Ku70依赖性氘化对促凋亡因子Bax的调节

摘要

程序性细胞死亡或凋亡是去除不需要或受损细胞的自然过程，是生物体生命周期正常运行所必需的(1,2). 细胞凋亡被证明参与了许多过程，包括胚胎发育、细胞损伤反应和衰老，并作为一种肿瘤抑制机制。因此，了解细胞凋亡的分子调控具有重要的治疗意义。

有两种途径可以诱导细胞凋亡，一种是外源性的，另一种是内源性的，这两种途径在死亡信号的传递机制上有所不同(2). 虽然外源途径是通过配体与死亡受体的结合而激活的，但内源途径是通过细胞应激激活的，例如DNA损伤。内在途径涉及细胞色素的释放c（c）与凋亡蛋白酶激活因子1（APAF1）、细胞色素c（c）激活caspase9，导致下游caspase的激活和死亡反应的诱导。

内在途径调控的关键参与者包括Bcl2蛋白家族，它可以影响线粒体外膜的通透性(三). Bcl2蛋白家族的成员分为促凋亡蛋白（如Bax、Bak和Bok）和抗凋亡蛋白（包括Bcl2、Bcl-X、Bcl-w和Mcl-1）。第三个亚家族的蛋白质称为BH3-only蛋白质，被认为是细胞凋亡的启动子，可能通过调节其他两个亚家族中的Bcl2-样蛋白发挥作用。

在健康细胞中，Bax以单体形式存在，要么存在于胞浆中，要么与线粒体外膜弱结合。在细胞凋亡的刺激下，Bax经历一系列构象变化并转移到线粒体，在那里它锚定在线粒体膜上。Bax易位后，寡聚成大型复合物，这对线粒体膜的通透性至关重要(4). 鉴于Bax在介导细胞凋亡中的核心作用，它通过与其他蛋白质结合和翻译后修饰而受到严重调控。

至少四种蛋白质，Bcl2(5), 14–3-3 (6)，人道主义(7)和Ku70(8–11)研究表明，Bax通过与Bax结合并将其与线粒体隔离来负向调节凋亡。然而，尽管与这些蛋白质结合表明Bax在胞浆中的滞留是一种优雅的机制，但这并不能解释Bax在凋亡刺激后如何与这些蛋白质分离。最近，研究表明，Ku70羧基末端两种关键赖氨酸的乙酰化导致Bax从Ku70中解离，因此，细胞对凋亡刺激的敏感性增加(8,9). 然而，Ku70^−/−小鼠的突变在产前不是致命的，而Ku70^−/−小鼠的基本凋亡水平仅在大脑中显著增加(12)在胃肠组织中(13)表明Ku70释放后的其他步骤也可以调节Bax的激活。

在本文中，我们表明Ku70的缺失导致泛素化Bax的积累。在正常生长条件下，该改性标记Bax降解。凋亡诱导导致泛素化Bax水平降低，这一现象在Ku70缺陷细胞中显著延迟。此外，重组Ku70将多泛素链水解为单泛素单元，并将重组Ku70添加到Ku70的蛋白提取物中^−/−细胞导致泛素化的Bax水平下降。因此，Ku70通过从线粒体隔离Bax和调节Bax氘化来调节Bax介导的凋亡。

结果

最近研究表明，DNA修复蛋白Ku70通过将Bax与线粒体隔离来负向调节凋亡(图1) (8,10). 然而，鉴于发现的隔离Bax的蛋白质数量不断增加，Ku70在其与Bax的关联中的独特作用尚不完全清楚。为了加深我们对这种关联的理解，我们在正常生长条件下跟踪了Bax在没有Ku70的情况下的命运。

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图1。

Ku70负调控Bax介导的细胞凋亡。Ku70与促凋亡蛋白Bax之间的结合将Bax从线粒体中隔离。在正常生长条件下，NAD将Ku70维持在非乙酰化状态⁺-依赖性SIRT1脱乙酰酶和迄今尚未鉴定的组蛋白脱乙酰酶（HDAC），使其能够与Bax结合。凋亡刺激后，CBP和PCAF乙酰转移酶乙酰化Ku70上的特异性赖氨酸，导致Ku70构象改变和Bax释放；然后释放的Bax作用于启动细胞凋亡。

Ku70水平降低促进Bax高分子量异构体的积累。

人骨肉瘤U2OS细胞中Ku70水平通过过表达siRNA或Ku70反义序列而降低(图2A类). 在这两种情况下，Ku70蛋白水平的降低导致Bax的高分子量异构体的积累，这是通过特异性兔多克隆抗体检测到的。同样，这些亚型在Ku70中更为丰富^−/−小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）与野生型MEF的比较(图2B类).

