD-21502-14的支持。E.M.D.R.是HHMI研究员。

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