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分子生物学细胞。2008年3月；19(3): 1104–1112.
doi（操作界面）：10.1091/桶。E07-10-1004号
预防性维修识别码：项目经理2262981
PMID：18199679

天然产物Celastrol对热休克和抗氧化反应的激活：一种硫醇靶向分子的转录特征

艾米·特罗特,*† 詹姆斯·韦斯特,†‡ 拉达·克莱奇,§ 桑迪·韦斯特海德,‡ 理查德·西尔弗曼,§ 理查德·森本理查,‡和凯文·莫拉诺通讯作者*
彼得·沃尔特，监控编辑器
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摘要

应激反应途径使细胞能够感知环境变化和不利的病理生理状态并作出反应。细胞应激途径的药理学调节在人类疾病的治疗中具有重要意义，包括神经退行性疾病、心血管疾病和癌症。醌-甲酰胺-三萜-雷公藤醇（quinone methide triterpene celastrol）来源于一种中药，具有多种药理特性，是哺乳动物热休克转录因子HSF1的有效激活剂。然而，人们对其作用模式和细胞靶点光谱知之甚少。我们在这里显示雷公藤红素激活Hsf1酿酒酵母与哺乳动物细胞中的有效浓度相似。转录谱分析显示，雷公藤红素处理除了诱导热休克基因外，还诱导了一系列氧化防御基因。Celastrol通过对亲电化合物作出反应的羧基末端氧化还原中心激活酵母Yap1氧化防御转录因子。抗氧化反应基因同样在哺乳动物细胞中被诱导，这表明雷公藤红素对两种主要细胞应激途径的激活是保守的。我们报告称，雷公藤红素的生物效应，包括对糖皮质激素受体活性的抑制，可以通过添加过量的游离硫醇来阻断，这表明了一种基于该天然产物修饰关键活性硫醇的生物活性化学机制。

简介

热休克反应（HSR）是一种古老而高度保守的细胞保护机制。热休克蛋白（包括蛋白伴侣）的产生对于受损蛋白质的折叠、修复或分类至关重要；因此，它有助于促进细胞在可能诱导凋亡的条件下的生存能力(麦克米兰等。, 1998;基督教徒等。2002年). 人们对发现和开发用于治疗目的的调节HSR和平行应激反应途径的小分子非常感兴趣(森本和桑托罗，1998年;韦斯特海德和森本茂，2005年;Corson和Crews，2007年). HSR受应激诱导热休克转录因子HSF1调控，HSF1在应对环境应激、发育和许多病理生理条件（包括癌症、缺血再灌注损伤、糖尿病和衰老）中发挥关键调节作用(森本和桑托罗，1998年;Morano和Thiele，1999年a).

在识别HSF1调节化合物（如雷公藤内酯醇和槲皮素）、HSF1抑制剂和激活剂（如蛋白合成抑制剂嘌呤霉素、蛋白酶体抑制剂MG132、非甾体抗炎药水杨酸和吲哚美辛以及热休克蛋白（Hsp））方面取得了重大进展90种抑制剂根考和格尔德霉素(Hightower，1980年;Jurivich公司等。, 1992;李等。, 1995;长井等。, 1995;Bagatell公司等。2000年;霍姆伯格等。2000年;韦斯特海德等。, 2006). 对可能有助于治疗亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化症（ALS）神经症状的新型药理活性化合物进行大规模筛选后，确定了天然产物雷公藤醇，一种从卫矛科植物中分离的三萜类化合物(雅培，2002;海姆斯克等。2002年). 这些植物的根皮提取物因其抗炎特性而常用于中药中，这与最近发现的雷公藤红素是核因子-κB的有效抑制剂相一致(Corson和Crews，2007年;塞提等。, 2007). 此外，雷公藤红素可降低与1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）和3-硝基丙酸诱导的小鼠神经退行性变相关的神经毒性(职员等。, 2005). 其中一些抗神经退行性变的特性可能归因于HSF1的激活，因为雷公藤红素诱导HSF1 DNA结合和过度磷酸化，以促进热休克基因表达，并抑制HSF1再加压因子Hsp90的功能(韦斯特海德等。, 2004;穆斯等。, 2006). 雷公藤红素产生这些众多生理效应的化学机制尚不清楚。

