美国国家科学院院刊。1998年10月13日；95(21): 12671–12676.
甘丙肽调节泌乳素释放和催乳素增殖
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大卫·威尼克
*英国布里斯托尔BS2 8HW马尔堡街布里斯托尔大学医学系；†英国伦敦NW7 1AA里奇韦国家医学研究所发育神经生物学；¶英国伦敦W12 ONN DuCane路Hammersmith医院内分泌科皇家科学技术与医学院；‖澳大利亚悉尼新南威尔士州达林赫斯特维多利亚街384号加文医学研究所癌症研究项目，2010年；和**加利福尼亚州圣克鲁斯加利福尼亚大学辛希默实验室，邮编：95064
卡罗琳·斯莫尔
*英国布里斯托尔BS2 8HW马尔堡街布里斯托尔大学医学系；†英国伦敦NW7 1AA里奇韦国家医学研究所发育神经生物学；¶英国伦敦W12 ONN DuCane路Hammersmith医院内分泌科皇家科学技术与医学院；‖澳大利亚悉尼新南威尔士州达林赫斯特维多利亚街384号加文医学研究所癌症研究项目，2010年；和**加利福尼亚州圣克鲁斯加利福尼亚大学辛希默实验室，邮编：95064
安德里亚·培根
*英国布里斯托尔BS2 8HW马尔堡街布里斯托尔大学医学系；†英国伦敦NW7 1AA里奇韦国家医学研究所发育神经生物学；¶英国伦敦W12 ONN DuCane路Hammersmith医院内分泌科皇家科学技术与医学院；‖澳大利亚悉尼新南威尔士州达林赫斯特维多利亚街384号加文医学研究所癌症研究项目，2010年；和**加利福尼亚州圣克鲁斯加利福尼亚大学辛希默实验室，邮编：95064
菲奥娜·霍姆斯
*英国布里斯托尔BS2 8HW马尔堡街布里斯托尔大学医学系；†英国伦敦NW7 1AA里奇韦国家医学研究所发育神经生物学；¶英国伦敦W12 ONN DuCane路Hammersmith医院内分泌科皇家科学技术与医学院；‖癌症研究项目，加文医学研究所，384 Victoria Street，Darlinghurst，NSW 2010，澳大利亚悉尼；和**加利福尼亚州圣克鲁斯加利福尼亚大学辛希默实验室，邮编：95064
迈克尔·诺曼
*英国布里斯托尔BS2 8HW马尔堡街布里斯托尔大学医学系；†英国伦敦NW7 1AA里奇韦国家医学研究所发育神经生物学；¶英国伦敦W12 ONN DuCane路Hammersmith医院内分泌科皇家科学技术与医学院；‖澳大利亚悉尼新南威尔士州达林赫斯特维多利亚街384号加文医学研究所癌症研究项目，2010年；和**加利福尼亚州圣克鲁斯加利福尼亚大学辛希默实验室，邮编：95064
克里斯托弗·奥曼迪
*英国布里斯托尔BS2 8HW马尔堡街布里斯托尔大学医学系；†英国伦敦NW7 1AA里奇韦国家医学研究所发育神经生物学；¶英国伦敦W12 ONN DuCane路Hammersmith医院内分泌科皇家科学技术与医学院；‖澳大利亚悉尼新南威尔士州达林赫斯特维多利亚街384号加文医学研究所癌症研究项目，2010年；和**加利福尼亚州圣克鲁斯加利福尼亚大学辛希默实验室，邮编：95064
埃塞尔·基利奇
