介绍
脊椎动物检测头部角运动的能力在于内耳的前庭装置[1]–[3].器械的这一部分由三个充满液体的半规管（前、侧和后）组成，它们在几乎正交的平面上定向(). 每个管都包含一个扩大的壶腹，其中包含感觉组织壶腹嵴，由感觉毛细胞和支持细胞组成。在鸟类和小鼠等许多物种的前嵴和后嵴中，有一个非感觉结构，即十字隔，它将感觉区分成两个相等的部分[4],[5]外侧嵴中不存在交叉中隔。所有脊椎动物中常见的其他前庭感觉器官是椭圆囊和球囊的黄斑，用于检测头部位置和线性加速度。在鱼类中，囊状突起的黄斑也用于听觉[6].
小鼠内耳从11.5到13 dpc发育的示意图。（A） 上面板显示了通过线水平的前瞻性或明确的前、后根管的横截面示意图。蓝色标记三个Bmp4型-阳性的推定嵴，而红色标记其他三种感觉组织，即椭圆斑和球状斑，以及Corti器官。成熟前嵴在15.5 dpc或更晚时扩大。（B–I）内耳表型英国标准普尔4有条件的空胚。全量原位杂交英国标准普尔4loxP/+（B、D、F、H）和福克斯1cre公司/+;Bmp4型液氧P/温度1(B4奇科10.5 dpc的胚胎与英国标准普尔4外显子3和4的RNA探针(B4-德尔). （B，C）箭头指向下调英国标准普尔4在眼睛和耳囊中的表达福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1（C） ，与相比英国标准普尔4loxP/+胚胎（B）。箭头指向未受影响的英国标准普尔4在肢芽和体节中表达。（D） 和（E）分别是（B）和（C）所示的耳囊的较高放大倍数。（D）中的箭头和箭头指向英国标准普尔4杂交信号分别位于耳囊肿的前条纹（包括前嵴和外嵴）和后嵴。（E）中的箭头指向残差英国标准普尔4在前条纹中的表达福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4loxP/Tm1胚胎。（F–I）放大倍数更高英国标准普尔4眼睛（F，G）和后脑（H，I）的表达域英国标准普尔4loxP/+（F、H）和福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1（G，I）胚胎。箭头指向的是英国标准普尔4表情和眼睛畸形，而箭头指向正常英国标准普尔4后脑的表达。（C）中的比例尺适用于（B）；（D）、（G）和（I）中的刻度条等于100μm，分别适用于（E）、（F）和（H）。缩写：aa，前壶腹；ac，前嵴；asc，前半规管；cc，小腿共同；cd、耳蜗管；ed，内淋巴管；fp，融合板；hp，水平管袋；la，侧壶腹；lc，侧嵴；lsc，外侧半规管；oc，Corti器官；pa，后壶腹；pc，后嵴；psc，后半规管；rd，吸收结构域；s、 球囊；u、 胞果；vp，垂直管袋。
脊椎动物内耳内的所有感觉斑，包括假定的嵴，都被认为是在耳板和耳囊肿阶段由一个共同的前庭（神经/感觉能力）区域产生的(红色和蓝色；[7],[8]). 这个前感觉域也产生了神经细胞，这些神经细胞支配内耳的各种感觉斑。这三个半规管是由发育中的耳囊肿的两个上皮外流形成的无感觉结构。垂直前缘形成由共同小腿连接的前后根管，而水平前缘形成外侧根管。在小鼠中，该器官的形态发生大约在交配后10.5天（dpc）开始，到13dpc完成[9]在鸡中，它从胚胎第3.5天（E3.5）开始，由E7完成[10].
前庭装置的形成受多种因素的影响[11]–[15]例如，前庭结构的正常模式需要来自背侧后脑的Wnt信号[12]在内耳中，两个含有同源异形盒基因家族的成员，Dlx公司和嗯，也有牵连[13],[15]这些基因家族中一个或多个成员的缺失会导致管和嵴的形成缺失。值得注意的是Wnt（重量）,Dlx公司，或嗯基因功能都会导致早期紊乱或缺失英国标准普尔4推定嵴内的表达[12],[13],[15],[16].
