在过去20年里，免疫学的基本进展为基于细胞的癌症治疗的发展带来了机遇(1,2). 在接受淋巴消耗条件治疗的患者中进行离体扩增、转移和克隆再增殖后，发现自体肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）可在一定比例的转移性黑色素瘤患者中介导客观的癌症消退(三–5). 这种方法的一个局限性是要求患者具有可体外扩增的预先存在的肿瘤反应细胞。此外，在许多癌症患者中，尤其是那些患有非黑色素瘤癌症的患者，很难识别这些肿瘤反应性淋巴细胞。为了克服这一局限性，我们着手开发一种基于正常外周血淋巴细胞（PBL）基因修饰的癌症免疫治疗方法。
肿瘤相关抗原（TAAs）由T淋巴细胞表面的T细胞受体（TCR）识别，TCR受体由TCRα链和β链组成(6). 现已克隆了编码TCR的基因，这些基因对多种TAA具有特异性，包括TCR识别的MART-1和gp100黑色素瘤/黑色素细胞分化抗原、存在于许多常见上皮癌上的NY-ESO-1癌抗原以及来自p53分子的表位，约50%的常见上皮源性癌症表面表达(7–12). 在每种情况下，当这些抗原被主要组织相容性复合体蛋白人类淋巴细胞抗原（HLA）-A2编码的分子呈现为肽时，TCR检测到这些抗原。来自四个TAA反应性TCR（识别MART-1:27-35、gp100:209-217、NY-ESO-1:157-165和p53:264-272）的体外转录RNA被电穿孔到CD8中+PBL，然后与肽脉冲T2细胞共同培养。这些转染细胞在各自的肽刺激下产生大量干扰素-γ（IFN-γ）()并且能够识别HLA-A2匹配的肿瘤，包括黑色素瘤、肺癌和乳腺癌（表S1）。此外，用这些编码TCR的逆转录病毒载体转导将正常PBL转化为能够在体外特异性识别和破坏多种常见癌症（如肉瘤和乳腺癌、肺癌、食道癌和肝癌）的新鲜细胞和培养细胞的细胞(9–12).
TCR工程细胞的转导和分析。(A类)CD8（CD8）+用RNA编码控制[绿色荧光蛋白（GFP）]电穿孔人类淋巴细胞，或克隆与人类TAAs MART-1、gp100、NY-ESO-1和p53的HLA-A2限制性表位反应的TCR。效应器T细胞与用1μM所示肽脉冲的T2细胞共培养（数值以IFN-γ（pg/ml）表示）。显示细胞因子特异性释放的数值以粗体显示。(B类)用于工程人类淋巴细胞的重组逆转录病毒载体MSGV1AIB的示意图。LTR，长末端重复；Ψ，扩展包装信号；sd，剪接供体；sa，剪接受体；α，α链；IRES，内部核糖体进入位点；Beta，Beta链。(C类)在转导后5天，对转导的（Td）淋巴细胞进行Vβ12和MART-1四聚体[Ala27→卢27CD8中的（A27L）]+细胞与未转导（UnTd）细胞的比较。右上角的数字表示该象限中阳性细胞的百分比。(D类)来自患者6的TCR载体工程细胞（TCR）与MART-1肽脉冲T2细胞、HLA-A2共培养−黑色素瘤细胞系（Mel 888）或HLA-A2+黑色素瘤细胞系（Mel 526），并测定IFN-γ的产生量。控制效应物为未转导细胞（PBL）和MART-1反应性TIL JKF6（JKF5）。(E类)输注前，测定所有患者的基因工程淋巴细胞的抗黑色素瘤特性。与肽脉冲T2细胞共培养后IFN-γ（pg/ml）的产生（肽反应性）和HLA-A2的抗黑色素瘤活性（肿瘤反应性）+线（526和624）和HLA-A2−行（888和938）。
为了研究基因工程PBL在体内识别和破坏肿瘤细胞的能力，我们转导了来自黑色素瘤患者的PBL，其基因编码抗MART-1 TCR的α链和β链。这些基因是从一名癌症患者获得的TIL克隆中克隆的，该患者在TIL过继细胞移植（ACT）后，转移性黑色素瘤几乎完全消退(5). 构建并优化逆转录病毒载体以表达MART-1 TCRα链和β链() (13). 通过对TCR中特定Vβ12蛋白的染色来评估基因转移效率，结果在30%的转导CD8中表达+单元格()，相比之下，约1%的未转染的对照细胞培养物（CD4和CD8细胞之间的基因转移大致相等）。15%的转导CD8+结合MART-1肽特异性HLA-A*0201四聚体的细胞(和表S2）。TCR转导的细胞具有生物活性，如与MART-1肽脉冲细胞和HLA-A2阳性黑色素瘤细胞系共培养后IFN-γ的特异性分泌所证明的().