*英国布里斯托尔BS2 8HW马尔堡街布里斯托尔大学医学系；†英国伦敦NW7 1AA里奇韦国家医学研究所发育神经生物学；¶英国伦敦杜坎路哈默史密斯医院内分泌科帝国科学技术与医学院W12 ONN；‖澳大利亚悉尼新南威尔士州达林赫斯特维多利亚街384号加文医学研究所癌症研究项目，2010年；和**加利福尼亚州圣克鲁斯加利福尼亚大学辛希默实验室，邮编：95064
尼尔·C·H·克尔
*英国布里斯托尔BS2 8HW马尔堡街布里斯托尔大学医学系；†英国伦敦NW7 1AA里奇韦国家医学研究所发育神经生物学；¶英国伦敦杜坎路哈默史密斯医院内分泌科帝国科学技术与医学院W12 ONN；‖澳大利亚悉尼新南威尔士州达林赫斯特维多利亚街384号加文医学研究所癌症研究项目，2010年；和**加利福尼亚州圣克鲁斯加利福尼亚大学辛希默实验室，邮编：95064
穆罕默德·加泰伊
*英国布里斯托尔BS2 8HW马尔堡街布里斯托尔大学医学系；†英国伦敦NW7 1AA里奇韦国家医学研究所发育神经生物学；¶英国伦敦W12 ONN DuCane路Hammersmith医院内分泌科皇家科学技术与医学院；‖澳大利亚悉尼新南威尔士州达林赫斯特维多利亚街384号加文医学研究所癌症研究项目，2010年；和**加利福尼亚州圣克鲁斯加利福尼亚大学辛希默实验室，邮编：95064
弗兰克·塔拉曼特斯
*英国布里斯托尔BS2 8HW马尔堡街布里斯托尔大学医学系；†英国伦敦NW7 1AA里奇韦国家医学研究所发育神经生物学；¶英国伦敦W12 ONN DuCane路Hammersmith医院内分泌科皇家科学技术与医学院；‖澳大利亚悉尼新南威尔士州达林赫斯特维多利亚街384号加文医学研究所癌症研究项目，2010年；和**加利福尼亚州圣克鲁斯加利福尼亚大学辛希默实验室，邮编：95064
史蒂芬·R·布鲁姆
*英国布里斯托尔BS2 8HW马尔堡街布里斯托尔大学医学系；†英国伦敦NW7 1AA里奇韦国家医学研究所发育神经生物学；¶英国伦敦W12 ONN DuCane路Hammersmith医院内分泌科皇家科学技术与医学院；‖澳大利亚悉尼新南威尔士州达林赫斯特维多利亚街384号加文医学研究所癌症研究项目，2010年；和**加利福尼亚州圣克鲁斯加利福尼亚大学辛希默实验室，邮编：95064
瓦西里斯·帕奇尼斯
*英国布里斯托尔BS2 8HW马尔堡街布里斯托尔大学医学系；†英国伦敦NW7 1AA里奇韦国家医学研究所发育神经生物学；¶英国伦敦W12 ONN DuCane路Hammersmith医院内分泌科皇家科学技术与医学院；‖澳大利亚悉尼新南威尔士州达林赫斯特维多利亚街384号加文医学研究所癌症研究项目，2010年；和**加利福尼亚州圣克鲁斯加利福尼亚大学辛希默实验室，邮编：95064
*英国布里斯托尔BS2 8HW马尔堡街布里斯托尔大学医学系；†英国伦敦NW7 1AA里奇韦国家医学研究所发育神经生物学；¶英国伦敦W12 ONN DuCane路Hammersmith医院内分泌科皇家科学技术与医学院；‖澳大利亚悉尼新南威尔士州达林赫斯特维多利亚街384号加文医学研究所癌症研究项目，2010年；和**加利福尼亚州圣克鲁斯加利福尼亚大学辛希默实验室，邮编：95064
‡D.W.和C.J.S.对本文的贡献相同。
由Tomas Hokfelt，瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究院传达