的表达式英国标准普尔4在推测中，脊在包括斑马鱼、青蛙、鸡和小鼠在内的几种脊椎动物物种中是保守的(;[9],[17]–[19]). 对鸡的研究表明，半规管和嵴的形成被外源性Bmp拮抗剂Noggin阻断[20],[21]。但是英国标准普尔4内耳发育不能从这些结果中明确推断出来，因为Bmp公司基因也在发育中的内耳中表达，包括Bmp2型和Bmp7型
[22]。在鼠标中Bmp4型内耳发育也不能直接证明，因为英国标准普尔4无突变胚胎在前庭发育前死亡[23]最近在鸡胚中进行的关于Bmp4在毛细胞形成中的作用的体外实验也得出了相互矛盾的结果[24],[25]为了克服这些问题，我们利用cre/lox方法产生了内耳特异性缺失的小鼠英国标准普尔4此外，我们探讨了Bmp4通过过度表达介导其对嵴形成的影响的分子机制Smad6型或诺金在发育中的前嵴中破坏Bmp功能。这两个物种的综合结果表明英国标准普尔4在假定的嵴中，三嵴及其半规管的形成需要嵴。
材料和方法
小鼠应变
这个英国标准普尔4loxP等位基因是通过首先构建靶向载体产生的，其中loxP将位点插入英国标准普尔4基因座，所以cre重组会切除整个英国标准普尔4编码序列(图S1).英国标准普尔4时间m1/+和英国标准普尔4液氧磷/液氧磷小鼠被饲养在黑瑞士背景下福克斯1cre公司/+这些老鼠是以瑞士韦伯斯特为背景饲养的。福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1胚胎是通过雄性杂交产生的福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4时间m1/+雌性小鼠英国标准普尔4液氧磷/液氧磷老鼠。由于未知的原因，很少福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1老鼠出生时就恢复了健康(表S1). 因此，本研究中的所有分析都是在13.5 dpc之前进行的，这个年龄段的椎管和壶腹的大体模式是完整的。TgPax2cre公司;英国标准普尔4液氧P/温度1胚胎是通过繁殖产生的TgPax2cre公司;英国标准普尔4时间m1/+具有英国标准普尔4液氧磷/液氧磷老鼠。一代TgPax2cre公司，表达cre公司内耳专用增强器帕克斯2将在别处介绍（美国宾夕法尼亚州道格拉斯·爱泼斯坦）。所有动物程序均按照NIH动物使用和护理委员会的指导方针批准和执行。
鸡胚和程序
根据汉堡包和汉密尔顿的说法，鸡胚是分阶段的[26].鸡肉诺金cDNA[27]亚克隆到pIRES2-EGFP表达载体中，其中诺金由立即早期巨细胞病毒启动子（Clontech）驱动。鸡肉Smad6型pCab-IRES-GFP载体中的cDNA[28]亚克隆到pMES-IRES-GFP表达载体中，其中Smad6型在鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒即时早期增强子的驱动下[29].pSmad6型,p诺金将其各自的对照载体以4-6mg/ml的浓度注射到E3.5鸡耳囊腔中。分别使用位于耳囊前后极两侧的正极和负极电极将质粒电穿孔至耳囊前部。使用CUY21电穿孔器施加两个10伏的50毫秒脉冲。
原位杂交和免疫染色
按照描述进行涂料填充分析和原位杂交[9]鸡和小鼠RNA探针的制备如前所述[9],[19],[30]–[32].
以1:5000的稀释度使用抗手细胞特异性抗原（HCA）抗体（Guy Richardson的礼物），并按照前面所述进行染色[33]抗体染色标本在4°C下用4%多聚甲醛固定过夜，Msx1/2和Gata3染色标本在室温下固定30分钟。采用以下抗体稀释液：小鼠抗神经丝蛋白（DSHB，3A2）1∶2000；小鼠抗Msx1/2（DSHB，4G1），1∶50；兔抗磷Smad1（彼得·丹·迪克的礼物），1∶2000；小鼠抗Sox2（Chemicon，AB5603），1∶2000；小鼠抗Gata3（Santa Cruz，HG3-31），1∶50；山羊抗GFP抗体（GeneTexa，GTX26662），1∶200。对于二级抗体标记，使用与Alexa Fluor 488、564或633偶联的种特异性抗体，稀释度为1∶500。一级和二级抗体的培养分别在4°C下过夜和在室温下培养1小时。使用共焦显微镜对每个样本的双标记细胞总数进行评分。由于每个样本计数的细胞总数不同，因此计算每个处理的加权平均百分比（wap），以调整样本之间采样大小的变化(http://mathforum.org/library/drmath/view/57605.html). 每次处理总共计数70至190个细胞。
结果
内耳表型英国标准普尔4条件敲除胚胎
生成条件英国标准普尔4无胚胎，我们使用了三种不同的小鼠系。第一，福克斯1cre公司/+，是通过插入cre公司进入内源性福克斯1在胚胎耳囊、眼睛和前肠等组织中表达的基因[34].该蛋白的组织特异性重组活性cre公司通过杂交证明了等位基因福克斯1cre公司/+带有罗莎26R记者行[34].英国标准普尔4时间m1是的空等位基因英国标准普尔4
[23]，而Bmp4型loxP条件等位基因的产生如下所述(图S1).福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1胚胎是以预期的频率从杂交中获得的福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4时间m1/+带有英国标准普尔4液氧磷/液氧磷老鼠。根据形态，它们可以分为三类：（1）发育严重延迟的胚胎，（2）眼睛畸形的胚胎，其体型正常或稍小，以及（3）形态上无法与之区分的胚胎英国标准普尔4loxP/+室友(表S1). 只有后两个类别被纳入后续研究。