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图2。

Ku70水平的降低促进Bax泛素化。(A类)通过在U2OS细胞中过度表达针对Ku70的反义或siRNA序列（As-Ku70；siRNA Ku70）来降低Ku70的水平，导致高分子量修饰形式Bax的积累。(B类)在Ku70中，Bax的高分子量修饰形式明显更丰富^−/−MEF与野生型MEF的比较。(C)HEK293T细胞与HA-标记的泛素表达载体以及对照siRNA（中心通道）或针对Ku70（右通道）质粒的siRNA共同转染。用抗HA抗体沉淀免疫复合物，用SDS/PAGE分离，并用HRP偶联抗Bax抗体进行免疫印迹。免疫印迹上泛素化Bax的不同大小由小箭头标记。此外，还单独装载了IgG的额外对照物（左车道），以区分来自免疫复合物和泛素化Bax的抗体。(天)用来自HEK293T的抗Bax抗体沉淀免疫复合物，该抗体过度表达对照siRNA（中间通道）或抗Ku70的siRNA（右通道），并用抗泛素抗体进行免疫印迹。仅IgG也被加载（左车道）。在所有实验中，β-肌动蛋白起到了负荷控制的作用。U、 未修饰的Bax；M改性Bax。

Ku70乙酰化导致Bax从Ku70中分离(8). 因此，用蛋白脱乙酰化酶抑制剂治疗可促进Ku70乙酰化和Bax介导的细胞凋亡(8). 用去乙酰化酶抑制剂处理人类胚胎肾（HEK）293T细胞，剂量增加Ku70乙酰化和Bax释放，但不增加凋亡水平，促进了高分子量Bax修饰形式的积累（数据未显示）。综上所述，这些结果表明Ku70的一个原因^−/−Bax蛋白的这些修饰对Bax介导的细胞凋亡具有负调节作用，因此小鼠不会因过度凋亡而在产前死亡。

Bax泛素化促进其降解并在凋亡刺激下降低。

蛋白质泛素化通过蛋白酶体介导蛋白质降解，并作为调节蛋白质功能的翻译后修饰。Ku70的治疗^−/−含有蛋白酶体抑制剂MG-132的细胞增加了修饰Bax的水平(图3A类). 硼替佐米（Velcade或PS-341）是一种有效的蛋白酶体抑制剂，已被批准作为治疗多发性骨髓瘤的临床药物(15). 同样，用蛋白酶体抑制剂硼替佐米治疗表达Ku70水平降低的HEK293T细胞，导致修饰Bax的积累(图3B类). 因此，Bax泛素化通过靶向Bax降解蛋白酶体发挥抗凋亡作用。Staurosporine（STS）可诱导Bax介导的细胞凋亡(16). STS刺激凋亡后野生型细胞Bax泛素化的时间-过程分析显示，治疗后4 h泛素化Bax水平显著降低。(图3C). 这些发现表明，Bax泛素化抑制Bax功能，Bax必须进行氘化以介导凋亡。

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图3。

Bax泛素化促进其降解，并在凋亡刺激下降低。(A类)Ku70的治疗^−/−含有蛋白酶体抑制剂MG-132的细胞增加了泛素化Bax的水平。(B类)用蛋白酶体抑制剂Bertozomib（Velcade或PS-341）处理过表达抗Ku70 siRNA的HEK293细胞，可增加泛素化Bax的水平。针对过度表达对照siRNA的HEK293细胞验证了Ku70水平的降低（数据未显示）(C)在staurosporine-STS诱导Bax介导的野生型细胞凋亡之前（0）或之后的不同时间，使用Bax多克隆抗体通过Western blot对泛素化Bax水平进行时间-过程分析。在所有实验中，β-肌动蛋白水平作为负荷控制。U、 未改性Bax；M、 改良Bax。

