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神经精神药理学。作者手稿；PMC 2008年4月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
神经精神药理学。2008年4月；33(5): 1038–1048.
2007年6月27日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.npp.1301488
预防性维修识别码：PMC2268621型
美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院27664
PMID：17593929

鼻内免疫激发诱导性依赖性抑郁样行为及脑内细胞因子表达

莱昂纳多·托内利,*,1 安德鲁·霍姆斯,2和Teodor T Postolache公司三
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关联数据

补充资料

摘要

多项研究报告了免疫系统激活与情绪障碍之间的关系。然而，免疫系统影响情绪的机制还只是部分了解。在本研究中，我们在大鼠动物模型中检测到类似抑郁的行为，该模型涉及通过鼻腔（i.n.）滴注细菌脂多糖（LPS）诱导鼻腔炎症。反复腹腔注射脂多糖后的强迫游泳试验证明，雌性大鼠表现出抑郁样行为。这些反应与旷场测试测量的运动活动变化不平行。在相同的动物中，游泳后皮质酮反应是所有评估组中最高的。使用实时RT-PCR分析细胞因子白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6在几个脑区的转录调控。腹腔注射LPS的雌性大鼠海马和脑干中检测到肿瘤坏死因子-α增加。这些结果表明，上呼吸道的外周炎症是一种免疫挑战，能够诱发抑郁样行为，促进糖皮质激素对压力的过度反应，并增加大脑中细胞因子的转录。这些结果进一步加深了我们对免疫系统在抑郁症病理生理学中所起作用的理解。

关键词：强迫游泳测试、实时RT-PCR、海马、脑干、皮质酮、细胞因子、抑郁

简介

从临床人类研究中获得的证据表明，免疫系统和细胞因子网络的激活可能至少与抑郁症复杂病因的某些方面有关(动画师等, 2005;卡普隆等, 2001;卡普隆和丹泽，2003年;Dantzer和Kelley，2007年;丹泽尔等, 2002;Prolo和Licinio，1999年;Raison公司等, 2006;Schiepers公司等, 2005). 众所周知，用细胞因子干扰素-α治疗丙型肝炎可降低病毒滴度(小林寺等, 2006)导致大量患者抑郁(克罗内等, 2004;迪佩里克等, 2000;詹森等, 1994;Raison公司等, 2005;谢弗等, 2002). 细胞因子白细胞介素-2（IL-2）治疗黑色素瘤患者产生类似的精神副作用(卡普隆等, 2000;德尼科夫等, 1987). 此外，一些研究报告抑郁症患者体内存在升高的促炎细胞因子(弗龙贝格尔等, 1997;莱文等, 1999)抗抑郁药物治疗后炎症介质的减少(伊尔米亚等, 1999). 了解免疫系统和情绪障碍之间相互作用的关系和机制基础，可以为抑郁症的病因和治疗提供新的见解。

研究免疫系统激活下的行为和生理反应的一个成熟模型是给予细菌脂多糖（LPS）。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的组成部分，可产生剂量依赖性的先天免疫反应激活和促炎细胞因子分泌(米勒等, 2005). 静脉注射或腹腔注射脂多糖（LPS）已被证明能诱导人类受试者出现抑郁症状，并影响啮齿类动物模型中与情绪相关的行为(De La Garza，2005年;恩格兰等, 2003;赖森伯格等, 2001). 尽管疾病而非抑郁症在多大程度上参与了这些行为改变尚在争论之中，但研究表明，健康个体接受低剂量静脉注射LPS后焦虑和抑郁得分升高(莱森伯格等, 2001). 这些影响并没有伴随着明显的系统性疾病症状，如心率变化，而是伴随着循环细胞因子的增加。此外，在啮齿类动物中，i.p.LPS被发现会引发与焦虑和抑郁相关的行为，包括探索行为减少(恩格兰等, 2003)社交互动减少，快感增加(De La Garza，2005年). 然而，在大鼠强迫游泳试验（FST）中，腹腔注射LPS未能增加静止时间(迪克等, 2005)或者只有当剂量高到足以影响运动活性时，它才会在小鼠身上出现(Dunn和Swiergiel，2005年). 在啮齿类动物中，在FST中增加静止时间而不改变运动活动通常被解释为一种抑郁行为的测量(Cryan and Holmes，2005年;Cryan公司等, 2005;Porsolt，1979年). 由于FST对临床有效抗抑郁药物的敏感性已得到验证，这些发现可能会限制对免疫系统激活与情绪障碍相关机制的进一步研究，以及对与此现象相关的新抗抑郁干预措施的评估。