我们评估了英国标准普尔4删除福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1使用RNA探针培育9.5至10.5 dpc（n=21）的胚胎(B4-德尔)针对第3和第4外显子生成英国标准普尔4在9.5 dpc下分析的一半胚胎显示异常英国标准普尔4表达模式（n=4/8）。增加10.5 dpc福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1胚胎显示无或减少英国标准普尔4在眼部和耳囊等组织中的表达福克斯1通常是转录的(，箭头；n=11/13）。值得注意的是，组织中的表达模式正常福克斯1不表达后脑顶、体节和肢芽(，箭头）。11个胚胎中的一些在英国标准普尔4表达和眼部畸形在体型上也稍小（n=3）。
正常的耳囊，英国标准普尔4在组织的前部条纹和后部病灶中转录(;[9]). 前条纹包括假定的前嵴和外侧嵴(，箭头），然后拆分为两个单独的实体[9]，而后焦点界定了后嵴的位置(，箭头）。受影响的11人中福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度110.5 dpc胚胎，英国标准普尔4耳囊肿后部无转录物，前部无转录物或转录物减少(，箭头）。从受影响的福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度111.5 dpc下的试样（见下文）。到了这个年龄，英国标准普尔4也表达于生长中的耳蜗导管的非感觉区[9]尽管cre报告小鼠的耳囊中似乎普遍存在cre活性[34],英国标准普尔4所有患者的耳蜗导管表达正常福克斯1cre公司/+;Bmp4型液氧P/温度1检查样本（数据未显示）。
涂料填充分析英国标准普尔4条件淘汰赛内耳
The gross anatomy of the福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1内耳在13.5dpc时用涂料填充膜迷路进行检查。与变量一致英国标准普尔4表情模式，绘画填充福克斯1cre公司/+;Bmp4型液氧P/温度1标本还显示了一系列内耳表型(). 在最严重的病例中，没有明显的壶腹或半规管，椭圆囊和球囊畸形。内耳背侧区域只有一个完整的内淋巴管(; n=8/14）。其余的标本要么无法与英国标准普尔4loxP/+（n=3/14）胚胎，或仅显示侧管截断(; n=3/14）。百分比英国标准普尔4液氧P/温度1侧管也有类似的缺陷（n=5/10）。因此，在福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1胚胎可能是由于英国标准普尔4由于两种Tm1和未重新组合的牙线英国标准普尔4而不是cre活性的不完全外显。耳蜗管福克斯1克/+;英国标准普尔4液氧P/温度1胚胎的长度有一些变化(). 我们将这种差异归因于耳朵的分期或整体生长缺陷的轻微差异。
内耳分析英国标准普尔4有条件的空胚。控件内部填充了油漆英国标准普尔4loxP/+（A，G），福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1（B–D，H）和TgPax2cre公司;英国标准普尔4液氧P/温度1（E，F）胚胎，11.5（G，H）和13.5 dpc（A-F）。（A）–（F）中的插入物是耳蜗导管的腹视图。最畸形的内耳福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1与对照组（A）相比，胚胎如（B）和（C）所示。在（D）中，除了外耳道截断外，内耳是正常的（箭头所示）。轻度（E）和更严重（F）影响了TgPax2cre公司;英国标准普尔4液氧P/温度1胚胎。内耳英国标准普尔4loxP/+（G） 和（H）福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4loxP/Tm111.5dpc的胚胎。箭头（H）指向中较小的管袋福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1胚胎。（G）中的方向适用于所有面板。（F）和（H）中的比例尺分别适用于（A–E）和（G）。
我们也有条件地删除了Bmp4型在内耳中使用转基因小鼠株，TgPax2cre公司.使用此方法获得的内耳表型cre公司应变也是可变的。十五分之十TgPax2cre公司;英国标准普尔4液氧P/温度1标本有内耳缺损。那些表型较轻的患者除了侧管截断外，还表现出三个壶腹和管的缺陷(; n=5）。更严重的表型包括椭圆囊和球囊畸形(; n=5）。类似于福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1内耳，耳蜗导管相对正常，与英国标准普尔4此区域中的表达式（未显示数据）。总之，内耳特异性缺失英国标准普尔4使用两个独立的cre公司行表示英国标准普尔4形成三个嵴和半规管，可能还有胞囊和球囊。
一些英国标准普尔4Tm1/氧磷繁殖产生的胚胎TgPax2cre公司;英国标准普尔4+/时间m1具有英国标准普尔4液氧磷/液氧磷小鼠也表现出侧管截断（n=4/7），这表明时间m1和loxP等位基因可以根据遗传背景产生亚型。值得注意的是，我们英国标准普尔4时间m1/+黑瑞士背景的老鼠不围着圈子转，但只有一小部分英国标准普尔4C57BL/6背景杂合小鼠do[35].
