美国国家科学院院刊。1998年10月13日；95(21): 12340–12345.
GIPC是一种含有PDZ结构域的蛋白质，与RGS-GAIP的C末端特异性相互作用
加利福尼亚大学圣地亚哥分校细胞和分子医学部及病理学系，加利福尼亚州拉霍亚，邮编92093-0651
*转载请求的收件人：加利福尼亚大学圣地亚哥分校细胞和分子医学部，加利福尼亚州拉霍拉市吉尔曼大道9500号，邮编：92093-0651。电子邮件：ude.dscu@rahuqrafm。 玛丽莲·吉斯特·法夸尔撰稿
摘要
我们已经鉴定出一种哺乳动物蛋白，称为GIPC（用于GAIP相互作用蛋白，C末端），它具有一个中心PDZ结构域和一个C末端酰基载体蛋白（ACP）结构域。GIPC的PDZ结构域与Gα的GTPase激活蛋白（GAP）RGS-GAIP特异性相互作用我亚单位最近定位于氯氰菊酯包被的囊泡。缺失突变体分析表明，GIPC的PDZ结构域与酵母双杂交系统中GAIP（11个氨基酸）的C末端和谷胱甘肽特异性相互作用S公司-转移酶（GST）-GIPC下拉分析，但GIPC不与被测RGS（G蛋白信号调节器）家族的其他成员相互作用。这一发现与GAIP的C末端是唯一的并且具有修饰的C末端PDZ结合基序（SEA）这一事实相一致。通过对HeLa细胞制备的膜组分进行免疫印迹，我们发现有两个GIPC池——可溶性或胞质池（70%）和膜相关池（30%）。通过免疫荧光，内源性和GFP标记的GIPC在HeLa细胞中显示出弥散和点状细胞质分布，分别反映了可溶性和膜相关池的存在。通过免疫电镜观察，GIPC的膜池与位于质膜附近的小泡簇有关。这些数据提供了直接证据，证明RGS蛋白的C末端参与特定RGS蛋白特有的相互作用，并暗示GAIP除了其GAP活性外，还参与其他功能的调节。GIPC的位置及其与GAIP的结合表明，GAIP和GIPC可能是G蛋白偶联信号复合物的组成部分，参与调节囊泡运输。ACP结构域的存在表明GIPC在囊泡结合蛋白的酰化中具有假定的功能。
最近发现的RGS蛋白家族（用于G蛋白信号调节）作为GTPase激活蛋白（GAP），与Gα异源三聚体G蛋白的α亚基结合我/Gαq个亚类化并增强其GTPase活性(1–5)从而促进其失活。此外，一些家族成员作为效应拮抗剂，与效应物竞争与Gα亚基的结合(4).
目前已知超过20种不同的哺乳动物蛋白质含有诊断RGS结构域，远远超过Gα我/Gαq个亚单位。尽管它们的RGS结构域高度同源（45-80%），但哺乳动物RGS蛋白在普通RGS结构区外的N和C末端几乎没有序列相似性，这表明它们具有特定的相互作用和功能。
之前我们已经确定并描述了RGS-GAIP(6,7)，RGS家族成员与Gα直接相互作用i3类通过其RGS域(6). 随后我们发现GAIP是膜锚定的(7)最近，它位于氯氰菊酯包被的囊泡上，而不是质膜上(8). GAIP在网格蛋白包被囊泡中的定位表明GAIP可能参与调控G蛋白介导的控制囊泡运输的途径(8). 与质膜上的G蛋白相关途径相比，对这些途径的理解仍然很差(9). 虽然GAIP的RGS结构域的性质和相互作用已被广泛研究，但对GAIP的特定N和C末端的功能知之甚少。GAIP的N末端，包括半胱氨酸链基序，是棕榈酰化的，与将GAIP锚定在膜上有关(7). 与许多RGS蛋白一样，GAIP的C末端非常短（即只有11个氨基酸），除了RET-RGS外，它是唯一的RGS家族成员，它与RGS结构域外的GAIP具有显著同源性(10).