Ku70-依赖性Bax脱泛素化。

Ku70缺陷细胞泛素化Bax水平的增加表明，当Ku70与Bax分离并且不再将其与线粒体隔离时，Bax泛素化可能保护细胞免受Bax介导的凋亡。在这种情况下，Bax从Ku70释放后将被泛素化，作为对不受控制的细胞凋亡的额外保护水平。令人惊讶的是，Ku70中Bax泛素化的时间过程分析^−/−单元格(图4A类)或在凋亡刺激后被siRNA敲除Ku70的细胞中（数据未显示），泛素化Bax水平增加而非减少。因此，Ku70可能会促进Bax的氘化，特别是在细胞凋亡期间。

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图4。

Ku70介导Bax氘化。(A类)staurosporine-STS诱导Bax介导的Ku70细胞凋亡前（0）或诱导后不同时间用Bax多克隆抗体Western blot分析泛素化Bax水平^−/−细胞。(B类)体外Ku70中Bax的氘化反应^−/−补充PBS或重组Ku70-rKU70的细胞提取物。(C)体外Ku70中Bax的氘化反应^−/−在蛋白酶体抑制剂MG-132存在下生长的细胞。用PBS或rKu70补充提取物。(天)在添加DMSO或蛋白酶体抑制剂MG-132的培养基中生长的野生型细胞中泛素化Bax的水平。(E类)体外对添加BSA和rKu70的均质四泛素链进行不同时间段的氘化分析，证明Ku70具有固有的DUB酶活性。仅将四泛素或四泛素与BSA共同孵育，并没有诱导四泛素链水解为单泛素单元。在A–Dβ-actin水平作为负荷控制。U、 未改性Bax；M、 改良Bax。

为了测试Ku70在Bax氘化中的这种可能作用，我们跟踪了Bax氘化的速率在体外在Ku70^−/−细胞提取物中添加重组Ku70或PBS。在37°C下60分钟后，添加Ku70的提取物中Bax氘化程度显著增加(图4B类)即使存在蛋白酶体抑制剂MG-132(图4C). 此外，MG-132或硼替佐米治疗增加了Ku70中泛素化Bax的水平^−/−(图3 A类和B类)但在野生型细胞中没有(图4天和数据未显示）。这些结果表明，Ku70可能具有内在的氘化（DUB）酶活性。为了探索这种可能性，重组Ku70与均质六泛素（K48-Ub）孵育₆，数据未显示）或四泛素（K48-Ub₄)不同时间段的链。引人注目的是，重组Ku70将多泛素链水解为单泛素单元(图4E类). 硫醇阻滞剂，N个-乙基马来酰亚胺（NEM）可以抑制DUB酶的活性(17). 正如所料，Ku70对NEM治疗敏感在体外（未显示数据）。因此，综上所述，这些结果表明Bax氘化而非Bax降解就其本身而言依赖Ku70。这些发现表明Ku70介导Bax的氘化是一个有吸引力的模型，该过程在凋亡刺激下增强，从而导致细胞死亡。

讨论

最近发现DNA修复蛋白Ku70通过与促凋亡因子Bax结合抑制凋亡(8,10,18,19). 然而，尚不清楚Ku70是否只是Bax的一个“停车位”，也不清楚它是否对Bax的其他更具体的监管活动进行调解。此外，Ku70的观察结果^−/−小鼠不会在出生前死亡。这表明，在缺乏Ku70的情况下，其他机制必须防止不受控制的Bax介导的细胞凋亡，但这些途径的性质尚不清楚。在本研究中，我们探讨了这些问题，并跟踪了Bax在正常无应力生长条件下在没有Ku70的情况下的命运。我们表明，在没有Ku70的情况下，Bax被泛素化严重修饰，泛素化标记Bax用于蛋白质体降解。在野生型细胞中，凋亡刺激增加了Bax氘化的速率，而在没有Ku70的情况下，这一过程被延迟。最后，Ku70在多泛素链上具有固有的DUB活性并促进Bax氘化在体外.