在本研究中，我们试图通过大鼠LPS模型和FST进一步加深对免疫功能与抑郁之间关系的理解。第一个目的是检查LPS给药途径的效果。虽然腹腔注射LPS是脓毒症和全身炎症反应的良好模型，但有证据表明，其他类型的炎症过程，如上呼吸道疾病，也会导致负面情绪、警觉性降低和精神运动功能受损(卡普隆等, 1999;霍尔和史密斯，1996年;史密斯等, 1998). 由于暴露于环境中的鼻神经上皮细胞的独特特性，以及已知的大分子和病原体通过鼻内（i.n.）进入大脑的转移，上呼吸道的炎症（如由空气传播的病原体引发的炎症）可能是对脑功能的重要免疫挑战通路(Illum，2004年;金等, 2001;洛夫特斯等, 2006;莫里等, 2005;索恩等, 2004). 这增加了通过i.n.途径将LPS或细胞因子转移到大脑中的可能性，可能会对大脑功能和行为产生不同于腹腔注射LPS引起的炎症的影响。为了测试，我们研究了静脉注射和静脉注射LPS对FST中抑郁相关行为的影响以及对强迫游泳应激的神经内分泌反应。此外，由于LPS的外周给药已被证明可诱导大脑中细胞因子的表达(布蒂尼等, 1996;权等, 1999;托内利等, 2003;Tonelli和Postolache，2005年)我们研究了静脉注射LPS对嗅球、前额叶皮层、海马和脑干细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6（IL-6）基因表达的影响。这些区域是根据他们与抑郁症的关系来选择的(阿兰戈等, 2002;Drevets，2000年;Song和Leonard，2005年)作为分子的i.n.转移的目标(弗利德纳等, 2006;索恩等, 2004).

与男性相比，女性抑郁症发病率增加(诺贝尔奖，2005年)在大鼠抑郁相关行为中也有类似的性别相关差异(达拉等, 2005). 此外，雌性大鼠在运动活动、蔗糖摄入和交配行为等行为中对脂多糖和/或细胞因子的敏感性高于雄性大鼠(Avitsur和Yirmiya，1999年a,b条;恩格兰等, 2003;Merali公司等, 2003). 因此，本研究的第二个目的是验证女性对静脉注射和/或静脉注射LPS的降压作用更敏感的假设。

材料和方法

动物

在这些研究中，共使用192只近交系Fischer F344（F344/NHsd）大鼠，这些大鼠分为等量的雄性和雌性。该菌株是根据先前的研究结果选择的，研究表明，注射LPS后，大脑皮层区域细胞因子表达强烈，并伴有高应激系统反应性(托内利等, 2001,2003).

这些动物是从印第安纳波利斯州的哈兰-布拉格-道利（Harlan-Sbrague Dawley）获得的，并在2个月大时运送到我们的动物设施。动物被分成三组，分别关在有机玻璃笼子里，并配有标准的食物丸和水随意在23°C恒定温度下的房间内。所有动物均保持12:12的亮暗周期（0700时灯亮）。在开始实验程序之前，让动物保持一周不受干扰，然后每天再处理一周。从处理开始，每天监测体重，直到实验结束。如前所述，进行阴道涂片检查以确定卵巢发情周期的阶段(贝克尔等, 2005). 所有动物程序均由巴尔的摩马里兰大学动物护理和使用委员会批准。

腹膜内脂多糖研究

在1900至2000小时或0900至1000小时之间给大鼠注射1或2 mg/kg LPS（西格玛，圣路易斯，密苏里州，血清型055:B5）或0.9%生理盐水，并分别在给药后12和24小时在野外和FST中进行评估。这些剂量和时间点是根据我们之前的研究选择的，这些研究显示，在给予LPS 12小时后，脑实质中IL-1βmRNA的表达达到峰值(托内利等, 2003)以及显示24小时脑实质中这种细胞因子可测量水平的研究(Buttini和Boddeke，1995年)与此时点最大小胶质细胞激活相关(布蒂尼等, 1996).