为了研究这些MART-1 TCR工程T细胞的体内疗效，我们选择了17例HLA-A*0201进展性转移性黑色素瘤患者()用于治疗。所有患者的癌症对之前使用白细胞介素-2（IL-2）治疗无效。所有17例患者的T细胞培养物均具有生物反应性，与表达MART-1抗原的MART-1肽脉冲T2细胞和/或黑色素瘤细胞株共培养后可特异性分泌IFN-γ(). 通过对这些淋巴细胞中Vβ12表达的染色测定的基因转移效率范围为17至67%（42%，平均值）(和表S2）。
表1
患者人口统计、接受的治疗和临床结果。Ln，淋巴结；铜，皮肤；皮下；李，肝脏；Lu，肺；肾上腺；Pa，胰腺；Br，大脑；嗨hilum。NR，无响应；PR，部分响应；MR，轻微或混合反应。
| 队列 | 病人 | 年龄/性别 | 注入的细胞总数（×10−9) | CD4/CD8（%） | 维生素B12（%） | 注入MART-1细胞（×10−9)‡ | 文化中的日子 | 加倍时间（天）† | IL-2剂量§ | 可评估疾病的部位 | 响应（持续时间以月为单位）|| |
|---|
| 1 | 1 | 28/M月 | 11 | 27/73 | 67 | 7.4 | 19 | 8.7 | 7 | Ln，铜 | 尼泊尔卢比 |
| 2a个* | 44楼 | 13 | 3/95 | 64 | 8.3 | 19 | 11.9 | 10 | Ln，铜 | 尼泊尔卢比 |
| 三 | 58/月 | 14 | 17/82 | 35 | 4.9 | 19 | 10 | 11 | 铜，Sub | 尼泊尔卢比 |
| 2 | 4 | 52/月 | 1 | 50/50 | 42 | 0.5 | 6 | 1.4 | 9 | 李，Sub | 公关(21) |
| 5 | 50个/M | 12 | 18/82 | 17 | 2.2 | 8 | 1 | 7 | Lu、Ln、Sub | 尼泊尔卢比 |
| 6 | 55楼 | 7 | 37/72 | 51 | 3.6 | 7 | 1.3 | 8 | 卢，林 | 尼泊尔卢比 |
| 7 | 56/月 | 9 | 75/21 | 40 | 3.6 | 7 | 1 | 5 | 卢，林 | 尼泊尔卢比 |
| 8 | 37/月 | 6.1 | 68/40 | 32 | 1.9 | 7 | 1.3 | 12 | 卢，林 | 尼泊尔卢比 |
| 9 | 53个/月 | 4.2 | 72/24 | 41 | 1.7 | 7 | 2 | 9 | Ln、Ad、Sub | 先生 |
| 10 | 45个/月 | 8.6 | 53/30 | 34 | 2.9 | 6 | 0.6 | 5 | Ln，接头 | |
| 11 | 45个/月 | 6.3 | 7/92 | 45 | 2.8 | 6 | 0.8 | 5 | 卢、帕、林 | 尼泊尔卢比 |
| 12 | 32楼 | 4.7 | 30/60 | 61 | 2.9 | 6 | 0.7 | 5 | Br、Sub | 尼泊尔卢比 |
| 13 | 41个/月 | 7.7 | 40/67 | 42 | 3.2 | 6 | 0.9 | 7 | 卢，苏 | 尼泊尔卢比 |
| 2亿* | 44楼 | 2.1 | 30/59 | 53 | 1.1 | 6 | 1.9 | 14 | Ln，铜 | 尼泊尔卢比 |
| 三 | 14 | 30/月 | 86 | 11/60 | 40 | 34.4 | 18+9 | 0.9 | 5 | 您好! | 公关(20) |