这里，我们报道雷公藤红素激活酵母中的Hsf1酿酒酵母其特征与热休克密切相关，包括Hsf1过度磷酸化、HSPs的产生和诱导对致命热休克的耐受。通过全基因组转录谱分析，我们发现雷公藤红素同时在酵母中引发了之前未被认可的氧化剂防御反应。雷公藤红素治疗RKO人结直肠癌细胞与热休克靶点同时诱导抗氧化基因。雷公藤红素对多种细胞过程的影响，包括抗氧化反应激活、热休克反应激活和抑制糖皮质激素受体成熟，可以通过与游离硫醇孵育来阻止。总之，这些发现表明，雷公藤红素同时激活多种应激途径，最终影响细胞存活，并强调了雷公藤红素通过与蛋白质中关键硫醇反应实现其细胞内效应的潜在机制。

材料和方法

酵母菌株和质粒

本研究中使用的酵母菌株为W303(MATa ade2-1 trp1可以1-100 leu2-3112 his3-11,15乌拉3)和BY4741(马塔·乌拉3Δ0列2Δ0他的3Δ1米15Δ0)应变背景。这个YAP1-塔普（串联亲和纯化标签）菌株和gpx3型Δ：kanMX4码缺失菌株(gpx3型Δ）是从Open Biosystems（美国亚利桑那州亨茨维尔）购买的，否则与BY4741同基因。W303型HSF1-塔盘通过聚合酶链反应（PCR）扩增TAP标签序列和可选择的TRP公司来自先前描述的质粒构建的标记(普格等。, 1998). PCR产物转化为W303细胞和Trp+通过免疫印迹筛选菌落，以在正确的位点整合TAP-tag。The ability of theHSF1-塔盘获得正常抗热休克水平的等位基因被用作诊断，以确认表达的Hsf1-TAP的功能（数据未显示）。HSE-拉奇报告质粒（HSE-lacZ）和酵母AP-1（Yap1）报告基因pCEP12（ARE-lacZ）已经在前面描述过(哈尔什曼等。, 1988;桑托罗等。, 1998). 酵母菌在非选择性条件下生长于富含YPD（0.2%杆菌蛋白胨、0.1%酵母提取物和2%葡萄糖）或合成完整（SC）培养基中。为了保持雷公藤红素的溶解度，按照指示使用添加50 mM Tris-HCl（pH 7.5）的最小培养基进行实验。将塞拉斯托尔作为10 mM储备溶于二甲基亚砜（DMSO）中。除非另有说明，否则在30°C条件下，对生长到对数相的菌株进行实验。在加入细胞之前，将两种化学物质预混合5分钟，即可实现雷公藤红素的二硫苏糖醇（DTT）灭活。质粒p413GPD-rGR和pYRP-GRElacZ(URA3公司)如前所述，用于测定异源表达的大鼠糖皮质激素受体的Hsp90伴侣(莫拉诺等。, 1999).

哺乳动物细胞培养、RNA分离和逆转录（RT）-PCR

RKO人结直肠癌细胞在补充有10%胎牛血清和抗生素的DMEM中生长。用不同浓度的雷公藤红素在约60–80%的汇合处处理细胞6小时。根据制造商的说明，使用RNeasy提取试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN）和柱上DNase I处理从细胞中分离出总RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒（加州Hercules Bio-Rad）逆转录RNA（1.0μg）。RT-PCR引物已在之前报道过(West和Marnett，2005年). 使用标准循环条件，用Taq聚合酶（Promega，Madison，WI）扩增PCR产物。

报告人分析

包含拉奇通过离心收集转录报告融合物，并将其重新悬浮在添加50 mM Tris-HCl（pH 7.5）的选择性培养基中。细胞在30°C下用20μM雷公藤红素或二甲基亚砜处理1小时，并持续摇晃，然后通过离心法收集。细胞颗粒立即在干冰中冷冻。如前所述测定β-半乳糖苷酶活性(莫拉诺等。, 1999). 使用β-半乳糖苷酶报告器在37°C下进行热休克实验，因为发现39°C会降低酶活性。如前所述，使用RKO细胞对含有单个转录因子结合位点的构建物进行报告者分析(West和Marnett，2005年). 使用稳定的HeLa进行荧光素酶报告分析-hsp70.1磅-如前所述进行luc细胞系(韦斯特海德等。, 2004).