鼻内脂多糖研究

在诱导室中用异氟醚对大鼠进行轻度麻醉，并在鼻腔中给予单剂量LPS（100μg/只，置于100μl生理盐水中），24小时后进行评估，或给予两剂量LPS连续2天，在最后一次给药后24小时（首次给药后48小时）进行评估。对照动物接受相同的方案，但给药100μl生理盐水。所有的静脉滴注都是在0800到1000小时之间进行的。这些剂量和给药时间表是基于之前对小鼠的研究(延迟-正交等2005年a,b条;Tesfaigzi公司等, 2001)并为大鼠调整了体积，以避免触及肺部(克莱恩扬等, 2006). 各组动物用于行为测试，或用于大脑细胞因子测定，而不进行行为测试。所有动物组均用于皮质酮测定。所有动物在没有麻醉的情况下被快速斩首杀死。在含有EDTA的试管中收集干血，并立即冷冻血浆，直到皮质酮测定。为了进行细胞因子测定，立即将大脑取出，浸泡在异戊烷中冷冻，并保存在-80°C下。

野外测试

在两个方形有机玻璃外壳（40.1×40.1cm）中，通过四个头顶34W荧光灯保持恒定照明，监测运动活动。地板被分成16个相等的正方形，上面放置了一台数码摄像机，并记录了整个过程。将动物放在围栏的一个角落里，通过盲人评分器测量动物进入正方形的次数，确定5分钟内水平运动活动的测量值。还测量了中心场（穿过四个中心广场中的任何一个）的交叉次数和饲养次数。训练结束后，将动物放回笼子，保持15分钟不受干扰，然后在FST中进行测试。

强迫游泳测试

第1天，将大鼠置于一个垂直的玻璃圆柱体（直径22.5厘米，高度60厘米）中，其中装有35厘米的水，保持25°C 10分钟。24小时后，动物被迫游泳5分钟（第2天）。Forced SwimScan系统（Cleversys Inc.，Reston，VA）将整个10分钟（第1天）和5分钟（第2天）期间的行为记录为数字视频。系统自动分析静止、游泳和逃生行为，如下所述德克等(1995)、和Detke和Lucki（1996）.该系统已在小鼠中验证(海因斯等, 2006)并在我们的实验室中由盲人评分员进行了验证（补充图S1）。

皮质酮测定

在静脉注射组动物中进行测定。在1200到1300小时之间杀死所有组的动物。对于那些接受行为测试的大鼠，在FST结束时，将它们从圆筒中取出，用纸巾擦干，并放置在单独的笼子中休息和恢复1小时，然后再终止实验。根据制造商的说明，使用双抗体试剂盒（ImmuChem，MP Biomedicals，Orangeburg，NY）通过放射免疫测定法测定血浆皮质酮水平。组内变异小于8%。

实时RT-PCR

这些测定是在未进行行为测试的静脉注射动物的大脑中进行的。冷冻的大脑被允许达到冰凉温度，嗅球、额叶皮层（Bregma 5.2至4.2 mm）、海马和脑干（Bregma-9至-14mm）被解剖，并使用Trizol试剂（Invitrogen）进行mRNA提取，如前所述(托内利等, 2004). 根据制造商的说明，使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），在20μl反应混合物中，将每个样品500毫微克的总RNA反转录成cDNA。使用iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）在50μl反应混合物中使用下列引物进行实时RT-PCR表1在0.9%琼脂糖凝胶中测试所有引物组，以确认单个扩增产物。细胞因子扩增产物直接克隆到pCRII-Topo载体（英维特罗根，佩斯利，苏格兰，英国）并测序以确认其身份。所有引物对均使用Accelrys Gene 2.0v软件设计。

表1

用于实时RT-PCR测定的引物序列

基因加入底漆顺序地区产品长度
IL-1βNM_031512号前轮驱动5′-AATGCCCTCGTGCTGTCTGACC-3′471-588118
利润5′-TTGTCGTTGCTTGTCTCTCCTTG-3′
肿瘤坏死因子-αNM_012675号前轮驱动5′-TCTTCTGTCTACTGAACTTCGGGG-3′284-36582
利润5′-ATGGAACTGAGAGAGGCC-3′
白介素-6NM_012589前轮驱动5′-CAAGAGACTTCCAGTGC-3′81-191111
利润5′-TGTGTGGTGGTTATCTCTG-3′
18秒X01117号前轮驱动5′-CCAGTAAGTGCGTCATAAGC-3′1650-173283
利润5′CCATCCAATCGGTAGCGAC-3′