| 15 | 51个/M | 38 | 16/82 | 45 | 17.1 | 18+9 | 3.3 | 8 | 卢 | 尼泊尔卢比 |
| 16 | 25楼 | 33 | 13/76 | 21 | 6.9 | 18+9 | 1.2 | 2 | 卢、李、苏 | 尼泊尔卢比 |
| 17 | 20楼 | 23 | 17/78 | 30 | 6.9 | 17+8 | 1.1 | 三 | Lu、Ln、Sub | 尼泊尔卢比 |
患者在最大淋巴消耗时间接受MART-1 TCR转导的自体PBL的ACT治疗(13). 初始队列中的三名患者在延长培养期19天后接受细胞治疗，细胞倍增时间为8.7至11.9天(，队列1，患者1、2a和3）。在这些患者中，输注后的前30天内，<10%的转导细胞在测试的时间点内持续存在，且≤2%的细胞在50天后持续存在(). 前三名患者的病情进展没有延迟。
基因标记细胞的持久性。从外周血单个核细胞（PBMC）中提取DNA，进行实时定量PCR，以测定输注后不同时间患者循环中载体转导细胞的百分比。每行代表来自单独患者的数据。(A类)第1组；(B类)第2组；(C类)第三组。(D类)治疗后给定时间间隔内每个队列中所有患者的基因标记细胞百分比的平均值。(E类)CD8的百分比+/Vβ12+中间门单元(13)显示了队列2和队列3中的患者。(F类)CD8的百分比+/3月1日+在所示时间测定了队列2和队列3患者的四聚体细胞。每个患者的治疗前值绘制为输液后第0天。
为了给处于活跃生长期的基因修饰淋巴细胞注射，对培养条件进行了修改(13)用CD3抗体刺激细胞后，将体外培养期限制在6至9天(，队列2，细胞加倍时间≤2天）。在另一个队列中，通过执行第二个快速扩增方案，产生了更多的ACT活跃分裂细胞(14)8至9天后(，队列3，细胞倍增时间从0.9天到3.3天）。与队列1患者缺乏细胞持久性相反()，队列2和队列3中的患者()在治疗后1周和4周，所有转基因细胞均表现出>9%的持续性（范围为9-56%）。治疗后>50天提供样本的所有8名患者的细胞持续性均>17%，在>90天的监测期内，7名患者的这种持续性水平是持久的。在一名患者（患者14）中，>60%的循环淋巴细胞对基因标记细胞呈阳性().
在ACT后一个月检测的14例患者样本中，定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测显示存在载体衍生RNA，证实基因表达持续（表S3）。除一名患者外，所分析的15名患者的CD8水平均升高+/治疗后1周时的Vβ12细胞，15例患者中有11例在1个月时的水平高于预处理水平(). 在接受检查的13名患者中，所有患者在治疗后MART-1四聚体结合细胞均增加()14人中有11人的酶联免疫吸附斑点阳性细胞数量增加（表S4）。
然而，与Vβ12表达细胞（8.1%）和MART-1四聚体结合细胞（0.8%）的测定结果相比，PCR测定的队列2和队列3中转导细胞在1个月时的平均持续时间（26%）存在不一致。这种不一致的部分原因可能是引入的TCR链与内源性链的错配，以及分析的不同敏感性。在≥1个月时，持续细胞中转基因表达的减少也可能是上述减少的一个函数(15)逆转录病毒插入的转基因的转录和活化细胞向记忆细胞转化过程中代谢活性的下降。逆转录病毒转基因表达的减少预计会对四聚体的测量产生更大的影响，四聚体依赖于多种受体的聚集，而不是通过抗体染色直接检测Vβ12细胞。