综上所述，我们的数据表明Bax调控的机制。在正常的非应激条件下，Bax合成后会发生泛素化，泛素化通过标记其蛋白酶体降解来负向调节其促凋亡功能。与Ku70的关联介导并促进Bax氘化，这是一个在凋亡刺激后增强的过程。在凋亡刺激下，Ku70被乙酰转移酶CBP或PCAF乙酰化并释放Bax(8). 游离的细胞溶质中未联喹啉化的Bax定位于线粒体，在线粒体中介导细胞凋亡(图5).

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图5。

提出了Ku70调控Bax介导的细胞凋亡的模型。新合成的Bax经历泛素化，通过标记其蛋白酶体降解来负向调节其促凋亡功能。Bax泛素化后与Ku70结合，Ku70介导Bax氘化，同时产生Bax活性形式并将其从线粒体中隔离。在凋亡刺激后，Ku70被CBP或PCAF乙酰化并释放Bax。然后，游离的细胞溶质中未泛素化的Bax可以定位于线粒体，在线粒体中执行程序性细胞死亡。

我们目前对Bax泛素化的描述，结合先前的研究结果，证明Ku70的乙酰化状态调节Bax与Ku70的关联，提出了一个关于正常和应激条件下这些调节步骤的顺序的有趣问题。在正常生长条件下，Ku70的缺失导致泛素化Bax的积累。野生型修饰Bax水平的时程分析表明，在staurosporine介导的凋亡信号后，泛素化Bax水平下降，而在没有Ku70的情况下，这种下降明显延迟(图3C和​和44A类). 因此，Bax的泛素化独立于Ku70和Bax之间的关联发生，而Ku70在凋亡信号后诱导Bax的氘化。使用脱乙酰酶抑制剂治疗可增加泛素化Bax的水平，这一观察结果表明，Bax的氘化发生在Ku70乙酰化释放Ku70中的Bax之前。因此，我们提出以下细胞事件顺序：首先，新合成的Bax泛素化，然后泛素化的Bax与Ku70结合。这种与Ku70的结合将Bax从线粒体中隔离，使Ku70能够介导Bax的氘化，而不会立即诱导凋亡。凋亡信号增强了去泛素化，在这个过程的后期，这将导致Ku70的K539和K542的乙酰化和Ku70-Bax复合物的解离。

尽管Ku70在介导Bax氘化中发挥作用，但在有或无凋亡刺激的Ku70缺陷细胞中观察到未修饰的Bax（本研究和参考文献。8和20). 这些未修饰Bax蛋白的来源可以用两种可能的情况来解释。首先，除Ku70外，其他DUB酶可能修饰Bax，尤其是在凋亡刺激后。然而，这种解释的可能性较小，因为我们的发现不支持这种可能性。即使在用STS治疗Ku70缺陷细胞16小时后，观察到泛素化Bax的积累而不是减少。因此，如果存在其他可能的DUB，则只有在凋亡刺激后的第一个16小时后才会修改Bax。第二种可能的解释，我们认为是一种更合理的解释，可能是观察到的未修饰Bax是在其泛素化之前新合成的Bax，或者是与Ku70以外的其他蛋白质（如Humanin或Bcl2）相关联的未修饰的Bax。

Ku70系列^−/−细胞对Bax介导的凋亡更敏感(20). 然而，我们的研究结果表明，在没有Ku70的情况下，泛素化Bax的水平增加。理解这一明显矛盾的关键在于凋亡信号后Ku70–Bax解离的时间。在凋亡刺激后，只有当Bax与Ku70无关时，Bax才会转移到线粒体。当Ku70乙酰化时，Ku70在凋亡刺激后1至4小时释放(8). 在没有Ku70的情况下，Bax不受Ku70乙酰化时间的限制，并且可以比Ku70早转移到线粒体^+/+细胞。因此，在Ku70缺陷细胞中，Bax介导的凋亡率将比野生型细胞更快。

出现的一个有趣的问题是在Bax去泛素化过程中Ku70的生物化学活性的性质。Ku70本身是否催化Bax氘化，或者Ku70仅介导Bax上未知DUB酶的酶活性？Ku70能够水解各种多泛素链（六或四）的发现在体外(图4E类)，强烈支持Ku70的直接氘化活性。有趣的是，序列分析没有发现与四个已知DUB类别（OUT、UCH、USP和JAMM）的DUB基序有任何相似之处(21)在Ku70的蛋白质序列中。然而，我们在Ku70中发现了一个与UIM/MJD DUB类图案相似的区域(21) [支持信息（SI）图S1]. Ku70是否表达DUB酶活性尚待确定体内或促进特定DUB和泛素化Bax之间的联系。