IL-1β、IL-1β；肿瘤坏死因子α；IL-6、白细胞介素-6；18S，大鼠核糖体RNA亚单位。

实时PCR在MyiQ仪器（Bio-Read）上运行，采用以下三步循环程序：在95°C下初始热启动5分钟，然后在95°C下进行40个循环，变性步骤为15秒，在55°C下退火步骤为30秒，在72°C下延伸步骤为30 s，最后一步打开光学元件。在制备熔融曲线时，将样品在95°C下加热1分钟，然后在55°C下冷却1分钟，并以10 s的增量（0.5°C）执行熔融曲线，温度从55°C增加到95°C，同时打开光学元件。选择所有使用的引物，并对所述放大条件进行测试。cDNA合成的效率和一致性通过大鼠18S基因的扩增作为对照来确定。对于每一轮扩增，仅考虑与18S平均值相差1个周期内的样本进行进一步分析。对于特定靶基因的每个样本，每个周期阈值相对于18S进行标准化。使用2-ΔΔC类t吨方法(Livak和Schmittgen，2001年). 根据以下基因的公开序列进行分析：白细胞介素-1β（IL-1β，NM_031512号); 肿瘤坏死因子-α（TNF-α，NM_012675号); 白细胞介素-6（IL-6，NM_012589); 大鼠核糖体RNA亚单位18S（18S，×1117).

统计

开放场和FST数据采用双向方差分析（ANOVA）进行分析，性别（两个水平：女性/男性）和治疗（三个水平：对照组；LPS 12h；LPS 24h）作为静脉注射研究的因素。对于i.n.研究，同样的模型用于水平：对照；i.n.单剂量；静脉注射重复剂量。

皮质酮数据采用三元方差分析法进行分析，以性别（两个水平：女性/男性）、治疗（两个层次：对照；静脉注射LPS）和状况（两个层面：接受强迫游泳试验；未接受强迫游泳测试）为因素。

细胞因子表达数据采用双向方差分析法进行分析，以性别（两个水平：女性/男性）和治疗（三个水平：对照；LPS单次剂量；LPS重复剂量）为因素。

Tukey的多重配对比较被用作事后（post-hoc）对所有模型进行测试。显著性水平设置为第页<0.05.

结果

Fischer 344大鼠卵巢发情周期游泳行为的振荡

据报道，接受FST的雌性大鼠在发情周期的不同阶段表现出游泳行为的差异(Barros和Ferigolo，1998年;孔索利等, 2005;孔特雷拉斯等, 1998;Frye和Walf，2002年;马文等, 1996). 发情前/发情期的静止时间增加(孔特雷拉斯等, 1998;Frye和Walf，2002年;马文等, 1996)在第1期和第2期的中间期(Barros和Ferigolo，1998年;孔索利等, 2005). 这些差异在外系和近交系大鼠中均有报道。对F344/NHsd大鼠的早期研究未发现雄性和雌性大鼠游泳行为的差异(阿马里奥等, 1995); 然而，这些实验中没有考虑发情周期的阶段。因此，我们检测了在卵巢发情周期中，经盐处理的动物对雌性FST的行为反应(n个=24），并与雄性进行了比较(n个= 21). 在测试的第一天，对静止时间有显著影响（F（1,41）=20.1；第页<0.001）和游泳（F（1,41）=12.6；第页<0.001）和逃逸（F（1,41）=13.24；第页<0.008）检测到行为(图1a).后hoc分析表明，发情前/发情期的雌性在第1和第2次发情间期的雌性和雄性中增加了静止时间，减少了游泳和逃跑时间(图1a). 在间挤期对雄性和雌性大鼠进行比较时，没有观察到差异。第2天，静止状态下的性别效应显著（F（1,41）=25.4；第页<0.0001）和游泳（F（1,41）=10.7；第页<0.001），并且逃逸（F（1,41）=19.79；第页<0.0001）检测到行为(图1b).后hoc分析表明，与男性相比，无论发情周期处于哪个阶段，女性都增加了静止时间，减少了游泳和逃避行为(图1b). 为了避免在研究第一天FST中LPS的影响时引入此变量，在月经间期给动物注射和测试。

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近交系Fischer（F344/NHsd）大鼠在第1天（a）FST 10分钟和第2天（b）再次暴露5分钟期间在对照条件下的不动、游泳和逃跑行为。在第1天（a），在发情前阶段评估的雌性动物中检测到静止不动显著增加，游泳显著减少，逃避时间显著减少(n个=12）在第1次和第2次发情间期尊重女性(n个=12）和男性(n个= 21). **发情前/发情期差异显著第页<0.01. 在第2天（b），无论动情周期处于哪个阶段，雌性大鼠的静止时间和游泳时间都显著高于雄性大鼠。数值为平均值±SEM。#显著的性别差异第页<0.01.