基因表达分析福克斯1cre公司/+; 英国标准普尔4液氧P/温度1胚胎
对年轻胚胎的彩绘填充耳朵的分析表明福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1在11.5 dpc时已经很明显了(). 为了更好地理解表型的潜在分子机制，我们首先研究了一些与预期嵴相关的基因的表达模式，例如Fgf10型,加塔3,Jag1型,四氧化二铝,Msx1型、和Sox2，在里面福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1胚胎。在11.5dpc时，这些基因的表达结构域通常与英国标准普尔4在假定的嵴中(; 数据未显示）。条件突变耳朵与英国标准普尔4loxP/+胚胎通常缺乏英国标准普尔4其他早期嵴相关标记的表达和伴随丢失(，n=28/42耳）。相反，在所有有残留的条件突变体中英国标准普尔4在前部表达（n=13/42），其他嵴标志物也存在。
基因表达分析福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4loxP/时间内耳11.5 dpc。（A–A'）英国标准普尔4loxP/+控件显示英国标准普尔4-外侧嵴区阳性（A，lc），对加塔3（A'）和Msx1型（A“）。（B，B'，B“）福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1(B4cko公司)胚胎缺乏嵴相关表达英国标准普尔4（B） ，加塔3（B’）和Msx1型（B“）。（C） 显示以下表达式域的示意图Bmp2型和英国标准普尔4在11.5 dpc的管袋中，以及每个面板的近似截面高度。（D–G）全量（D，E）和切片（F，G）原位杂交显示Bmp2型在管袋中的表达（在D、E中概述）福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4loxP/Tm1（E，G），与英国标准普尔4loxP/+（D，F）内耳。（F）Bmp2型表达与预期的后侧根管（vp和hp）有关英国标准普尔4loxP/+胚胎，但仅在管袋的前部福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1胚胎（G，箭头）英国标准普尔4表情有时会出现。（H–I’）深x 5（H，I）和嗯x3（H'，I'）表达域在英国标准普尔4loxP/+（H，H’）和福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1（I，I’）胚胎。内淋巴管（ed）是深x 5-正（H，I）和嗯x3-负（H'，I'）。运河袋福克斯1克/+;英国标准普尔4液氧P/温度1内耳是深x 5负（I）和嗯x3正（I'）。方位：A，前；五十、 横向。（I’）中的方向适用于除（D）和（E）外的所有面板。比例尺=100μm。（F）中的比例尺适用于（A–B）和（G）；（E）和（I）中的比例尺分别适用于（D）和（H–I'）。
缺乏英国标准普尔4内耳的表达也导致了半规管的形成。垂直管袋的总体尺寸通常小于正常尺寸，尤其是在后部(). 这一发现与以下观察结果一致：英国标准普尔4后嵴的表达最为稳定福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1耳朵。Bmp2型与鸡内耳的管形成有关[36]，其在小鼠管袋中的表达模式与鸡相似(). 11.5 dpc时，Bmp2型中的表达式福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1内耳经常缩小，有时在管袋中缺失(; 箭头，n=8；; n=4/6，缺失后部信号）。
其他基因，如深x 5,嗯x2、和嗯x3也与运河开发有关。深x 5和嗯在耳板中表达，随后在整个管袋中表达(;[37]–[40]). 在福克斯1cre公司/+;英国标准普尔4液氧P/温度1内耳受累的胚胎，深x 5在管袋中表达下调，但嗯x3未更改，至少11.5 dpc(; n=4）。相反，深x 5内淋巴管的表达正常(). 这些结果表明英国标准普尔4用于维护深x 5仅在管袋中表达，并且嗯x3管内袋独立于英国标准普尔4和深x 5.
鸡胸脯分化过程中的基因表达模式
我们的结果表明英国标准普尔4影响小鼠假定嵴中许多基因的表达模式。然而，尚不清楚这些变化是直接的还是间接的，因为条件突变体中感觉组织的丢失。为了解决这个问题，我们分析了下调Bmp信号对7个已知嵴相关基因的短期影响-Fgf10型,Gata3、Lmo4、Msx1、p75Ngfr、Ser1、和Sox2系统-在鸡的内耳里。首先，我们详细研究了正常嵴发育过程中这些基因的表达谱(). 在成熟的前嵴或后嵴中，感觉贴片呈鞍形，由感觉毛细胞和支持细胞组成。鞍中央有一个无感觉区，即交叉中隔(，原理图）。最初，所研究的七个基因中的每个基因的表达模式与英国标准普尔4在假定的前嵴或后嵴(;[30];[19]; 数据未显示）。E3.5后，这些基因的表达模式开始分离(). 在E5.5时，基因如英国标准普尔4,Sox2系统,序号1、和Fgf10型在与感觉斑相关的两个独立域中表达(，双箭头；数据未显示）。在两个感官补丁之间是第75页Ngfr-和加塔3-阳性区域最终发展为十字隔(，箭头）。相反，四氧化二铝在两种感官上都有表达(，pc中的双箭头）和非感应区域(，箭头），该表达模式维持在E10(). 通过E10，英国标准普尔4,Fgf10、Msx1、Sox2、和序号1与感觉区的支持细胞相关(). 这些基因的表达模式与Bdnf公司，与感觉毛细胞有关(，插入ii）。加塔3和第75页Ngfr表达结构域保留在固有感觉组织之外，位于隔中(，箭头；[32])以及在基督山以外的过渡地带(，箭头）。