在本研究中，我们使用酵母双杂交系统来识别结合GAIP的蛋白质，因此可能参与GAIP的调节或包括GAIP的信号级联。在本报告中，我们描述了一种PDZ结构域蛋白的分离和表征，该蛋白与GAIP的C末端特异性相互作用，我们将其命名为GIPC（GAIP相互作用蛋白，C末端）。GIPC与GAIP相互作用，不与其他RGS家族成员相互作用，是迄今为止描述的唯一与RGS蛋白C末端结合的蛋白质。
材料和方法
图书馆筛选。
大鼠RGS-GAIP cDNA序列（GAIP23–216)与人类GAIP高度同源(6)，从大鼠GC细胞cDNA文库的酵母双杂交筛选中获得(11)在带有大鼠Gα的pACT2“猎物”载体中i3类作为诱饵。利用GAIP在酵母双杂交系统中进行相互作用筛选23–216在同一个大鼠GC细胞cDNA文库中作为诱饵。将总计600000个酵母转化子接种在选择性培养基上，并通过菌落提升试验对β-半乳糖苷酶（β-gal）活性进行评分。阳性（蓝色）菌落在选择性培养基上重新破碎，通过电穿孔将猎物质粒DNA解救到大肠杆菌HB101（生物-Rad）。纯化后的pACT2质粒重新转化到酵母菌株SFY526中，与原诱饵质粒和各种对照质粒进行一对一的相互作用。将插入物提交限制性消化，对相似的模式进行分组，并通过自动测序对其中一个进行测序（两条链）。
爆炸搜索。
在线的爆炸搜索是通过马里兰州贝塞斯达国家卫生研究所的国家生物技术信息中心进行的(13).杂岩（Geneworks，IntelliGenetics）用于蛋白质分析，并用多序列比对程序(14). 我们将同源性定义为同一性加上保守氨基酸替换。
Northern Blot分析。
人、大鼠和小鼠poly（A）的多个组织印迹+)根据制造商的说明，将RNA（Clontech）与随机引物（Amersham）标记的探针杂交。人、大鼠和小鼠GIPC探针（分别为1200、1030和1000 bp）32P标记为10的特定活性9cpm/微克。根据制造商指南，在高强度条件下使用ExpressHyb溶液（Clontech）进行杂交（68°C），并在0.1×SSC（SSC=150 mM NaCl/15 mM柠檬酸钠，pH 7）和0.1%SDS（65°C）下进行高强度冲洗。将印迹暴露于放射自显影16和72小时。使用扫描分析软件（英国剑桥Biosoft）。
在体内双混合系统中的相互作用。
为了分析GIPC和GAIP之间的相互作用，通过PCR产生hGAIP的N末端（aa 1–79）、RGS（aa 80–206）和RGS+C末端（aa 80–217）结构域的PCR片段，并将其克隆到pGBT9载体中，如前所述(6). 通过两个寡核苷酸的退火产生hGAIP（aa 207-217和aa 207–216）和rGAIP（aa 207-216）的C末端结构域，并克隆到pGBT9中。rGIPC的N端（aa 1–130）、C端（aa211–333）和PDZ结构域（aa 124–226）通过PCR产生并克隆到pACT2中。PCR扩增全长小鼠RGS2和RGSr/RGS16。全长RET-RGS、RGS4、RGS2和RGS-r/RGS16被克隆到pGBT9载体中。（PCR构建物的引物序列可根据要求提供。）所有构建物均通过自动DNA测序进行了框内克隆验证。对于一对一的相互作用，我们使用β-半乳糖和5-溴-4-氯-3-吲哚β的菌落提升试验-d日-半乳糖苷（X-Gal）(15). 无论是使用hGAIP还是rGAIP，我们在两种杂交分析中都获得了相同的定性结果。
体外试验互动。