蛋白质分析

如前所述，使用碱裂解程序制备蛋白质提取物(Ooi公司等。, 1996). 为了分析短暂Yap1–谷胱甘肽过氧化物酶3（Gpx3）复合物的形成，处理后立即用冰镇20%三氯乙酸沉淀细胞。细胞提取物在非还原性样品缓冲液中通过玻璃基底裂解制备，并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）前用10 mM DTT处理或还原。免疫印迹程序如前所述进行(莫拉诺和蒂勒，1999b). 能够识别Ssa3和Ssa4的多克隆抗血清是E.Craig（威斯康星大学，威斯康星，麦迪逊）赠送的一份礼物。分别从Invitrogen（Carlsbad，CA）和Sigma-Aldrich（St.Louis，MO）获得了抗磷酸甘油酸激酶（PGK）和TAP标签（蛋白A表位）的抗体。

热休克敏感性测定

为了检测雷公藤红素诱导的耐热性，将BY4741细胞重新悬浮在补充有50 mM Tris-HCl（pH 7.5）的SC培养基中，然后在30°C下不使用试剂、20μM雷公藤红素或二甲基亚砜处理1 h。治疗期结束后，将细胞稀释至OD600在无菌0.2-ml PCR试管中，在100μl中加入0.1。将稀释后的细胞在47°C的热循环器中进行0、5、10、15和20分钟的热休克。将等分样品在固体SC培养基上以等体积标记，并在30°C下培养2天。

转录谱分析

对含有HSE的对数BY4741细胞进行基因组转录谱分析-拉奇记者。报告质粒包括在本实验中，以确保充分的雷公藤红素和热休克介导的诱导。用于热休克实验的细胞被分成两个等量的细胞，并在热休克期间将其移至39°C 30分钟或保持在30°C。通过离心收集用于雷公藤红素/DMSO实验的细胞，并将其重新悬浮在添加50 mM Tris-HCl（pH 7.5）的最小培养基中。用10μM雷公藤红素或等量的二甲基亚砜处理细胞，并在30°C下培养1 h。在热休克和雷公藤红素处理后，通过离心收集细胞，并使用酸性酚玻璃珠提取程序分离总RNA(桑托罗，等。, 1998). 所有RNA标记和DNA微阵列操作均由位于达拉斯的德克萨斯大学西南医学中心微阵列核心设施执行(http://microray.swmed.edu). 该阵列由打印在玻片上的6219个酵母基因的重复集组成，并使用GenePix软件获得每个点的杂交值。每个基因的平均强度从每个重复的实验中重复获得，并从四个独立的点计算信号强度的复合平均值。复合平均诱导比表示为图2日志之后2转型。中显示的基因表1是不同基因群的代表性成员，其转录水平在热休克或雷公藤红素治疗后诱导了两倍或更多。计算所述基因家族的中位诱导率，以应对热休克或雷公藤红素治疗，并在补充表1中提供了具有各自基因表达变化的特定基因列表。主要数据集可通过基因表达综合总线访问(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo; 加入编号。GSE5608标准).