嵴相关基因在分化过程中的表达模式。E3.5（A，B）、E5.5（C，D）和E10（E–G）处发育中的鸡冠切片。（A，A'）相邻切片显示Bmp4型（A） 带有加塔3（A'）和第75页Ngfr（B） 在E3.5的前嵴区。（C–C“）显示第75页Ngfr（C） 和加塔3（C'）基本上与两者不重叠英国标准普尔4-阳性区域（C“）。加塔3也表达于嵴周围的间充质区。（D）序号1发育中嵴的表达模式与英国标准普尔4（C“），在两个单独的域中（双箭头），而（D'）四氧化二铝表示为序号1-正区域（pc，双箭头）以及两者之间的区域序列1-正区域（箭头）。E10处发育嵴的（E–F）横截面和（G）矢状截面。（E“）英国标准普尔4，（F）Sox2系统，（F’）Fgf10型、和（G'）Msx1型在发育中嵴的感觉区表达，而（E）第75页Ngfr和（E'）加塔3表达于嵴中心的无感觉交叉区。（E”）中的插入物（i）和（ii）是（E”）中感觉区域的较高放大倍数，显示英国标准普尔4表达域跨越整个上皮细胞和Bdnf公司结构域分别位于感觉毛细胞的顶端。插入物（ii）中的虚线表示感觉上皮的基底。的表达式域第75页Ngfr似乎围绕着加塔3-交叉韧带的阳性区域（E，E'；G，G“）。此外，两者都是加塔3和第75页Ngfr在发育嵴的过渡区（G，G“箭头）。这个第75页Ngfr在E5.5，过渡区的表达已经很明显(，箭头）。（G“）四氧化二铝在发育嵴的感觉区（小箭头）和十字交叉区（箭头）均有表达。（C）中的方向适用于（A–D’）。（E–F’）和（G’–G”’）分别是E10处前嵴的横截面和矢状截面。比例尺=100μm。（D'）、（F'）和（G“'）中的比例尺分别适用于（A-D）、（E-F）和（G-G”）。
总之，我们的分析表明，虽然大多数嵴相关基因最初在假定的前嵴和后嵴中的表达域重叠，但随着发育的进行，它们的表达模式分离为嵴的感觉和/或非感觉区域。
Crista中Bmp信号转导下调影响的基因
接下来，我们研究了这些嵴相关基因的表达是否受到Bmp信号下调的影响。矢量(pSmad6型和p诺金)编码Smad6型或诺金翻译偶联到GFP的基因在E3.5电穿孔到卵丘发育中的前嵴区域，此时这些嵴相关基因在推测的嵴中共同表达。Smad6是一种细胞内抑制剂，与Smad4竞争，以结合磷酸化的Smad1/Smad5/Smad8蛋白，从而阻止其随后转移到细胞核并激活Bmp靶基因[41].异位Smad6型表达已成功地用于解决Bmps在神经诱导和质粒形成中的作用[28],[42].示出了英国标准普尔4-前嵴阳性区()电穿孔后14小时内pSmad6型和pGfp（磅/平方英尺）分别是。
异位扩张Smad6型下调鸡内耳crista相关基因。（A–C）在电穿孔14小时后，E4处的全胚胎显示GFP在靶前嵴区域表达pSmad6型（A） 或pGfp（磅/平方英尺）（B） 质粒。（C）英国标准普尔4嵴中的表达。（D–G“）内耳切片pSmad6型（D，F）或pGfp（磅/平方英尺）（E，G）质粒在E3.5，电穿孔14小时后收获。（D–D“）探测相邻截面Gfp公司（D） ，加塔3（D’）和Sox2系统（D）成绩单。在电穿孔的前嵴区域（D）内，加塔3表达下调（D'，箭头），而Sox2系统表达式不受影响（D“）。（F–F“）下调第75页Ngfr（F’）在电穿孔区域（F），但表达Fgf10型不受影响（F“，箭头）。在电穿孔对照中，这些基因表达模式均不受影响pGfp公司（E、G）。（F’）和（G’）中的插入物是前嵴的较高放大倍数。（B）和（C）中的比例尺等于1 mm，（B）中的标尺适用于（A）。（G“）中的比例尺等于100μm，适用于（D–G’）。
电穿孔pSmad6型导致最终与无感觉隔交叉相关的基因下调，如加塔3(; n=10/10）和第75页Ngfr(; n=10/13），而与感觉区域相关的基因表达水平，如Sox2系统（n=0/6），Fgf10型（n=0/6），四氧化二铝（n=0/9）和序号1（n=0/5）不受影响(和数据未显示）。电穿孔控制载体表达Gfp公司在大多数情况下，单独使用不会导致基因表达改变(; n=42/44）。下调Msx1公司作为对…的回应pSmad6型是可变的（n=7/14；数据未显示），但在响应p诺金(; n=6/6）。的表达式Lmo4，它与感觉和非感觉区域都相关，通过p诺金(; n=11/11），但未观察到pSmad6型（n=9；数据未显示）。由于诺金是一种分泌分子加塔3和Msx1型在电穿孔部位附近的间质中也观察到(，双箭头；n=6/6）。未被下调的基因pSmad6，例如Bmp4，Fgf10,序号1和Sox2，不受影响p诺金处理(; 数据未显示）。控制向量电穿孔，pIRES Gfp公司，通常不会改变这些基因表达模式(; n=26/28）。
的异位表达诺金下调鸡内耳crista相关基因。内耳电穿孔p诺金（A、C、E）和pIRES公司-全球粮食计划署（B、D、F），14小时后收获。（A–A“）探测相邻部分全球粮食计划署（A） ，Msx1公司（A'），和英国标准普尔4（A）成绩单。Msx1型（A'）表达在选民中被废除（A），英国标准普尔4-前嵴区阳性（A“，ac），而英国标准普尔4表达式不受影响（A“）。Msx1型间叶区域（A'，箭头）的表达减少。（C–C“）显示无四氧化二铝电穿孔（C）中的（C'），Sox2系统-前嵴阳性区（C“，箭头）。（E–E“）探测相邻截面全球粮食计划署（E） ，加塔3（E’），和序号1（E）成绩单。（E’）加塔3前嵴（箭头）和周围间质（箭头）的表达下调，但序号1表达式未更改（E“）。（B，D，F）在用位置-Gfp缩写：cvg，耳蜗前庭神经节。刻度条in（F“）等于100μm，适用于所有面板。
阻断Bmp信号下调调节Crista中Msx和Gata3免疫反应