静脉注射LPS的行为影响

露天试验

雌性和雄性大鼠经腹腔注射2 mg/kg LPS并在12(n个=24）或24(n个给药后24小时，水平探索性运动活动水平降低[F（2，42）=16,36；第页<0.0001] (图2a). 此外，在给药后12和24小时，我们检测到剂量为1 mg/kg的旷野中的活动减少（数据未显示）。总的来说，服用2 mg/kg并在24小时后进行测试的雌性和雄性大鼠的活动非常低(图3a). 在开阔场地分析的所有参数中，包括总活动度、中央交叉点和后部，均检测到显著差异(图3a). 其他疾病症状也很明显，包括在静脉注射LPS后24小时内测试时的毛发长出和红泪。在比较性别时没有观察到差异。这些数据表明，这些剂量的腹腔注射LPS会影响F344/Nhsd大鼠的运动探索行为，如之前在小鼠中所示(Dunn和Swiergiel，2005年).

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雄性和雌性大鼠腹腔注射（i.p.）对照盐溶液后，在旷野竞技场（a）试验5分钟内的总运动水平活动和FST 10分钟内的不动时间（b）(n个=24）或LPS（2 mg/kg）。12小时后对动物进行测试(n个=24）或24小时(n个=24）。数值为平均值±SEM*在控制盐水条件方面存在显著差异(*第页<0.05; **第页<0.01).

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在对照盐水条件下，雌性和雄性大鼠在旷野试验（a）5分钟内的总运动水平活动、中心交叉和总后仰，以及第1天FST（b）10分钟内的静止、游泳和逃跑时间(n个=24）或24小时后(n个=24）腹腔注射LPS（2 mg/kg）。数值为平均值±SEM*控制方面的重大差异(*第页<0.05; **第页<0.01).

强迫游泳测试

腹膜内注射2 mg/kg LPS对静止性产生显著影响（F（1,44）=19.7；第页<0.0001），游泳（F（1,44）=8.34；第页<0.006），逃逸（F（1,44）=11.7；第页<0.001）给药后24小时雄性和雌性大鼠在第1天测试时的行为（图​（图2b2亿和​和3b）。3亿).后hoc分析表明，与盐水处理的大鼠相比，LPS处理的动物具有增加的不动性和减少的游泳和逃跑行为。对于任何参数，均未观察到性别治疗的交互作用；然而，与LPS治疗的雄性相比，LPS治疗雌性表现出更高的静止值（图​（图2b2亿和​和3b）。3亿). 在12小时对动物进行测试时，未观察到盐处理大鼠的显著差异(图2b). 同样，静脉注射剂量为1 mg/kg的大鼠在服用LPS后12或24小时进行测试时，也没有观察到不动能力的差异。在第2天对大鼠进行测试时，两种剂量都没有任何显著影响（补充图S2）。

静脉注射LPS的行为影响

露天试验

在本系列实验中测试的任何剂量或给药时间表中，鼻腔注射LPS对行走运动活动、中心视野交叉次数或饲养均无影响（图​（图4a4a类和​和5a）。5a级). 此外，未检测到体重的显著变化（补充图S3）。

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雄性和雌性大鼠在旷野竞技场测试5分钟内的总运动水平活动（a）和FST 10分钟内的不动时间（b），通过单次鼻内注射LPS（100μg/大鼠）(n个=24）或连续2天静脉滴注LPS（每天100μg）(n个=24）或使用相应体积的对照盐水(n个= 24). 分别在单次给药后24小时或第二次给药24小时后对动物进行测试。数值为平均值±SEM**在控制盐水条件方面存在显著差异(**第页<0.01).

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在对照盐水条件下，雌性和雄性大鼠在旷野试验（a）5分钟内的总运动水平活动、中心交叉和总后仰，以及第1天FST 10分钟内的静止、游泳和逃跑时间（b）(n个=24）或经鼻（i.n.）给药两次LPS（每天100μg/只）后(n个= 24). 数值为平均值±SEM**控制方面的重大差异**第页<0.01.#显著的性别差异(#第页<0.05).