收稿日期：1998年6月15日；1998年8月17日接受。
摘要
神经肽甘丙肽主要由啮齿类动物垂体前叶、下丘脑中央隆起和室旁核中的乳营养因子（泌乳素分泌细胞类型）表达。催乳素和甘丙肽位于同一分泌颗粒中，这两种蛋白的表达对动物的雌激素状态极为敏感。服用雌二醇17β可诱导垂体增生，随后形成腺瘤，并使乳营养素的甘丙肽mRNA含量增加3000倍。为了进一步研究甘丙肽在催乳素释放和促乳细胞生长中的作用，我们现在报道了携带内源性甘丙肽基因功能丧失突变的小鼠。没有胚胎致死的证据，突变小鼠生长正常。迄今为止发现的特定内分泌异常与泌乳素的表达有关。与野生型对照组相比，成年雌性突变小鼠的垂体催乳素信息水平和蛋白质含量降低了30-40%。突变雌鼠无法分泌乳汁，幼崽因饥饿/脱水而死亡，除非被野生型母亲抚养。与野生型对照组相比，突变雌性大鼠产后7天的催乳素分泌明显减少，并伴有乳腺成熟障碍。随着催乳素释放、STAT5表达或垂体细胞数量增加的增加，乳酸营养因子对高剂量雌激素的增殖反应几乎完全消失。这些数据进一步支持了这样一种假设，即甘丙肽作为催乳素表达的旁分泌调节器以及作为乳酸营养因子的生长因子。
调节乳酸菌增殖的因素在很大程度上尚不清楚。此外，催乳素分泌改变与乳营养因子增殖的关系也不清楚。怀孕会导致催乳素释放和促乳激素数量的协同增加，一旦哺乳停止，其数量就会显著减少(1——4). 相反，持续且不受控制的促乳细胞增殖最终导致泌乳素分泌腺瘤（泌乳素瘤）的形成，导致泌乳不当。催乳素瘤的发病率估计为100‰(5). 然而，在老年女性的尸检系列中，发病率是1000倍以上，强调大多数催乳素瘤临床上无症状，在老年人群中常见(6). 催乳素瘤也是一些品系雌性老年大鼠死亡的常见原因(7——9). 用多巴胺激动剂治疗催乳素瘤可降低垂体催乳素的表达并逆转促乳细胞增生，强调催乳素表达与细胞增殖之间的联系。催乳素瘤是一种单克隆肿瘤，表明一种或多种体细胞突变是肿瘤发病机制的基础。越来越多的文献未能发现人类泌乳素瘤中已知原癌基因的突变(10——12). 相反，对人类或啮齿动物施用外源性雌激素，可有效诱导催乳素基因转录和分泌(13——16)刺激乳酸菌增殖和腺瘤形成(17——19). 雌激素诱导增殖的机制也不清楚，但在垂体前叶培养物中添加雌二醇17β可刺激多种生长因子的产生，其中最显著的增加是肽甘丙肽(20).
甘丙肽主要由乳酸菌亚群合成、储存和释放(21)在啮齿类动物的垂体中，并且对动物的雌激素状态极其敏感。妊娠期间垂体甘丙肽表达显著升高(22)而在哺乳期下丘脑大细胞神经元中甘丙肽表达下调(23). 外源性雌二醇17β导致分泌甘丙肽的乳酸营养因子数量增加6倍(24)垂体前叶甘丙肽mRNA含量增加3000倍，而肽水平增加500倍(25). 相反，卵巢切除几乎消除了垂体甘丙肽的含量(26). 我们以前的研究已经证明，甘丙肽是235-1克隆性乳营养细胞系的有丝分裂原，通过一种新的垂体特异性甘丙肽受体发挥作用(24,27). 我们还表明，局部分泌的甘丙肽的免疫中和作用会严重抑制泌乳素的释放，尤其是在高雌激素状态下(24,28). 许多人类研究证实了我们在啮齿动物中的发现；输注人甘丙肽显著刺激正常女性志愿者的催乳素分泌，对垂体瘤患者的反应过度(29——32).