通过对电穿孔细胞进行GFP和翻译基因产物的双重染色，在蛋白质水平上验证了基因表达的变化。使用磷酸化Smad1的水平来评估Smad6抑制对Bmp信号转导的影响。细胞电穿孔pSmad6型显示phosphosmad1染色下调(; wap=98%，n=7；看见材料和方法)而细胞通过电穿孔pGfp（磅/平方英尺）不要(; wap=23%，n=7）。此外，pSmad6型-电穿孔细胞也显示Msx的下调(; wap=94%，n=4）和Gata3免疫反应(; wap=87%，n=8），而Sox2水平几乎不受影响(; wap=2.2%，n=8）。下调Msx(; wap=8.6%，n=5），Gata3(; wap=0%，n=5）和Sox2（数据未显示，wap=11%，n=4）免疫反应在电穿孔细胞中最小pGfp（磅/平方英尺）。观察到类似的结果p诺金，除了Gata3染色下调外，在间质中也观察到(; n=6），而Gata3在用对照质粒电穿孔的标本中表达正常，位置-Gfp(; n=6）。综上所述，我们的结果表明，Bmp信号转导的下调似乎优先影响与嵴的非感觉区相关的基因，而非感觉区。
磷酸腺苷1、Msx1和Gata3免疫反应下调pSmad6型和pNoggin蛋白电穿孔。内耳电穿孔切片pSmad6型（A、C、E、G），pGfp（磅/平方英尺）（B、D、F），pNoggin蛋白（H） 、和位置-Gfp（一） E3.5，14小时后收获。（A，A'）用抗磷蛋白1（PS1，红色）、抗GFP（绿色）和抗神经丝（蓝色）抗体染色的切片。细胞电穿孔pSmad6型（概述）为GFP-阳性（A）和PS1-阴性（A'）。神经丝染色确定假定的嵴区。（B，B’）内耳切片pGfp（磅/平方英尺）显示GFP阳性细胞（B）PS1染色（B’）也阳性。（C-D）pSmad6型-阳性细胞（C，箭头）的抗Msx染色为阴性，而GFP对照细胞（D，箭头）为Msx免疫反应阳性（D’）。（E–F’）pSmad6型-Gata3（E'）阳性细胞（E）为阴性，而GFP-对照细胞（F）为Gata3阳性细胞（F'）。（F）中的箭头指向嵴区外的GFP阳性细胞。（G）pSmad6型-阳性细胞为Sox2染色阳性（箭头）。（H，I）Ap诺金-经处理的切片（H）显示上皮（e）和间充质（m）均无Gata3染色，而在位置-Gfp处理过的试样（I）。蓝色箭头指向GFP阳性的单元格（未显示数据）。
Bmp信号转导下调后的内耳表型
为了研究Bmp信号转导的敲除是否对嵴或管的形成有长期影响，我们在E7处收获了一些电穿孔胚胎，并将其处理用于油漆填充分析，或在E8.5处使用抗HCA抗体进行感觉毛细胞染色。一半以上的内耳电穿孔pGfp（磅/平方英尺）有正常的运河(; n=12/21），其余显示前根管无吸收(，箭头；n=9/21）。然而，在管袋不能再吸收的标本中，前嵴通常是正常的，显示出鞍状的模式，抗-HCA染色(; n=4/5），与对照组相似(). 大多数pSmad6型电穿孔标本要么缺少前根管，要么显示出未被吸收的管袋(; n=15/19），前壶腹畸形(，小箭头；n=15/19）。壶腹内的嵴通常较小，没有十字韧带，因此没有鞍状或W形染色模式(; n=10/12）。然而，根据抗-HCA抗体点状染色模式，一些感觉毛细胞仍留在畸形嵴内(). 这些结果表明，在假定的前嵴细胞中下调Bmp信号转导会自动导致嵴的图案缺陷。内耳电穿孔p诺金而不是pSmad6型表现出更严重的表型，涉及所有三个管和壶腹(; n=7/8）。
pSmad6型和p诺金-诱导内耳表型。电穿孔后E7处的漆填充内耳pGfp公司（A、B）、，pSmad6型（C） ，或p诺金（D） 在E3.5处。内耳电穿孔pGfp（磅/平方英尺）要么正常（A），要么显示前管无吸收（B，箭头所示），且无明显的前壶腹（B，小箭头所指）。（C） A类pSmad6型-经治疗的内耳显示前壶腹畸形（小箭头）和前管缺失。普通小腿比正常小腿宽（箭头所示）。（D） A类p诺金-治疗后的内耳显示三个壶腹、前管和侧管缺失。后路融合板没有吸收（箭头所示）。（E–G）对照组（E）部分切除内耳或电穿孔内耳的抗-HCA染色pGfp（磅/平方英尺）（F） 或pSmad6型（G） 在E3.5和E8.5收获。（E） 前嵴呈典型的马鞍状或W形，抗-HCA染色。（F）pGfp（磅/平方英尺）-用一个没有吸收的管袋治疗内耳（箭头所示），但前嵴看起来正常。（G）pSmad6型-经治疗的内耳显示前嵴畸形和缩小，无前管。箭头指向壶腹的轮廓。（H，I，J）分别从（E，F，G）扁平前嵴。（H）和（I）中的箭头指向交叉中隔的位置，点状染色表示感觉毛细胞顶部的静纤毛束。方位：M，内侧。（C）、（E）和（H）中的比例尺分别适用于（A–D）、（F–G）和（I–J）。
在pGfp（磅/平方英尺）标本表明，管的形成对电穿孔特别敏感。此外，由于电穿孔区域通常包括一些管袋上皮，因此在pSmad6型和p诺金标本可能是由于起源于管上皮的Bmp2信号传导的直接下调[36]而不是下调嵴产生的Bmp4信号。
讨论
Crista中的细胞命运规范
脊椎动物内耳内产生感觉斑的发育程序被认为与果蝇属其中Notch信号产生细胞类型多样性[43]–[45]普遍的概念是，神经命运是通过德尔塔-缺口信号在发育中的内耳的前感觉上皮中指定的，而感觉命运是通过Ser1-Notch信号的正反馈维持在前感觉结构域内[46],[47]最终，由Notch信号介导的侧向抑制指示感觉斑内的细胞分化为毛细胞或支持细胞。没有直接证据表明神经嵴感觉区的神经命运规范(). 然而，根据我们的基因表达数据，我们认为至少在前嵴和后嵴的前感觉域内，还有一个额外的步骤，即承诺进入无感觉命运。这发生在毛细胞和支持细胞命运被指定之前或大约同时。更重要的是，我们建议通过调节Msx1和Lmo4活性来调节感官命运，而Gata3、p75Ngfr和Lmo4来调节非感官命运，Bmp4在这两个规范步骤中都是必需的().