hGAIP和RGS4被克隆到pGEX-KG（Pharmacia）和谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）融合蛋白表达于大肠杆菌并按所述进行净化(6). 已耦合在体外pCMV-Sport2（GIBCO/BRL）中mGIPC的转录翻译通过Tn个T兔网织红细胞裂解试剂盒（Promega）[35S] 蛋氨酸。测试在体外GAIP、RGS4和GIPC之间的相互作用，10μg GST-GAIP、GST-RGS4或GST被固定在谷胱甘肽-糖珠（Sigma）上，并用35S标记的在体外-在4°C下，在250μl缓冲液A（50 mM Hepes，pH 7.5/2 mM MgCl）中转化GIPC 2小时2/1 mM EDTA/100 mM NaCl），轻轻摇晃。在某些情况下，GST-GAIP与亲和纯化的GAIP C末端抗体（30或300μg）预先孵育（室温下1小时）。在其他方面35标有S的在体外-翻译后的GIPC在与GST–GAIP孵育之前，与hGAIP（10μM或1 mM）的10个C末端aa对应的肽预先孵育（室温下1小时）。在同一缓冲液中清洗珠子三次，再悬浮并在25μl Laemmli缓冲液中煮沸，上清液装载在SDS/12%聚丙烯酰胺凝胶上。凝胶干燥后，使用柯达X-Omat胶片进行放射自显影（16至72小时）。GIPC对应的条带通过使用扫描分析软件。
GIPC-GFP在哺乳动物细胞中的表达。
为了在哺乳动物细胞中表达带有C末端绿色荧光蛋白（GFP）标记的GIPC，将rGIPC的完整编码序列亚克隆到pEGFP-N1（Clontech）中。将CsCl纯化的质粒（4μl Lipofectamine加1μg质粒；GIBCO/BRL）转染到HeLa细胞（70%融合）中，该细胞在35mm孔中用盖玻片铺板。转染后20小时，用2%多聚甲醛将细胞固定在磷酸盐缓冲液中（30分钟），用Zeiss Axiophot（FITC激发和发射滤光片）观察GFP荧光信号。在某些情况下，用0.1%Triton X-100在PBS中渗透固定细胞，并用抗Man II的多克隆抗血清（稀释1:400）或亲和纯化的抗GAIP IgG孵育(8)其次是交叉吸收的德克萨斯红驴抗兔F（ab′）2共轭物（Jackson ImmunoResearch）。
抗-GIPC抗血清的制备。
将rGIPC亚克隆到pET28a（+）载体（Novagen）中，表达为His-tagged蛋白，在Ni-NTA琼脂糖珠（Qiagen，Chatsworth，CA）上进行亲和纯化，然后注射到兔子体内。抗血清通过免疫印迹（1:5000稀释）识别10-pg亲和力纯化的His-tagged rGIPC。它还通过对表达GIPC-GFP的HeLa细胞制备的裂解物进行免疫印迹，识别内源性GIPC（40 kDa）和GIPC-GFF（65 kDa。使用抗GFP抗体也检测到相同的65-kDa GIPC-GFP带。
内源性GIPC的免疫细胞化学定位。
对于免疫荧光，HeLa细胞被固定、渗透，并在抗GIPC IgG（1小时）和德克萨斯红驴抗兔F（ab′）中培养2同上。为了进行免疫金标记，将HeLa细胞固定在8%甲醛中（30分钟），4%甲醛中（1小时），并按照所述进行超薄冷冻切片处理(8). 超薄冰冻切片与抗GIPC IgG孵育，然后与5-nm金山羊抗兔IgG结合物孵育（Jackson ImmunoResearch）。切片在2%中性醋酸铀酰中染色10分钟，然后进行吸收染色，并包埋在3.2%醋酸铀酰、0.2%甲基纤维素和0.1%聚乙烯醇中。
膜组分的制备和分析。
按照AtT-20细胞的描述制备HeLa细胞组分(8). 核后上清液，100000×克上清液和100000×克颗粒按体积归一化，蛋白质通过SDS/PAGE分离(16)并转移到聚偏二氟乙烯膜上。使用抗GIPC抗血清（1小时，1:5000稀释）进行免疫印迹，然后使用辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG（Bio-Rad）（1小时、1:3000稀释）。通过增强化学发光（Amersham）进行检测，并使用扫描分析软件。
结果
GIPC的特点。