在这里，我们报道了携带内源性甘丙肽基因功能丧失突变的小鼠的一代。成年雌性小鼠的催乳素表达降低，妊娠后无法分泌乳酸。由于无法上调催乳素的表达或增加垂体细胞的数量，因此几乎完全消除了乳营养因子对高剂量雌激素的增殖反应。因此，甘丙肽似乎是催乳素释放的补品调节器，也是促乳激素的生长因子。
材料和方法
目标向量。
采用全长大鼠甘丙肽cDNA作为探针，在高度严格的条件下筛选了小鼠129sv cosmid基因组文库（伦敦皇家癌症研究基金会A.M.Frischauf慷慨捐赠）。构建了正/负选择靶向载体（图。A类)其中PGK公司-尼奥用反向盒替换甘丙肽基因外显子1-5，去除信号肽、甘丙肽编码区和大部分甘丙肽相关肽。1.9千字节生态RI公司/巴姆HI片段，5′到基因（巴姆HI位于转录起始位点下游13 bp处）尼奥磁带。进一步添加了7.8 kb的3′同源性作为Bgl公司II片段，删除了总计3.7 kb的甘丙肽位点（包含该基因的前五个外显子）。这个Bgl公司II碎片被Klenow弄钝Xho公司I链接器插入两端。7.8-kbXho公司然后我的片段被克隆到Xho公司I站点，位于PGK-新磁带。将载体线性化并电穿孔到前面描述的E14胚胎干细胞系中(33). 在10天内进行双重选择，通过Southern杂交筛选G418/gancyclovir耐药克隆。野生型基因座的限制性映射Bgl公司当使用5′外部探针（标记为a，图。A类)而正确定位的基因座产生4.4kb的片段。在209个双抗性菌落中，共鉴定出9个克隆，其中甘丙肽基因的一个等位基因通过同源重组被正确靶向，靶向频率为4.3%。这九个克隆进行了核型分析，证实了其整倍性，并将其注射到3.5天龄C57BL/6小鼠的囊胚中。中断的甘丙肽基因座的种系传递来自三个分离的胚胎干细胞克隆。
(A类)小鼠甘丙肽基因的靶向性破坏。靶向载体将甘丙肽基因的前五个外显子替换为尼奥磁带方向相反。HSV-TK表示单纯疱疹胸苷激酶尼奥新霉素耐药基因。A表示5′外部探头。B、，巴姆HI、Bg、，Bgl公司二、 E、，生态罗得岛。，(B类)通过Southern杂交获得相同的结果（用Bgl公司II，并用5′外部探针进行探测）和PCR筛查，在两个杂合子交配产生的同一窝产仔上进行。
靶向等位基因的种系传递。
继生殖系传播动物之后，通过Southern blot分析和PCR进行基因分型。图。B类证明了通过Southern印迹分析和PCR筛选对来自两个杂合子交配的同一窝获得的相同结果。在同一PCR中使用了两组引物。第一组引物AACTGGAGGTGGAGGAAAGGAAC和TAGTGCGGATATGCTCTCAG分别对应于缺失甘丙肽基因的外显子4和5，并生成350-bp片段。第二组TGCCGCGCTGTTCTCCTCT和AAGCGGCACATTTCCACAT对应于尼奥基因并生成600-bp片段。
老鼠。
所有实验都是在8周龄的雌性随机循环动物上进行的，这些动物随意喂食标准食物和水。数据以平均值±SEM表示。使用方差分析进行统计。动物被斩首处死，垂体前叶和下丘脑被移除，称重，并在液氮中快速冷冻。死亡时采集躯干血液中的血浆。
Northern Blot分析。
使用RNAzol-B从垂体中制备总RNA(34)（生物起源）。来自突变和野生型小鼠的等量RNA在10 mM磷酸钠缓冲液中的甲醛/琼脂糖凝胶上运行，并印在GeneScreen膜（杜邦）上。上述催乳素探针(35)由E.Borrelli（法国斯特拉斯堡国立圣母医学研究院）提供。小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码区452-bp探针(36)用作RNA定量的内部标准。使用STORM 840荧光成像仪分子动力学进行可视化和量化。