最重要的是，两名患者的转移性黑色素瘤按照标准标准[实体瘤反应评估标准（RECIST）]进行了持续客观回归评估(16). 患者4，52岁男性，之前接受过干扰素-α（IFN-α）、淋巴结清扫、实验疫苗和大剂量IL-2治疗。患者随后在肝脏（4.4-x3.3-cm肿块）和腋窝（1.3x1.2-cm肿物）出现进展性疾病。在接受上述ACT方案治疗后，他的腋窝肿块完全消退，肝脏肿块减少89%()，当时它被移除。治疗后21个月，他仍无临床疾病。患者14，一名30岁男性，之前接受过淋巴结清扫、IFN-α和高剂量IL-2的治疗。他在肺门处出现了一个4.0×2.5厘米的肿块。在ACT治疗后，他接受了肺门肿块的消退，20个月后临床上无任何疾病(). 因此，两名患有快速进行性转移性黑色素瘤的患者在转移基因工程自体PBL后表现出疾病的完全临床退化。
两名患者的癌症消退。(A类)患者4在使用TCR工程化T细胞治疗前、治疗1个月和治疗10个月时拍摄的肝转移CT图像。(B类)患者4的肝脏和腋窝肿瘤大小和肿瘤部位的消退速度。第0天，开始治疗。L Axill LN，左侧腋窝淋巴结。(C类)14例肺门淋巴结转移的CT表现；预处理、第0天、治疗后2个月和12个月。白色箭头表示肺门的肿块。(D类)患者14的肿瘤大小和消退速度。(E类)采用实时定量PCR对患者4和14的PBMC中的基因标记细胞进行定量。患者Pt。注射日期（Inf.）用箭头表示。(F类)CD8的百分比+/Vβ12+中间门单元(13)在患者4和14的循环中。
在4号和14号受试者中，与输注细胞数量相比，循环中的基因标记细胞数量（假设为全身淋巴细胞的1%）分别增加了1400和30倍。输注1年后，两名有反应的患者的循环基因转导细胞均维持在较高水平（介于20%和70%之间）(). 患者4在治疗后1年限制循环淋巴细胞的稀释T细胞克隆，从而证实了这种高水平的基因标记细胞，根据PCR检测，42%（79个T细胞克隆中的33个）含有转基因。这两名患者在治疗后>300天内也显示出Vβ12细胞，通过抗体染色可检测到其在12%至16%之间(). 患者4和14也是四名患者中的两名，他们在细胞输注后15天内检测到>1%的循环四聚体阳性细胞()，并且这两名患者在离体共培养试验中表现出抗TAA反应性（表S5）。基因标记细胞对任何患者均无毒性作用。尽管转基因转移细胞在体内的表达随着时间的推移而降低，但其功能活性明显维持在足以介导所观察到的肿瘤退化的水平。
目前正在研究增加转基因表达和功能的方法，包括可能使用慢病毒载体、使用更强大的T细胞特异性启动子、使用可介导CD8非依赖性抗肿瘤反应的高亲和力TCR、进一步优化T细胞转导方法、，以及产生更高滴度的临床级病毒。防止链错位的方法可能包括改变TCR恒定区，插入单链受体(17)或造血干细胞的基因改造(18). 由于肿瘤特异性可以高效地赋予大量PBL群体，因此可能选择具有不同抗肿瘤特性的PBL亚群体。对PBL进行进一步的基因修饰以插入细胞因子或组织归巢分子可能是有益的。小鼠模型预测，通过在制备方案中添加全身照射或注射含有转导TCR识别的抗原的疫苗，增加淋巴消耗也可以提高治疗效果(19,20)这些修改目前正在临床试验中探索。
在人类受试者中，用抗TAA–TCR基因在体外转导并在癌症患者中再灌注的正常自体T淋巴细胞，可以在体内长时间持续表达转基因，并介导大肿瘤的持久消退。尽管第2组和第3组的有效率（15名患者中有2名或13%）低于输注自体TIL的有效率（50%），但这种方法有可能用于无法获得TIL的患者。构建PBL以表达识别NY-ESO-1或p53抗原的高亲和力TCR(和表S1）能够在体外识别多种常见癌症上表达的TAAs，这些基因工程细胞用于治疗常见上皮癌患者值得评估。