GIPC的预测分子量为36300，理论pI为5.7。推导出的氨基酸序列（图。A类)预测一种相当亲水的蛋白质缺乏跨膜结构域或N末端信号序列。杂岩分析显示了7个潜在的蛋白激酶C和6个潜在的酪蛋白激酶II磷酸化位点。序列比对显示三种哺乳动物GIPC蛋白和两种秀丽隐杆线虫蛋白质（图。A类). 在酿酒酵母基因组数据库。人类和大鼠的蛋白质有96%的一致性，小鼠和大鼠蛋白质有99%的一致性。哺乳动物GIPC蛋白与秀丽线虫蛋白质（C35和F-44）。A类爆炸搜索显示在aa 125和225之间存在PDZ结构域（图。A类). PDZ结构域包含80–100 aa，存在于许多信号分子中，参与蛋白质相互作用(17–19). 与其他PDZ结构域的序列比对表明，GIPC的PDZ结构段与阿托品-1相互作用蛋白1（AIP）的第三个PDZ结构区具有最接近的同源性，其中包含五个PDZ域(20)以及谷氨酸受体相互作用蛋白（GRIP）的第二个PDZ结构域，其中包含七个PDZ域(21)（图。B类). 一个酿酒酵母ORF（YJB7）与GIPC的PDZ结构域同源。两个未知功能的ORF（染色体III上的F44D12.4和C35D10.2）来自秀丽线虫基因组测序项目也显示出与PDZ域外GIPC的显著同源性。有趣的是，哺乳动物的PDZ结构域和秀丽线虫蛋白质的同源性（68%）高于它们的整体同源性。GIPC中的另一个假定功能基序由轮廓扫描分析(磷铝石程序）是一个酰基载体蛋白（ACP）结构域，aa 264和320。
GIPC专门与GAIP互动。
为了确定GIPC对GAIP的特异性，我们测试了RGS家族的其他几个成员RGS2、RGS4、RGS-r/RGS16和RET-RGS在双杂交系统中与GIPC相互作用的能力。受试者均未与GIPC发生交互作用（图。A类)包括与GAIP同源性最高的家族成员RET–RGS。我们得出结论，GIPC与GAIP的相互作用对GAIP具有高度的特异性。
（A） GIPC专门与GAIP互动。(B类)GIPC与GAIP的C终端交互。(C类)GAIP与GIPC的PDZ域交互。对亮氨酸进行β-半乳糖滤过试验负极，色氨酸负极平板，颜色强度评分如下：−−，16小时后无颜色（背景）；+/-，非常微弱的颜色（但16小时后高于背景）；+++，2小时后呈现强烈的颜色。将与空诱饵和猎物载体共转化的酵母作为背景。
GIPC与GAIP的C终端交互。
为了确定GIPC与GAIP的相互作用位点，我们使用了双杂交β-半乳糖滤过试验。GIPC与GAIP的N末端（aa 1–79）没有相互作用，与RGS结构域（aa 80–206）的相互作用极弱（图。B类). 当包含GAIP的C末端（aa 206–217）时，我们观察到与GIPC的强相互作用。接下来，我们直接测试了GAIP的C末端11 aa，发现它与GIPC相互作用，证明GAIP的这个区域负责GIPC结合（图。B类). 删除GAIP C末端的最后一个氨基酸（丙氨酸）可消除这种相互作用。这些结果(我)证明GAIP的C终端负责其与GIPC的绑定，以及(ii（ii）)将GAIP的C末端丙氨酸残基最多定义为结合中的主要决定因素。
GAIP与GIPC的PDZ域进行交互。
为了确定GIPC的哪个区域与GAIP相互作用，我们将分子分为三部分：N末端（aa 1–130）、PDZ（aa 124–226）和C末端（aa210–333）域，并在双杂交分析中测试了这三个域与GAIP的相互作用。图。C类表明GIPC的PDZ而非N端和C端域与GAIP相互作用。
GST–GAIP与体外-翻译GIPC。
我们还执行了在体外GST–GAIP与谷胱甘肽-淀粉颗粒结合的相互作用分析在体外-翻译成GIPC。GIPC弱但特异性地结合到GST-GAIP（图。，车道3），但不限于GST（图。，车道2）。相比之下，GIPC和RGS4之间未检测到相互作用（图。，车道4）。正如预期的那样，RGS域GAIP80–206（图。，车道5）和N终点，GAIP1–79（图。，通道6），未绑定到GIPC。当GST–GAIP与亲和纯化的IgG（300μg）预孵育于hGAIP的C末端（aa 208–217）时，与GIPC的结合被取消（图。，泳道5），而相同量的无关抗体不干扰结合（图。，车道6）。此外，当GAIP C末端肽添加到结合混合物中时，它减少了相互作用（图。，通道8），而无关肽没有（图。，车道9）。总之，这些结果证实GIPC与GAIP的C末端特异性结合。