与Bax类似，另一种参与细胞凋亡的关键蛋白是转录因子p53，该蛋白受泛素化调节(22). 研究表明，p53的泛素化可以调节其水平和活性。虽然一些形式的泛素化标记p53用于降解，但其他类型的标记会导致p53移位到胞浆(23). p53的核输出可能将该蛋白与其主要转录靶点隔离，同时保持其活性形式。重要的是要探讨Bax也可能受不同类型的泛素化调节的可能性，以及Ku70依赖的氘化决定了这些形式之间的平衡。这些不同类型的泛素化有可能控制Bax生物化学的许多方面，包括其与其他蛋白质的关联、定位和二聚。

Bax与细胞质中的几种蛋白质相关，包括Bcl2(5), 14-3-3 (6)，人道主义(7)和Ku70(8,10,11). 有人提出，这些蛋白质中的每一个与Bax的结合都将其与线粒体隔离开来，并防止细胞凋亡。然而，目前尚不清楚为什么需要四种不同的蛋白质来隔离Bax。在野生型细胞中，凋亡刺激导致Bax泛素化减少，这一发现表明Bax泛碱化具有抗凋亡作用。因此，Ku70和Bax之间的结合具有双重功能，将Bax与线粒体隔离并介导Bax氘化。与Ku70结合的双酰化Bax允许细胞维持用于凋亡的活性Bax的库。因此，在暴露于应激的情况下，细胞可以通过Ku70乙酰化和Bax释放立即激活其凋亡程序。

Ku70的DUB活动范围有多广？人们可以从脱乙酰酶的研究中回答这个有趣的问题。体外HDAC作为SIRT1的脱乙酰化对其脱乙酰酶活性没有特异性(24). 此外，我们无法找到脱乙酰化共识序列生物信息学（未显示数据）。然而，体内SIRT1和其他HDAC只对乙酰化蛋白质全谱范围内的有限蛋白质进行脱乙酰化。因此，脱乙酰酶的特异性是通过与底物的结合来实现的。与脱乙酰酶类似，我们认为特定DUB与其底物之间的关联决定了其特异性。事实上，我们的结果支持这种操作模式，因为Ku70可以氘化Bax体内和在体外(图4 B类和C)并能将非特异性多泛素链氘化在体外(图4E类). 研究Ku70作为DUB酶在其他Ku70相关途径（例如DNA双链断裂修复）中的作用将非常有趣。

蛋白质泛素化被证明可以控制许多细胞功能，包括细胞周期、DNA修复、细胞增殖和凋亡(25,26). 考虑到这种细胞途径的多样性，泛素化机制或泛素信号的改变被发现在许多病理学中发生，包括癌症，这并不奇怪(26). 大量实验和临床数据表明，细胞周期成分或内务基因的蛋白水解缺陷与各种恶性肿瘤之间存在关联。此外，泛素化被证明可以调节几种对肿瘤发展具有重要活性的蛋白质，包括p53(27)和NFκB(28). 因此，泛素化可以通过增加细胞凋亡和抑制细胞周期的正常进展，发挥肿瘤抑制机制的作用。最近，人们投入了越来越多的精力来鉴定可作为泛素化系统调节剂的小分子，从而抑制恶性肿瘤的发展(15,29,30). 在使用脱乙酰酶抑制剂促进细胞凋亡作为癌症治疗方面也投入了类似的努力(31,32). 我们的研究结果表明，通过诱导细胞凋亡，可以实现对恶性肿瘤的最大抑制。这种方法应包括以下药理操作：首先，用蛋白酶体抑制剂（如MG-132或硼替佐米）治疗，以增加与Ku70相关的泛素化Bax的量。在经过足够的时间使Ku70能够促进Bax的氘化，从而增加活性Bax的储备后，应使用脱乙酰酶抑制剂进行处理，以将Ku70从Bax中分离出来，从而诱导Bax介导的凋亡。如果颠倒治疗顺序或同时进行两种治疗，预计会导致低效、泛素化形式的Bax的积累。

实验程序

致谢。

脚注

工具书类