嵴形成和Bmp4的潜在作用概述。（A） 从发育前期到成熟期嵴形成的示意图总结，包括感觉毛细胞和支持细胞。嵴外的蓝色和黄色代表间叶Msx1公司-和加塔3-阳性细胞。最初，许多基因在前感觉区（B）中共同表达，但这些基因随着感觉（蓝色）和非感觉（黄色）命运的指定而分离成不同的域。到目前为止，没有实验证据表明嵴前感觉区像黄斑前感觉区那样产生神经元[48]（C）在嵴上皮（box）内，Bmp4的表达受Notch信号调节，可能由Ser1介导。Sox2和Fgf10是否调节Bmp4表达尚不清楚。然而，Bmp4通过调节感觉区的Msx1和Lmo4以及非感觉区的Gata3、Lmo4和p75Ngfr来调节嵴的形成。此外，基因缺失，如Dlx公司(深x 5和深x 6）,埃亚1,Hmx（Hmx2和嗯x3）,Tbx公司、和Six1型影响英国标准普尔4表达和嵴形成。在这些基因中，Tbx1型而且可能Dlx公司与共同表达英国标准普尔4在嵴中。
与嵴相似，但与感觉黄斑相反，尚不清楚Corti器官前感觉区是否存在特定的神经命运[48]值得注意的是，在Corti器官中，有两排p75Ngfr阳性柱状细胞，它们是位于一排内毛细胞和第一排外毛细胞之间的特殊非感觉细胞[49]有趣的是，p75Ngfr最初也在Corti的预期器官中广泛表达，其表达在后期仅限于支柱细胞[50]因此，此处提出的嵴的类似细胞命运决定可能也适用于Corti器官。
Bmp4型Crista组
要求英国标准普尔4从英国标准普尔4条件null突变体。我们下调了鸡胚嵴中Bmp信号的表达，揭示了一些关于Bmp4在嵴形成中可能作用的有趣见解。首先，已知内耳前庭形成所需的基因，如Sox2系统,Jag1型、和Fgf10型不受任何影响pSmad6型（细胞自主）或p诺金（非细胞自主）治疗[51]–[55].确定这些前体基因是平行还是直接在英国标准普尔4需要进一步调查(). 其次，感觉和非感觉通路中的基因都受到下调Bmp4信号的影响。与基因表达变化一致，长期影响是嵴结构的破坏以及感觉毛细胞的丢失。综上所述，我们的结果表明，Bmp4在将嵴结构组织成感觉和非感觉域方面发挥着全局作用，而不仅仅是促进或抑制毛细胞命运[24],[25]这种组织作用可能涉及在细胞类型规范中与Notch信号通路的相互作用。
在感觉通路中Msx1型和四氧化二铝受Bmp信号减少的影响。Msx1型已证明在其他几种组织中位于Bmp4的下游[56],[57]内耳也有类似的关系[21],[25].无嵴表型Msx1型到目前为止，已经报道了无效突变体，但两者之间可能存在功能冗余Msx1型和Msx2
[58].四氧化二铝是一种仅在内耳中表达的Lim域基因[59]并且被认为是小鼠的嵴和管形成所必需的（Lin Gan，未发表的结果）。因此，两者都是Msx1型和四氧化二铝可能是Bmp4信号传导的重要介质。尤其是，p诺金治疗似乎比治疗更有效地下调这些基因pSmad6型可能是由于诺金的更广泛和/或非细胞自主效应。
除了调节Msx1型和四氧化二铝在感觉区，Bmp4还可以通过调节调节调节非感觉十字韧带的形成p75Ngfr，加塔3、和四氧化二铝活动。的表达式第75页Ngfr在发育中的嵴已经有一段时间了[19]但尚不清楚第75页Ngfr空突变体[60].
加塔3是内耳发育中的一个重要基因加塔3-/-小鼠胚胎[31],[61]在人类中GATA3协议与HDR（甲状旁腺功能减退、感音神经性耳聋和肾异常）综合征相关[62]鉴于GATA因子（pannier）在激活achaete-scute神经前复合体中的重要性果蝇属
[63],[64],加塔3可能会对脊椎动物嵴中的细胞命运规范产生更全面的影响，而不仅仅是十字韧带的形成（见下文）。此外，保守的加塔3鸡和小鼠假定嵴周围间充质的表达[65]也可能有助于嵴的正确形成。我们推测，观察到的加塔3间质中的表达pNoggin，但不是通过pSmad6，可能导致由p诺金.