强迫游泳测试

重复腹腔注射100μg/只LPS，在静止状态下产生性×治疗效应（F（1,41）=5.5；第页<0.024）和逃逸（F（1,41）=5.6；第页<0.032）在FST第一天的行为（图​（图4b4b个和​和5b）。5亿).后hoc分析表明，与对照组和LPS组相比，LPS组雌性大鼠的静止性增加，逃避行为减少。与对照盐水相比，LPS处理的动物游泳时间没有差异（图​（图4b4b个和​和5b）。5亿). 单剂量服用LPS在所分析的任何参数中均未引起统计上的显著差异(图4b). 与静脉注射LPS类似，在试验的第二天对动物进行评估时，静脉注射的LPS与对照盐水没有显著差异。

这些数据表明，在雌性大鼠的鼻腔中重复注射LPS 2天可导致行为改变，表明FST显示抑郁，但不会影响整体运动活动。此外，静止时间的增加与逃避行为的减少平行，但不影响游泳行为。

腹腔注射LPS对皮质酮释放的影响

图6显示了雄性和雌性大鼠（性别因素）的血浆皮质酮浓度，这些大鼠接受了两种剂量的LPS（100μg/只）（治疗因素）的静脉注射，并接受或不接受FST（条件因素）。统计分析显示性别×治疗×条件效应显著。性别效应（F（1,74）=60.02；第页<0.0001); 治疗效果（F（1,74）=50.90；第页<0.0001); 条件效应（F（1,74）=37.89；第页<0.0001).后hoc分析表明，在所有测试条件下，女性的数值都高于男性。静脉注射LPS和FST的女性血浆皮质酮浓度最高(图6).后hoc比较显示，在这种情况下，女性与其他测试条件和男性相比，数值显著增加。

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F344/NHsd大鼠血浆皮质酮浓度（ng/ml）的放射免疫测定。数值为平均值±SEM（i.n.生理盐水no-FST）：动物i.n.注射生理盐水，未进行强迫游泳试验(n个= 16). （i.n.生理盐水FST）：动物经鼻注入生理盐水，并在强迫游泳试验中进行评估(n个= 24). （i.n.LPS no-FST）：静脉注射LPS（两次剂量为100μg/大鼠）且未接受FST的动物(n个= 16). （i.n.LPS FST）：通过静脉注射LPS（两次剂量100μg/大鼠）并在FST中进行评估的动物(n个= 24). *控制方面的重大差异(*第页<0.05; **第页<0.001).#显著的性别差异(#第页<0.01;##第页<0.001).

静脉注射LPS对细胞因子基因表达的影响

白细胞介素1-β

在雄性和雌性大鼠单次或重复腹腔注射LPS后，在所分析的任何脑区均未观察到与对照盐水有关的差异。此外，在所分析的任何地区均未发现性别差异。

肿瘤坏死因子-α

海马区表现出显著的性别×治疗效应（F（1,21）=4.25；第页<0.04）和脑干（F（1,21）=4.89；第页<0.02）两次剂量100μg/大鼠腹腔注射LPS后(图7b和e).后hoc分析表明，在脑干中，两种剂量的静脉注射脂多糖（LPS）均使雄性和雌性大鼠相对于其自身对照组显著增加，且雌性大鼠的增加幅度高于雄性大鼠(图7e). 在海马体中，只有雌性大鼠在两次腹腔注射LPS后，与对照组相比显著增加(图7b). 单次注射LPS后，脑干和海马没有观察到显著差异。与IL-1β类似，在任何测试条件下，额叶皮层和嗅球均未检测到差异。

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生理盐水条件下雌性和雄性F344/NHsd大鼠海马和脑干中相对mRNA细胞因子的表达(n个=12），单次经鼻（i.n.）注射LPS（100μg/只）24小时后(n个=12）或连续2天滴注两次LPS（每天100μg）后(n个= 12). 通过从相同的cDNA制备中获得的三份样品对每个脑区进行IL-1β（a，d）、TNF-α（b，e）和IL-6（c，f）的测定。数值为平均值±SEM。数值是相对于以对数刻度显示的对照盐水的折叠诱导值。臀部：海马；Bnstm：脑干**控制方面的重大差异第页<0.01.#性别差异显著，第页<0.05.

白细胞介素-6

在雌性大鼠海马中检测到显著的性别×治疗效应（F（1,21）=4.05；第页<0.05），但脑干中没有(图7c和f).后hoc分析表明，反复注射LPS后，雌性大鼠海马中IL-6水平较雄性大鼠升高(图7c). 由于IL-1β和TNF-α的情况是一样的，因此在静脉注射LPS后，嗅球和额叶皮层中的IL-6与对照盐水没有差异。

讨论

这里的数据显示，当在雌性大鼠的鼻腔中注射LPS时，外周LPS诱导的抑郁样行为。这些效应与游泳后皮质酮反应过度类似，表明糖皮质激素对压力的反应发生了改变。最后，还观察到接受静脉注射LPS的雌性大鼠海马和脑干中TNF-α升高。此外，这些数据证实了先前的观察结果，即腹腔注射LPS后FST测定的啮齿动物抑郁样行为的诱导是剂量依赖性的，与运动功能障碍平行(迪克等, 2005;Dunn和Swiergiel，2005年).