表1。

热休克与雷公藤红素诱导基因表达的比较

基因家族一中位数感应比b条
热冲击（1.0）塞拉斯托尔（0.9）
异种代谢和清除
    谷胱甘肽代谢酶2.25.7
        ECM4、GLO1、GLO4、GLR1、GSH1、GTT2、YJL068C
    芳醇脱氢酶15.6
        AAD3、AAD4、AAD6、AAD14、AAD15、AAD16
    其他假定的外源性氧化还原酶1.99.1
        ADH5、ADH6、ALD4、ALD6、BDH2、FRE7、GRE2、GOR1、OYE2、OYE3、YDL124W、YGL157W、YHB1、YML131S、YNL134C、YPR1、ZTA1
    出口泵1.45.8
        ATR1、FLR1、PDR5、PDR10、PDR15、PDR16、SNQ2、YCF1、YOR1
蛋白质折叠、加工和周转
    伴侣和共同伴侣6.24.9
        CPR1、CPR6、HSP26、HSP31、HSC82、HSP82、HSP104、PDI1、PHB1、PHB2、SBA1、SGT1、SSA1、SSA2、SSA4、SSE1
    蛋白质还原剂1.23.7
        AHP1、MXR1、TRX2
    蛋白质周转/蛋白酶体亚基的调节器23.1
        BLM10、CDC48、DDI1、DSK2、ECM29、LAP4、NPL4、OUT1、PIM1、PRD1、PRE2、PRE3、PRE4、PRE5、PRE6、PRE7、PRE10、PUP1、PUP2、PUP3、RPN1、RPN2、RPN3、RPN5、RPN6、RPN7、RPN8、RPN9、RPN11、RPN12、RPN13、RPT1、RPT3、RPT5、RPT6、SCL1、SHP1、UBA1、UBC5、UBI4、UBP6、UBX5、UF D1、UMP1、YME1

一 根据诱导率≥2.0选择基因。

b条 括号中显示了每个治疗的整体诱导中位数。

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Celastrol同时激活酵母中热休克和抗氧化基因的转录。野生型酵母的平行培养物未经处理（DMSO）或用10μM雷公藤红素处理1小时，或在39°C热休克30分钟。按照材料和方法计算每个基因的每个处理的平均诱导率，转换为对数2并绘制。标记在两种处理中表现出显著诱导的选定基因。

Yap1亚细胞定位

为了评估Yap1羧基末端氧化还原中心在雷公藤红素活化中的作用，我们使用了一个先前合成的结构，其中包括猴病毒40（SV40）核定位序列和融合到Yap1氧化还原调节域的绿色荧光蛋白（GFP）（Yap1-RDGFP公司由加利福尼亚大学戴维斯分校M.Wood善意提供）(木材等。, 2004). 为了检查Cys残基在Yap1核积累中的参与，使用QuikChange方案（Stratagene，La Jolla，CA）进行定点突变，以进行以下替换：C598A、 C类620A、 和C629T.为了获得C598620个A；C类629进行了T三重突变、多轮定点突变。对所有质粒进行测序以确认突变。质粒转化为BY4741并在缺乏尿嘧啶的培养基上生长。实验在对数相的细胞上进行，这些细胞被重新悬浮在用50 mM Tris（pH 7.4）缓冲的尿嘧啶缺乏液体培养基中。用300μM H培养5分钟2O（运行）2或10μM雷公藤红素和0.1%二甲基亚砜为20分钟。使用Axiover显微镜对细胞成像（德国Oberkochen卡尔蔡司）。

结果

Celastrol激活酵母中的Hsf1并增强对热应激的耐受性

为了了解雷公藤红素提供的细胞保护的一般机制，我们研究了在酿酒酵母对雷公藤红素治疗有反应。酵母Hsf1和哺乳动物Hsf1一样，在目标基因的启动子中特异性地识别称为热休克元件（HSE）的多聚体“nGAAn”重复序列(Sorger和Pelham，1987年). 携带Hsf1反应性HSE的野生型酵母菌株BY4741-拉奇用0至40μM浓度的雷公藤红素处理报告人1小时，并根据报告人构建物的活性生成剂量-反应曲线(图1A） ●●●●。欧盟委员会50从该试验中获得的浓度为7.5μM，与EC类似50在哺乳动物细胞中观察到3.0μM(韦斯特海德等。, 2004). 雷公藤红素治疗并没有诱导一个在HSE中具有多重突变的报告基因融合构建物，这证实了报告基因激活需要功能性HSE（数据未显示）(桑托罗等。, 1998). HSE入门-拉奇20μM雷公藤红素的报告物是标准热休克（37°C下30分钟）达到的水平的～40%，这表明雷公藤黄素在这些实验条件下比热休克对报告物的激活作用弱(图1B） ●●●●。