在其他系统中，Bmp和Gata途径被认为是相互作用的。例如，在果蝇属胚胎发生，游艇（同系物盖特1)是由dpp（数据处理程序）（十足瘫痪，同系物英国标准普尔4)在背侧胚胎中[63].在开发后期dpp（数据处理程序）变得依赖于游艇
[66].在内耳内，加塔3表达式似乎开始于英国标准普尔4然而，相对正常英国标准普尔4中的表达式加塔3空内耳不支持加塔3上游功能英国标准普尔4
[31]然而，我们的结果表明Gata3型在嵴中依赖于英国标准普尔4.
此外，虽然我们在上述讨论中根据成熟嵴中的表达域将基因分为感觉基因和非感觉基因，但它们早期的发育功能可能并不局限于成熟时表达的细胞类型。这个概念是基于这些基因在假定的前嵴和后嵴中的普遍表达。鸡或小鼠的侧嵴不含鲫鱼[4]然而，加塔3被认为是一个无感觉基因，在小鼠的预期外嵴中表达(). 不知道是否加塔3在鸡的预期侧嵴中也表达。然而，基于此处分析的有限数量的嵴相关基因，当Bmp信号转导下调时，经典的非感觉基因似乎比所谓的感觉基因更容易受到影响。因此，一个有待检验的有吸引力的假设是，如加塔3和第75页Ngfr是调节Bmp4早期组织作用的关键因素。
此外，根据内耳表型英国标准普尔4条件敲除胚胎，英国标准普尔4也是形成胞果和球囊所必需的。因为很少表达英国标准普尔4使用原位杂交在其假定组织中检测到[9]需要进一步研究以确定嵴是否是发育所需的Bmp4的来源。
渠道形成中的Bmp4
我们认为感觉嵴可能诱导其相关半规管的形成[1].英国标准普尔4在假定的嵴中强烈表达，但在管袋中不表达[9]因此英国标准普尔4条件空突变体也支持crista调节管形成的假设。最近鸡的命运定位数据表明，在每个嵴附近都有一个通道发生区，该区域产生通道中的大多数细胞[36]。的表达式域Bmp2型在管袋中对应于该管发生区，实验证据表明，推测嵴分泌的Fgfs通过调节Bmp2型
[36]三条运河都不存在Fgf10型无效小鼠与这个假设一致[54]然而，尚不清楚Bmp4对椎管形成的影响是直接的，还是通过嵴中的Fgfs间接介导的。使用SU5402（Fgf受体抑制剂）阻断鸡胚管形成也会影响英国标准普尔4在嵴中表达（Chang和Wu，未发表结果）。因此，Fgfs和Bmp4都可能参与调节管形成。
除了假定的作用Bmp2型在渠道形成中，深x 5也是运河形成的关键因素，其活动也由Bmp4直接或间接调节。即使运河表型深x 5-/-突变体比英国标准普尔4条件突变体Dlx5-/-；深x 6-/-双突变体似乎更严重[16]在导管形成中，可能在Dlx和Bmp4之间存在正反馈环，因此Dlx蛋白诱导英国标准普尔4反过来，他们的活动由Bmp4维护。有趣的是深x 5在管袋中比嗯x3缺乏英国标准普尔4。即使两者都是Dlx公司和嗯通道是形成运河所必需的，这两条通道的调节似乎是不同的。这一概念也得到了以下研究的支持Gbx2-/-和重量1-/-；Wnt3a型-/-突变胚胎，其中深x 5表达下调，但嗯x3表情相对正常[12],[67].
监管机构英国标准普尔4表达式
考虑到Bmp4在形成前庭器中的重要性，许多基因如Dlx公司,嗯,Tbx1型,埃亚1和Six1型直接或间接地监管其活动(). 在假定的基督里，英国标准普尔4表达似乎并不依赖于Bmp信号(和). 相反，英国标准普尔4这种表达被认为是由Notch信号维持的[68]当Notch信号被γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断时，英国标准普尔4嵴中的表达显著减少[68]，而激活的Notch的异位表达会导致异位感觉斑，其中一些是英国标准普尔4积极的[46]这种Notch信号被认为是由Ser1介导的。一直以来，条件敲除小鼠Jag1型未能形成嵴[51],[52].
综上所述，我们的结果明确证明了Bmp4在嵴和管的模式和细胞命运规范中的重要性。根据遗传背景英国标准普尔4+/−小鼠也表现出轻微的前庭和听觉缺陷[35]考虑到Bmp4在内耳中的多重作用，从各种体外实验条件中获得的反常结果并不奇怪[24],[25]阻断鸡假定嵴中的Bmp信号转导揭示了Bmp4可能通过几个潜在途径调节其功能。Bmps调节的蛋白质之间的关系，包括Gata3、Lmo4、Msx1和p75Ngfr，需要进一步研究。在红系细胞中，已知Gata1和Lmo2与其他转录因子直接相互作用并形成复合物[69]因此，可以想象，嵴中Bmp下游基因的激活也需要Gata3和Lmo4形成转录复合物。未来的研究将集中于破译这些蛋白质在重要感觉器官嵴形成过程中的关系。