GIPC专门与GAIP进行交互在体外结合到谷胱甘肽-甘露糖珠的GST融合蛋白与在体外-翻译，无线电标记GIPC，如所述。GIPC专门绑定到GAIP（第3通道），但不单独绑定到GST（第2通道）。GIPC没有绑定到RGS4（通道4），也没有绑定到GAIP（GAIP）的RGS域80–206，通道5），或GAIP的N终端域（GAIP1–79，车道6）。GIPC在35标有S的在体外-翻译后的GIPC产品。
GIPC与GAIP的C终端交互。GST-GAIP融合蛋白与谷胱甘肽-甘露糖珠结合，与在体外-翻译后的GIPC（车道3）如所述。添加30μg（通道4）或300μg（路径5）抗GAIP C末端IgG减少GIPC与GAIP的结合，而300μg抗CALNUC抗体（通道6）的作用最小。当添加10μM（第7道）或1 mM（第8道）GAIP C末端肽时，GIPC与GAIP的结合也分别减少了16%和43%。对照肽（1 mM，第9通道）对结合几乎没有影响。仅与GST结合（通道2）被视为背景，GIPC与GST-GAIP结合后获得的信号（通道3）（减去背景）被定义为以任意单位表示的100%。车道1，35标有S的在体外-翻译的GIPC产品。
GIPC mRNA在哺乳动物组织中广泛表达。
在多人组织Northern印迹中，检测到≈1.8kb的信使核糖核酸：胰腺>骨骼肌>大脑、肾脏、胎盘>肺、肝、心脏（图。). 在人类组织中，GIPC和GAIP mRNA的表达存在几个显著差异：在大脑、肾脏和骨骼肌中，GAIP的表达远低于GIPC，而在肺和肝中，GAAP的表达高于GIPC(6). 大鼠和小鼠不同组织中GIPC mRNA表达的差异性相同。人类和大鼠的mRNA大小相同，但小鼠的mRNA稍大（≈2.0 kb）（数据未显示）。
人类GIPC mRNA的表达和组织分布。使用增感屏在−70°C下暴露放射自显影16小时。hGIPC显示了一个普遍存在的1.8kb转录物，在胰腺、骨骼肌、肾脏、胎盘和大脑中的表达水平最高。
GIPC与细胞膜和细胞液组分相关。
接下来我们研究GIPC是一种可溶性（细胞溶质）蛋白还是膜相关蛋白。粗膜（100000×克颗粒）和胞质（100000×克从HeLa细胞制备的上清液）组分表明，细胞溶质（70%）和膜（30%）组分中都存在GIPC（图。). 与模拟转染细胞相比，转染和过度表达GIPC-GFP的HeLa细胞中GAIP的表达水平及其分布保持不变（数据未显示）。
GIPC存在于细胞膜和细胞溶质部分。在HeLa细胞中，大多数内源性GIPC（70%）存在于由核后上清液（PN）制备的可溶性（S）或细胞溶质部分中，但剩余的（30%）与膜颗粒沉淀。用抗GIPC免疫印迹部分，用增强化学发光检测抗血清，并按所述进行定量。
GIPC-GFP在HeLa细胞中的分布。
为了确定GIPC的定位，我们首先用融合到其C末端的GFP标签表达该蛋白。用GIPC–GFP转染HeLa细胞，并在转染后20–24小时通过荧光分析，以避免过度表达。在不同的细胞中观察到三种不同的GIPC-GFP信号模式：扩散细胞质染色（63%的转染细胞）（图。C类)，明亮的点状细胞质染色（23%的转染细胞）（图。 A类和B类)和浓缩的近核信号（转染细胞的14%），部分与高尔基体标记Man II重叠。GIPC–GFP和GAIP的信号似乎没有明显重叠。
GIPC-GFP和内源性GIPC在HeLa细胞中的定位。相位对比度(A类)和荧光(B类,C类,E、，和如果)瞬时转染GIPC-GFP的HeLa细胞的显微照片。转染20小时后出现两种染色模式：点状(B类)和漫反射(C类)细胞溶质染色模式。(D类)免疫荧光显示，在未转染的HeLa细胞中，内源性GIPC显示出类似的弥散和点状囊泡染色模式。(E类)当表达GIPC-GFP的细胞用亲和纯化的GAIP-IgG染色时，GIPC-GFP的分布几乎没有重叠(E类)和增益增益(如果). 在D类，将未转染的HeLa细胞与醛混合，并与兔多克隆抗GIPC抗体孵育，然后再与德克萨斯州红结合驴抗兔F（ab′）孵育2如上所述。(×600.)