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Celastrol激活酵母Hsf1并诱导耐热性。（A） 包含HSE的野生型（BY4741）电池-拉奇用0至40μM浓度的雷公藤红素处理报告人1小时，并按照材料和方法（B）在控制温度（30℃，−）下培养与A中相同的细胞，在37℃下热休克1 h（HS），或暴露于二甲基亚砜或雷公藤红素（cel，20μM），并测定β-半乳糖苷酶活性。（C） W303型HSF1-塔盘暴露于正常生长温度（30℃）、热休克（39℃）、二甲基亚砜或10μM雷公藤红素的细胞在指定的时间点采集。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析分析蛋白质提取物，并使用针对蛋白A表位的抗体检测Hsf1-TAP。从正常生长条件下生长的W303细胞制备的提取物用作阴性对照（−）。（D） 将野生型（BY4741）细胞暴露于30℃、39℃、DMSO或20μM雷公藤红素中1h，并通过SDS-PAGE和免疫印迹分析蛋白提取物。使用检测酵母Hsp70的两种热休克诱导型同种型的多克隆抗体检测Ssa3/4水平。PGK水平被确定为负荷控制。（E） 野生型（BY4741）细胞在47°C下热休克前，用无试剂、DMSO或10μM雷公藤红素处理1小时，时间如所述材料和方法细胞在SC培养基上等体积地被发现，并在30°C下生长2d后测定其活力。

塞拉斯托尔刺激哺乳动物细胞中HSF1 DNA结合和过度磷酸化，这是激活热休克反应所需的事件(韦斯特海德等。, 2004). 这两个事件都以类似于热冲击的动力学发生。由于酵母Hsf1在无应激的情况下与许多含HSE的启动子组成性结合，我们选择检测雷公藤素介导的Hsf1活化是否产生与热休克反应类似的磷酸化状态变化(Sorger和Pelham，1988年). 为了测试这一点，一个野生型菌株（W303）包含一个基因组-TAP标记的等位基因高铁1号线是为了可视化磷酸化引起的迁移率变化而构建的。将Hsf1-TAP细胞暴露于热休克（HS）、雷公藤红素或二甲基亚砜（DMSO）处理，并在处理前、处理后15分钟以及1小时时间过程结束时采集细胞。免疫印迹分析检测Hsf1-TAP的迁移率。如所示图1C、 雷公藤红素在15分钟内诱导形成一种与热休克相当的Hsf1-TAP超磷酸化形式(Sorger和Pelham，1988年;Liu和Thiele，1996年). 单用二甲基亚砜治疗并没有导致磷酸化状态的可检测变化。两种处理均在1小时内观察到基础磷酸化水平的恢复，表明热休克和雷公藤红素表现出类似的衰减特征。

热休克反应中Hsf1调节基因的转录激活导致蛋白质伴侣水平的增加，而蛋白质伴侣是维持高温下细胞存活所必需的。酵母细胞在暴露于致命的热休克温度（>42°C）之前，在短时间内暴露于亚致死高温（37°C）下，其耐热性高于未处理的细胞，这在很大程度上取决于Hsf1的作用(尼托·索特洛等。, 1990;Sorger，1990年). 因此，我们评估了两种显著的热休克诱导的细胞溶质Hsp70伴侣的水平SSA3型和SSA4型基因(Boorstein和Craig，1990年). 野生型细胞未经处理或暴露于热休克、二甲基亚砜或雷公藤红素处理1h，通过免疫印迹分析蛋白质提取物。如所示图1D、 在控制条件下，Ssa3/4水平较低，由雷公藤红素诱导，但程度低于热休克（即，雷公藤红素诱导的Ssa3/4水平为密度测定法测定的热休克诱导水平的～65%）。由于雷公藤红素处理诱导了酵母中HSP的表达，因此我们推断，在致死性热休克之前进行处理将显著提高对热应激的抵抗力。为了验证这一假设，野生型细胞（BY4741）未经处理，用二甲基亚砜处理，或用雷公藤红素在30°C下处理1小时，然后暴露于47°C热休克0、5、10、15或20分钟。在固体培养基上发现每个培养物中的等效细胞数，然后在30°C下生长2 d后检测其生存能力(图1E） ●●●●。虽然未接受任何处理或二甲基亚砜处理的细胞在15分钟内的存活率显著降低（至少是菌落形成的10倍），但在热休克前的雷公藤红素处理在47°C下培养20分钟后，仍能保持存活。这些数据表明，酵母Hsf1与哺乳动物Hsf1一样，被雷公藤红素激活以增强抗应激能力，并提示雷公藤黄素介导的激活在不同真核生物中的保守机制。