放射免疫分析。
生长激素（GH）、促甲状腺激素（TSH）、促黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）的RIA分别由国家激素和垂体项目的P.Smith和A.Parlow慷慨捐赠的试剂和方法以及垂体激素和Antigra中心进行。小鼠催乳素的测定(37)促性腺激素释放激素[方法和试剂(38)爱丁堡医学研究中心生殖生物学室H.M.Fraser慷慨捐赠的血管活性肠多肽(39)，神经肽Y(39)、生长抑素(39)，血管加压素(39)，催产素(41)和促甲状腺激素释放激素(42)按照说明执行。
组织学分析。
对用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋的组织进行免疫细胞化学。使用先前表征的小鼠催乳素对两微米切片进行染色(37)稀释度为1/5000。以二氨基联苯胺为底物，采用标准生物素-链霉亲和素法进行标记。对八个单独的切片/垂体前叶进行细胞计数。每个切片上至少有200个细胞被计数。注意确保计数中包括垂体前叶所有部分的平等代表性。
在乳腺结构的情况下，将来自8周龄的处女动物的第四个腹股沟乳腺从皮肤上剥离并铺展在超霜显微镜载玻片上，空气干燥5分钟，然后通过浸入10%中性缓冲福尔马林过夜固定。腺体在胭脂红-硫酸钾-硫酸铝中染色过夜，然后通过分级乙醇系列和二甲苯进行脱水，并通过浸泡在甲基水杨酸盐中进行澄清以进行摄影。
垂体细胞计数。
如前所述，用酶分散单个前垂体，并用血细胞仪计数细胞(24).
西方印迹法。
利用牛β-酪蛋白启动子（AGATTTTAGGAATTCAAATC）的STAT5结合序列对活化的STAT_5进行亲和纯化。对于每组动物，将两个前垂体在4°C的1 ml溶液中溶解，该溶液含有10 mM三羟甲基氯化钠（pH 7.6）、5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、50 mM氯化钠、30 mM焦磷酸二钠、50 mM氟化钠、100 mM Na3VO4、1 mM苯甲基磺酰基氟化物和0.5%诺奈特P-40（溶解缓冲液）。通过15000×离心澄清裂解液克持续10分钟，用1μg双链5′生物素化寡核苷酸与10μl 50%链霉亲和素琼脂糖悬浮液（Sigma）偶联，从上清液组分（共含有1.3–1.5 mg蛋白质）中提取活化STAT5(43). 结合蛋白通过8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。然后将蛋白质转移到Hybond-C膜（Amersham），用STAT5抗体（Santa Cruz Biotechnology）检测印迹，然后用辣根过氧化物酶偶联到山羊抗鼠IgG。使用增强化学发光（ECL、Amersham）或ECL Plus显示条带。使用STORM 840荧光成像仪（分子动力学）进行可视化和量化。
结果和讨论
在近交129/OlaHsd小鼠品系上，甘丙肽功能丧失突变被培育成纯合性，所有数据均来自该背景下的小鼠。用放射免疫分析法测定了脑区、胃和小肠的甘丙肽水平(26). 杂合子中的水平为野生型对照的50%，而纯合子的水平在所有情况下都低于可检测极限（表). 活产婴儿的基因型分析结果符合孟德尔遗传学预测的预期比率，纯合子后代的性别比率为1:1。
表1
| 基因型 | 皮质 | 下丘脑 | 胃 | 十二指肠 | 回肠 |
|---|
| +/+ | 5.8 ± 0.3 | 110.3 ± 7.8 | 27.5 ± 1.9 | 122.9 ± 11.6 | 267.4 ± 13.5 |