首次滴注LPS 48小时后，以及连续两次滴注LPS-后，经鼻注射LPS-可显著增加雌性大鼠的静止时间。未检测到野外总探索活动的变化，也未观察到体重的显著变化。这表明行为效应与鼻腔的局部炎症过程有关，而不会引起明显的疾病症状。这也表明i.n.LPS需要一定的时间来影响行为，并且它是性别特异性的。此外，必须考虑到这种影响仅限于测试的第一天，并且它不会影响游泳行为，但会影响逃跑行为。另一方面，在给药后24小时，以本研究测试的更高剂量（2 mg/kg）腹腔注射雄性和雌性大鼠，观察到通过增加不动度来测量的抑郁样行为。在早期时间点测试的相同剂量或在24小时测试的较低剂量不会对静止性产生显著变化，但会影响野外测试中的探索性反应。这些数据表明，尽管腹腔注射脂多糖诱发的疾病症状是可测量的，但大鼠在全身炎症急性期反应期间能够对应激源（如FST）产生行为反应。这也表明，在脓毒症期间，大鼠能够应对FST挑战的阈值是剂量和时间依赖的。目前静脉注射研究的一个重要考虑因素是，只测试了单次注射的脂多糖。腹腔注射LPS的其他方案，例如重复的较低剂量，可能仍然可以提供使用腹腔注射LPS和FST区分疾病和抑郁症的模型。

尽管FST作为抑郁行为的模型存在一些争议，但公认的是，该测试模拟了抑郁的某些方面，涉及压力源的不可控性（大鼠无法逃离圆柱体），评估被动（静止或漂浮）与积极应对压力（挣扎和游泳）(Cryan and Holmes，2005年). 静脉注射LPS后观察到的反应类型可能表明一个特定的神经化学系统参与了对静脉注射LPS的反应，因为不同类型的抗抑郁药对FST中的活动行为有不同的影响(Cryan公司等, 2005). 虽然目前的研究可能远未提供导致个体水平抑郁的免疫功能的具体机制，但i.n.LPS免疫挑战表明，上呼吸道感染可能是一年中某些时候情绪障碍发病率增加的一个因素(纳尔逊等, 2002). 平均而言，儿童每年有6至8次上呼吸道感染，成人每年有2至4次上呼吸道传染(蒙托，1994年;蒙托和乌尔曼，1974年). 尽管上呼吸道感染通常是良性的，但它给社会带来了巨大的经济负担；美国有2000万天缺勤，2200万天缺课(亚当斯等, 1999).

众所周知，鼻内滴注LPS可诱发以中性粒细胞和巨噬细胞浸润以及产生趋化因子和包括TNF-α在内的细胞因子为特征的气道炎症(Delayre Orthez公司等2005年a,b条). 此外，包括IL-6和IL-12在内的重组细胞因子的静脉滴注已被证明会影响大鼠实验性神经紊乱的进程(卡卢夫等, 2004;佩利杜等, 2000). 虽然静脉注射细胞因子与脑功能的关系机制尚不清楚，但这些研究表明，作为炎症过程的一部分，鼻腔中分泌的细胞因子有可能影响脑功能。为了支持这一观察，目前的数据显示，首次静脉注射LPS 48小时后，大脑中细胞因子转录的诱导是可测量的。从检查的大脑区域来看，脑干和海马体的反应性最高，额叶皮层和嗅球没有变化。除嗅球外，这些大脑结构的细胞因子反应与脑内注射放射性标记胰岛素样生长因子-i（7.65kDa蛋白）分布的区域一致(索恩等, 2004). 此外，据报道这些区域参与情绪调节(阿兰戈等, 2002;Drevets，2000年). 然而，必须考虑到，包括参与情绪调节的下丘脑和杏仁核复合体在内的其他重要区域，也是神经递送分子的靶点，在本研究中未进行分析。另一个考虑是，嗅球中细胞因子表达的变化是预期的，但没有检测到。这可能是由于该区域的免疫反应不同，根据抗原的类型，涉及不同的细胞因子和趋化因子(瑞等, 2006). 嗅球与暴露于环境中的感觉神经元的密切关系可能在这种结构的差异性细胞因子反应中起作用。