雷公藤红素诱导热休克和氧化反应基因表达

我们的结果表明，雷公藤红素以类似于热休克的方式调节Hsf1活性。接下来，我们试图确定雷公藤红素调节的其他反应，以更全面地了解其细胞保护特性。我们通过比较暴露于热休克或雷公藤红素的酵母细胞的全球转录谱来解决这一问题。使用从未经处理、暴露于热休克、二甲基亚砜或10μM雷公藤红素的野生型细胞中分离的RNA进行全基因组转录物分析。在重复实验中平均每个基因的转录诱导率，并绘制成雷公藤红素诱导折叠与热休克诱导折叠的曲线。强诱导基因显示在图2中列出了由雷公藤红素诱导的更全面的基因家族表1诱导基因分为两大类：1）外源代谢/清除和2）蛋白质折叠、加工和周转。Celastrol和热休克通常诱导一组主要编码蛋白伴侣的基因。按中计算表1，一组16个已知的Hsf1靶点在热休克时表现出6.2倍的中位数诱导率，而雷公藤红素治疗导致4.9倍的增加(哈恩等。, 2004). 我们还注意到编码阵列中蛋白酶体成分的基因水平显著增加，这与之前的报告一致(哈恩等。, 2006). 此外，雷公藤红素增加了异生代谢中具有细胞作用的基因水平(图2和表1). 其中许多基因，包括编码蛋白质还原剂的基因，如TRX2型谷胱甘肽代谢酶，如GSH1型，芳醇脱氢酶（AADs）和多药耐药泵不是已知的Hsf1靶点，但它们是转录因子Yap1的靶点(杰米森等。, 1994;加斯赫等。2000年;Gasch和Werner-Washburne，2002年).

塞拉斯托尔通过其羧基末端结构域激活Yap1转录因子

因为我们的阵列研究表明雷公藤红素激活Yap1，并且该转录因子的激活机制已知，所以我们使用Yap1作为模型来进一步剖析雷公藤黄素的生物效应。Yap1包含两个c（c）半胱氨酸-第页脑出血d日结构域聚集成两个不同的氧化还原中心（n-CRD和c-CRD；图3A） 它对各种巯基修饰分子，包括氧化剂和电泳剂都有反应(科尔曼等。, 1999;公家等。, 2001;德劳奈等。2002年;阿兹维多等。, 2003;前田等。, 2004). 具体来说，通过H激活Yap12O（运行）2需要巯基过氧化物酶Gpx3/Orp1(德劳奈等。2002年)它涉及半胱氨酸303–598和310–629之间形成两个二硫键(德劳奈等。2000年;木材等。, 2003;冈崎等。, 2007). 因此，我们测试了Yap1是否被雷公藤红素激活，以及这种激活是否需要Gpx3通过转录拉奇包含Yap1响应元素的报告器(哈尔什曼等。, 1988). 野生型（BY4741）和gpx3型含有报告者的Δ细胞（ARE-拉奇)未经处理或用DMSO处理1小时，300μM h2O（运行）2或10μM雷公藤红素，随后检测其β-半乳糖苷酶活性。如所示图3B、 雷公藤红素治疗导致报告者大约6倍的活化，并且这种诱导独立于Gpx3发生。相反，H2O（运行）2在野生型细胞中诱导了报告基因，而在gpx3型Δ突变。