内源性GAIP的定位。
当内源性GIPC通过免疫荧光和抗GIPC IgG定位时，其分布与转染细胞中的分布相似，因为它以扩散和点状染色模式分布在细胞质中（图。D类). 转染HeLa细胞中未出现浓缩的近颗粒模式。通过在HeLa细胞的超薄冰冻切片上进行免疫金标记，GIPC通常在细胞膜附近的小泡膜的细胞质表面上检测到（图。). 细胞质中也检测到分散的金颗粒。我们假设弥漫性细胞质染色和囊泡标记分别对应于GIPC的可溶性和膜相关池。
GIPC与HeLa细胞中的小泡有关。(A类和B类)金颗粒出现在囊泡（箭头）上，囊泡通常呈簇状排列，位于质膜（PM）附近。一些金颗粒散布在细胞质中（箭头）。按说明处理细胞。用兔抗GIPC-IgG多克隆抗体和5-nm金、羊抗兔IgG结合物依次培养超薄冰冻切片。(×120,000.)
讨论
到目前为止，已经鉴定出20多种不同的RGS蛋白(1–三). 除了RGS结构域具有高度同源性并已被证明与G蛋白α亚单位结合外，这些蛋白质几乎没有序列相似性，这表明不同家族成员之间的相互作用和功能存在差异。
一些功能已经被归因于单个RGS蛋白的N末端（例如，膜锚定）。我们之前提供了GAIP具有N端半胱氨酸串基序的证据(7)这可能将其固定在膜上，RET–RGS也显示出了同样的作用(10). RGS4的N-末端33aa也被发现是其定位到质膜所必需的，并且该结构域的缺失损害了RGS4的功能(22). 其他四个RGS家族成员，SST2来自酵母，FLBA来自曲霉属，EGL-10来自秀丽线虫和哺乳动物RGS7具有N末端DEP结构域，可能在小GTP结合蛋白调节GDP-GTP交换中发挥作用。
到目前为止，关于RGS蛋白C末端相互作用的信息几乎不存在。利用酵母双杂交系统，我们鉴定了一种PDZ结构域蛋白GIPC，它与GAIP的C末端特异性相互作用。80–100 aa PDZ结构域（以哺乳动物突触后密度蛋白PSD-95命名，Dlg，果蝇属圆盘大蛋白和哺乳动物紧密连接蛋白ZO-1）存在于50多个蛋白质中，这些蛋白质通常是信号网络的组成部分。PDZ结构域没有明确定义的功能，但通常涉及蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质网络的形成(17–19). 一些含有PDZ结构域的蛋白质参与G蛋白介导的信号通路。研究得最好的是果蝇属Ina D蛋白通过五个PDZ结构域作为支架，组装光转导级联的不同组件，即G蛋白效应器磷脂酶C-β、光激活钙通道和蛋白激酶C(23). 一些PDZ结构域与其他蛋白质末端C端的特定基序[（S/T）XV]结合(24–26). GAIP在其C末端包含一个相似但独特的基序（SEA），这与我们的发现一致，即其C末端与GIPC的PDZ域相互作用。GAIP的最后一个氨基酸（0位）对结合的重要性通过我们的发现得到了证明，该残基的缺失消除了与GIPC的相互作用。我们发现，最后三个氨基酸为VEA的RET–RGS与GIPC没有相互作用，这表明位置-2的丝氨酸残基对于GAIP与GIPC PDZ结构域的结合至关重要。