| +/负极 | 2.9 ± 0.2 | 53.8 ± 3.8 | 13.8 ± 0.8 | 68.4 ± 5.7 | 125.9 ± 7.6 |
| −/− | 乌德 | 乌德 | 乌德 | 乌德 | 乌德 |
催乳素信息水平和蛋白质含量（图。和A类)在随机循环的成年雌性突变体中，与野生型对照相比，分别减少了30%和40%。免疫细胞化学证实，乳酸菌数量保持不变（46±4%对44±5%成年女性野生型对突变体；n个=5），以及腺体内乳酸菌的分布。与野生型对照组相比，随机循环成年女性突变体的血浆催乳素没有变化（分别为10±2.7和11±2.6 ng/ml催乳素；n个= 10). 垂体催乳素合成和含量下降与循环水平不变之间的差异可能反映了发情周期中催乳素分泌的快速变化，因为我们研究的是随机循环的成年女性。
通过Northern blotting对随机循环的野生型和突变雌性（表示为对照）、第二组随机循环的野外型和突变雌鼠（用雌二醇治疗3周）和第三组随机循环野生型和变异雌鼠（雌二醇治疗）进行任意单位的垂体催乳素信息水平测量，另一组野生型和突变型雌性大鼠产后7天。将甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为对照探针，测定相关值。对于所有组，n个= 5. ∗，P<0.05表示与野生型对照组相比的显著性水平。每组有两个代表性垂体样本。
ng/垂体中垂体泌乳素含量(A类)和循环血浆催乳素（单位：ng/ml）(B类)在随机循环的野生型和突变型雌性动物中（表示对照组），第二组随机循环野生型和变异型雌性动物接受雌二醇17β治疗3周，第三组为产后7天的野生型或突变型雌性。n个=所有组10。*，P< 0.05, ∗∗，P< 0.01, ∗∗∗，P<0.001表示与野生型对照组相比的显著性水平。
研究了其他已知调节催乳素储存和释放的因子的表达。垂体前叶神经肽血管活性肠多肽的含量，先前被证明是催乳素促分泌素(9)在突变雌性中，无变化（分别为65±9和71±10fmol/腺体，突变型和野生型；n个= 8). 下丘脑促甲状腺激素释放激素含量（表)也不受突变的影响。到目前为止，在动物杂合子中尚未发现突变的表型变化。
表2
每种基因型雄性和雌性小鼠垂体GH、TSH、FSH和LH的含量以及低血压神经肽的含量
| 性别/基因型 | GH公司 | TSH公司 | 左侧 | FSH公司 | 促性腺激素释放激素 | SRIF公司 | 列车运行小时 | NPY（净现值） | GLP-1型 | AVP公司 |
|---|
| 男+/+ | 51,781 ± 517 | 141 ± 8 | 1,794 ± 98 | 855 ± 44 | 55 ± 7 | 888 ± 85 | 447 ± 52 | 510 ± 71 | 4.4 ± 0.6 | 544 ± 69 |
| 男性+/- | 52,161 ± 623 | 136 ± 8 | 1,830 ± 119 | 897 ± 40 | 62 ± 20 | 1,111 ± 100 | 553 ± 52 | 463±95 | 4.7 ± 0.7 | 590 ± 78 |
| 男−/− | 50,975 ± 619 | 154 ± 9 | 1,980 ± 102 | 834±38 | 44 ± 13 | 1,153 ± 200 | 472 ± 56 | 577 ± 82 | 6.0 ± 1.0 | 574 ± 82 |
| 女性+/+ | 30,719 ± 380 | 133 ± 12 | 344 ± 18 | 287±13 | 51 ± 19 | 500 ± 47 | 490 ± 40 | 550 ± 47 | 6.2 ± 1.2 | 490 ± 53 |