我们在接受静脉注射的动物中，在诱导TNF-α转录的过程中，在海马和脑干中获得了二型反应。众所周知，许多物种的雌性在免疫后比雄性产生更强的免疫反应，并提高了感染的存活率(Verthelyi，2001年;温斯坦等, 1984). 与男性相比，体液反应和抗体产生的增加被认为参与了这种增加的存活率(Verthelyi，2001年). 在小鼠大脑中，经静脉接种水疱性口炎病毒后，雌性小鼠相对于雄性小鼠的免疫反应增强(巴纳等, 1996)单纯疱疹病毒-2或脑内注射LPS(苏西等, 2005). 这被认为与雌性体内更强的细胞因子表达和从先天免疫应答转移到适应性免疫应答有关(苏西等, 2005)TNF-α在其中发挥了重要作用(拉赫曼和麦克法登，2006年). 与这一点相关，最近有研究表明，TNF-α受体缺乏的小鼠在FST中的静止时间减少，支持TNF-β在抑郁行为反应中的作用(西梅恩等, 2006). 此外，作者报告说，野生型动物的TNF-α受体在脑干和海马高度表达，本研究报告在这两个区域中，静脉注射LPS后TNF-β转录增加。

在海马体中，但在所研究的其他大脑区域中没有，也检测到女性腹腔注射LPS后IL-6的表达增加。该区域IL-6受体丰富，IL-6已被证明干扰记忆巩固(巴尔肖恩等, 2004). 然而，目前的研究并没有解决这些脑区细胞因子表达的特征是否与观察到的行为症状有因果关系。此外，静脉注射治疗诱导的细胞因子循环水平可能有助于观察到的效果。此外，在本研究中观察到的性激素在调节行为、糖皮质激素和细胞因子反应中的作用尚未得到解决。这些问题将是未来研究的问题。

由静脉注射LPS诱导的另一个二型因子可能独立于脑细胞因子而导致行为症状，这是对FST的糖皮质激素反应。已知F344/NHsd雌性大鼠在所有已知的近交系和远交系大鼠中表现出最高的下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴反应性(托内利等, 2001). 然而，本研究中检测到的经静脉注射LPS和FST刺激的雌性F344/NHsd大鼠的浓度可能代表该菌株的最大皮质酮反应(阿马里奥等, 1995;格罗塔等, 1997;托内利等, 2001,2003). 静脉注射给药动物的皮质酮浓度是对照组的两倍多，与强迫游泳应激后的值相似。更重要的是，接触FST的i.n.LPS动物的值是单独或单独FST诱导值的两倍。这些发现也可能与人类抑郁症有关。尽管没有确凿的证据表明糖皮质激素和抑郁症之间的确切机制，但对抑郁症患者进行的研究强烈表明，糖皮质激素水平和/或HPA轴反应的改变是人类抑郁症的标志(贝拉诺夫等, 2002;Gillespie和Nemeroff，2005年;Gold和Chrousos，2002年;黄金等, 2002;麦克尤恩，2002;斯瓦布等, 2005). 人类研究和动物模型都表明，在患有抑郁症的人和出现抑郁样行为的动物中发现了高皮质醇血症和/或糖皮质激素对压力反应的改变。目前正在研究几种机制来解释这种联系，包括与神经递质和神经肽的相互作用(Leonard，2005年;舒尔金等, 1998)，大脑的结构重塑(麦克尤恩，2005)，糖皮质激素受体功能丧失(Pariante，2004年;Pariante和Miller，2001年)以及与免疫系统的相互作用(希默里奇等, 2006;Leonard，2005年).

总之，雌性大鼠反复静脉注射LPS会产生抑郁样行为，对压力产生最大的皮质酮反应，并增加大脑中TNF-α的转录。随着对其机制的进一步研究，这些发现可能会进一步加深我们对免疫系统在抑郁症病理生理学中所起作用的理解。

补充材料

S1（第一阶段）

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S2系列

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第3章

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致谢

部分由NIH K12 HD43489，女性健康跨学科研究职业（BIRCWH）奖和R21MH075905-01A1向LH Tonelli提供支持。我们感谢Drew E Carlson博士在皮质酮测定方面的帮助，感谢Hegang Cheng博士在统计分析方面的帮助。

脚注

披露/利益冲突

作者没有任何利益冲突需要报告。

补充信息附在神经精神病理学网站上的论文(http://www.nature.com/npp)

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