最近的罗塞特等. (27)利用HTLV-1中的病毒Tax转录激活蛋白作为诱饵，通过双杂交筛选分离出不完整的GIPC cDNA。在他们的报告中，GIPC（他们将TIP-2命名为Tax相互作用蛋白）克隆2)是六种功能未知的细胞蛋白之一，它们通过PDZ结构域与Tax的C末端相互作用。将Tax的最后一个缬氨酸改为丙氨酸（TEV改为TEA）可以消除Tax与除GIPC以外的所有上述六种蛋白质的相互作用。因此，GAIP和Tax都可以与GIPC的PDZ域交互。这一发现表明，当丙氨酸或缬氨酸存在于C末端的0位时，GIPC的PDZ结构域可以相互作用。有趣的是，CXC趋化因子受体5是HTLV-1/HIV的共受体，与Gα我信号传导途径(28). 最近下雪了等. (29)显示RGS12的交替剪接形式包含N端PDZ结构域和C端PDZ结合基序（ATFV）。RGS12的PDZ结构域能够与白细胞介素8受体B（也称为CXC趋化因子受体2）的C末端相互作用。这些作者还认为CXC趋化因子受体5（STGL）的C末端具有潜在的RGS12 PDZ结合基序。
有趣的是，除了PDZ域外，GIPC在其C端还包含一个ACP域。ACP结构域存在于动物脂肪酸合成酶中，并作为酰基部分的受体发挥作用(30). 该特征表明GIPC可能作为棕榈酰部分的载体分子，在GAIP、Gα亚基或其他信号分子的棕榈酰化中发挥作用。
虽然基于Northern blot分析，GIPC和GAIP显示出相当普遍的组织分布，但它们在大多数被检测组织中的mRNA表达水平相差很大。通过免疫印迹法，我们没有发现由于GIPC的短暂过度表达（≈25%转染效率）导致HeLa细胞中GAIP表达水平发生显著变化。需要分析这两种蛋白质的内源性表达水平及其在不同组织中的内在稳定性，以阐明GAIP和GIPC表达之间的关系。
我们最近发现GAIP与膜有关(7)具体定位于与膜运输有关的氯氰菊酯包衣囊泡(8). 在胞质溶胶中发现了PDZ结构域蛋白，与膜（通常是质膜）或细胞核有关(17–19). 我们的生化结果和免疫细胞化学结果表明，HeLa细胞中有两个GIPC池：一个膜相关，一个可溶性。通过免疫荧光，GIPC的膜相关池具有点状、细胞质分布，电子显微镜水平的免疫金标记显示其与经常位于细胞膜附近的小泡有关。有趣的是，当用免疫荧光分析GFP–GIPC和GAIP的分布时，几乎没有重叠。由于缺乏合适的抗体（均为兔多克隆抗体），目前尚不可能在电子显微镜水平上同时定位GAIP和GIPC。需要进一步研究以确定GAIP和GIPC是否位于相同或不同的囊泡上。GAIP结合GIPC和Gα的能力i3类(6,7)GAIP和GIPC均与囊泡相关，这一发现表明这些蛋白可能是G蛋白相关信号网络的组成部分，参与控制囊泡运输。
致谢
这项研究得到了美国国立卫生研究院CA 58689和DK 17780（致M.G.F.）的支持。X.L.是生物医学科学研究生项目的成员，G.Z.和B.Z.是加州大学圣地亚哥分校分子病理学研究生项目成员。我们感谢Micahel McCaffery（免疫细胞化学核心）准备图。。
缩写
| ACP公司 | 酰基载体蛋白 |
| 美国东部时间 | 表达序列标签 |
| 绑腿 | Gα相互作用蛋白 |
| 间隙 | GTPase激活蛋白 |
| GFP公司 | 绿色荧光蛋白 |
| RGS公司 | G蛋白信号调节器 |
| 消费税 | 谷胱甘肽S公司-转移酶 |
| β-加仑 | β-半乳糖苷酶 |
| 第页 | 老鼠 |
| 米 | 鼠标 |
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