| 母+/- | 31,162 ± 356 | 145 ± 7 | 360 ± 16 | 324 ± 11 | 62 ± 24 | 624 ± 50 | 575 ± 50 | 614 ± 50 | 6.7 ± 0.8 | 516 ± 66 |
| 女性−/− | 30,883 ± 310 | 136±9 | 386 ± 21 | 315 ± 17 | 44 ± 14 | 472 ± 20 | 467 ± 31 | 482 ± 20 | 5.6±0.6 | 483 ± 71 |
突变雌性无法分泌乳汁，除非由野生型母亲抚养，否则所有幼崽在48小时内都会因脱水/饥饿而死亡。在头两次怀孕期间，这种明显的哺乳失败是绝对的。在随后的妊娠中，约80%的幼崽死亡，但在某些情况下，有一两只幼崽存活到断奶期。这些幼崽一旦断奶，在各个方面都无法与杂合子母亲所生的突变幼崽区分开来。垂体催乳素信息水平（图。)、蛋白质含量（图。A类)和血清水平（图。B类)与哺乳年龄匹配的野生型对照组相比，产后7天（首次妊娠）突变雌性大鼠的死亡率分别显著降低1.4倍、1.5倍和8倍。很可能，突变株体内循环泌乳素水平下降8倍就足以解释哺乳期完全消失的原因。以前的人类和大鼠数据表明，使用多巴胺激动剂使循环泌乳素水平降低50%，减半或在某些情况下取消产奶(44——46). 催乳素水平与母乳产量之间的关系可能是非线性的，一旦催乳素含量降至特定阈值以下，则停止产奶。催乳素受体杂合子零突变小鼠中几乎相同表型的观察(47)加拉宁对泌乳的作用部分是通过催乳素对乳腺的作用来介导的，这一假设更加有力。
前两次妊娠最初的哺乳失败也可能是由于突变女性体内循环泌乳素水平低导致乳腺小叶-肺泡发育延迟所致。我们用胭脂红染色了8周龄处女的全部腹股沟乳腺。突变雌性显示导管分支减少（图。). 导管分支的这些变化与在小鼠体内观察到的泌乳素纯合突变非常相似(48)或催乳素受体(47). 最后，有趣的是，许多研究已经确定了催乳素和(49,50)和甘丙肽(51,52)在大鼠和人类乳腺组织中，最近在一些上皮性乳腺癌细胞系中雌激素诱导的甘丙肽mRNA增加(52)这意味着乳腺内甘丙肽和催乳素之间的进一步旁分泌相互作用。
经胭脂红染色的第四个腹股沟乳腺，取自8周龄处女野生型(左侧)和突变型(赖特)动物。每个基因型有两个代表性腺体。导管树的形成正在进行中，导管末端有丝分裂终末芽清晰可见；突变体动物的导管分支减少。照片中心的淋巴结呈深色染色。
为了研究甘丙氨酸-雌激素相互作用及其对催乳素表达和促乳细胞生长的影响，成年随机循环雌性小鼠皮下注射0.5 mg溶于红花油中的雌二醇-17β，每周注射一次，为期3周。以前已经证明，这种剂量方案可以诱导大鼠和小鼠的催乳素基因转录和分泌，尽管小鼠的增加不如大鼠强劲(53). 垂体催乳素信息水平和蛋白质含量（图。和A类)野生型雌性大鼠在慢性雌激素过度分泌后，体内泌乳素水平升高了2倍，血浆泌乳素浓度升高了13倍（图。B类). 与此同时，甘丙肽含量增加了6倍（7.5±0.5 pmol/腺体vs.1.2±0.1 pmol/腺，P（P）< 0.001;n个=10，高雌激素与对照组）。突变女性的催乳素信息水平也有类似的上升（图。)但不包括蛋白质含量（图。A类). 与这些发现一致的是，血浆泌乳素水平的升高明显减弱（图。B类). 雌二醇对分散垂体细胞数量的增殖作用(24)也进行了研究，证明野生型动物中观察到的细胞数量增加几乎完全消失（图。). 通过免疫细胞化学测定，突变动物中的乳营养因子百分比也显著低于野生型雌激素治疗对照组（51±4%vs.62±7%突变vs.野生型，P（P）< 0.01,n个= 5).
随机循环的野生型和突变雌性（对照组）和雌二醇17β治疗3周后的分散垂体细胞数量。对于所有组，n个= 10. ∗∗，P< 0.01, ∗∗∗，P<0.001表示与野生型对照组相比的显著性水平。
博雷利及其同事的最新数据(35)很好地证明，催乳素本身通过激活垂体催乳素受体，作为一种自分泌生长因子作用于乳酸营养因子。催乳素受体的信号转导主要通过JAK2进行，JAK2是一种酪氨酸激酶，其主要磷酸化靶点是STAT5转录因子(54). 磷酸化STAT5转录因子转移到细胞核，在那里它们被认为调节细胞周期和增殖。因此，我们通过Western blot分析研究了慢性高雌激素作用前后野生型和突变动物中活化STAT5的表达。结果表明，野生型雌性动物服用雌二醇后STAT5表达增加4.2±0.3倍，突变动物显著减少（1.6±0.2，图。). 因此，这些数据与甘丙肽可能通过调节催乳素释放（而不是合成），从而激活催乳素受体信号通路，部分调节催乳素生长的假设是一致的。
活化STAT5的代表性Western blot：1区，使用T47-D乳腺癌细胞株裂解物的阳性对照；车道2，尺寸标记；第3和第4通道，野生型垂体前叶裂解物，含或不含雌二醇17β（E2）；通道5和通道6，突变体垂体前叶裂解物含有或不含有雌二醇17β；n个= 5.
除了上述对泌乳素表达的影响外，在各种生理条件下，甘丙肽也被证明可以调节GH的释放(55)、促性腺激素(56)（黄体生成激素和卵泡刺激激素）和加压素(57)以及在食物摄入和体重调节中发挥作用(58). 尽管进行了这些研究，但我们无法证明突变或杂合子动物进入青春期或妊娠期的时间与野生型同胞对照相比发生了变化。这些正常生理参数与突变体中GH、TSH、促黄体激素和卵泡刺激激素的垂体含量缺乏变化相平行（表). 此外，控制这些激素分泌的许多主要释放因子的下丘脑含量也没有改变（表). 突变小鼠出生后前8周的生长速度和最终成年大小与野生型同窝小鼠没有差异。与这一观察结果一致，神经肽Y和胰高血糖素样肽-1这两种已知的调节食物摄入的神经肽的下丘脑含量在突变动物中没有变化（表). 同样，下丘脑加压素的含量（表)垂体后叶催产素含量分别为1.6±0.2和1.4±0.3，n个=8）也未被突变改变。
上述数据为甘丙肽作为泌乳素释放和生长因子对乳酸菌的因果作用提供了良好证据，尤其是在高雌激素暴露状态下。甘丙肽似乎主要在储存和释放水平上调节循环泌乳素水平，而不是通过调节基因转录，尽管这些作用是否在垂体和/或下丘脑水平上介导尚不清楚。最近的数据进一步支持甘丙肽作为垂体生长因子的作用，表明甘丙肽对转基因小鼠的乳营养素和生长激素的靶向过度表达会导致垂体增生和腺瘤形成。‡‡我们最近对甘丙肽突变动物损伤后外周神经再生长期受损的观察（未发表的数据）也表明甘丙肽在感觉神经元再生中具有营养作用。在正常生理条件下，乳酸菌和背根神经节中的甘丙肽表达水平相对较低。只有在病理生理刺激（初级感觉神经元损伤和高雌激素暴露于乳酸菌状态）后，甘丙肽的表达模式才会发生显著的可塑性。因此，甘丙肽可能在许多组织中起营养因子的作用，以应对损伤或病理变化。最近的数据表明，甘丙肽通过激活丝裂原活化蛋白激酶途径的p42亚型对内分泌小细胞肺癌细胞也有增殖作用(59).
致谢
我们感谢A.Bygrave对胚胎干细胞培养的指导，D.Jessop对催产素RIA的执行，C.Phelps对催乳素免疫细胞化学的建议，以及B.Mankoo对项目各个阶段的宝贵建议和帮助。这项工作得到了医学研究委员会、威康信托基金会和神经内分泌研究信托基金会的支持。
缩写
| 左侧 | 促黄体生成素、生长激素 |
| TSH公司 | 甲状腺刺激激素 |
| FSH公司 | 促卵泡激素 |
脚注
‡‡Vrontakis，M.E.，Perumal，P.&Faraci，C.第十届国际内分泌大会（Amstar），1996年6月12日至15日，加利福尼亚州旧金山。
工具书类
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