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Celastrol通过羧基末端结构域激活酵母氧化反应转录因子Yap1。（A） Yap1半胱氨酸残基参与氧化和烷基化的示意图。（B） 野生型（BY4741）和gpx3型含有Yap1报告基因（pCEP12）的Δ细胞用300μM H的无试剂处理2O（运行）2、二甲基亚砜或10μM雷公藤红素。如前所述，随后对采集的细胞进行β-半乳糖苷酶活性分析。（C） 表达TAP标记等位基因的细胞YAP1公司从内源性基因组位点生长到对数期并用DMSO处理，300μM H2O（运行）2或10μM雷公藤红素10分钟，然后进行三氯乙酸沉淀。细胞提取物在非还原性样品缓冲液中通过玻璃床裂解制备，在SDS-PAGE前未经处理（−DTT）或用10 mM DTT（+DTT）还原。使用抗蛋白A抗体检测Yap1迁移。指出了Yap1-TAP融合和DTT敏感的Yap1-TA·Gpx3异二聚体的位置。（D） 表达野生型或突变型GFP-Yap1调节域融合蛋白的细胞用DMSO处理，300μM H2O（运行）2或10μM雷公藤红素监测GFP亚细胞定位材料和方法卡通展示了c-CRD修饰前（通过任一途径）的弥散Yap1-GFP荧光，以及治疗后的核定位。在漫画中，酵母液泡由一个深灰色的圆圈表示。结果代表了三个独立的实验。

H诱导的瞬态Yap1-Gpx3复合物2O（运行）2可以通过非还原性SDS-PAGE检测(德劳奈等。2002年). 基于雷公藤红素在缺乏Gpx3的情况下对Yap1报告活性的刺激，我们预测雷公藤红素处理不会诱导分子间二硫化物的形成。表达Yap1整合TAP标记等位基因的细胞用DMSO处理，300μM H2O（运行）2或10μM雷公藤红素10分钟，然后在非还原性样品缓冲液中提取蛋白质。小时2O（运行）2如前所示，诱导形成一种缓慢迁移的物种，在二硫化物还原后消失(图3C） ●●●●。相反，雷公藤红素或二甲基亚砜的治疗并未诱导Yap1–Gpx3复合物的形成。这些数据表明，雷公藤红素与H2O（运行）2，展示了修饰羧基末端Gpx3非独立氧化还原中心而不形成畴间二硫键的其他巯基反应性化合物的轮廓。

在Yap1 CRDs内半胱氨酸残基修饰后，核输出受损，导致其核保留促进靶基因表达(公家等。, 1998;雁鸣声等。, 1998). 我们使用了一个先前生成的最小Yap1调节域构建，其中包含n-CRD、c-CRD、GFP和SV40核定位序列（Yap1-RDGFP公司)监测Yap1亚细胞定位对H的反应2O（运行）2和雷公藤红素(木材等。, 2004). 在处理表达野生型融合蛋白的酵母时，观察到雷公藤红素和H2O（运行）2，如所示图3D.然而，在C598突变为丙氨酸和C629突变为苏氨酸时，仅观察到雷公藤红素的核积累，这与不能形成两个结构域二硫化物中的任何一个一致。相反，Yap1中C620的突变允许H2O（运行）2-介导了核积累，但显著减少了雷公藤红素观察到的核积累量。含有所有三个羧基末端半胱氨酸突变（AAT）的Yap1报告者对雷公藤红素或H均无反应2O（运行）2当考虑到观察到的Gpx3的独立性时，这些结果表明雷公藤红素通过二硫依赖机制诱导Yap1，可能是通过c-CRD核输出序列内和附近的一个或多个半胱氨酸残基的直接烷基化。

雷公藤红素对哺乳动物细胞多个细胞保护基因的诱导

我们在酵母中的微阵列结果使我们假设，雷公藤红素除了激活有效的热休克反应外，还诱导了多个基因参与提供抗氧化损伤保护。确定雷公藤红素是否同时激活其他哺乳动物细胞保护反应，类似于酿酒酵母，我们检测了一些热休克反应和抗氧化反应调节的转录物。后一种反应由两种转录因子的作用控制，NF-E2相关因子-2（Nrf2）和激活转录因子4（Atf4）(他等。, 2001;哈丁等。, 2003;阮（Nguyen）等。, 2003). 将人结直肠癌（RKO）细胞暴露于递增剂量的雷公藤红素6小时，以监测HSF1、Nrf2和/或Atf4靶点的变化。在热休克基因中观察到剂量依赖性诱导热休克蛋白A6和DnaJA4号机组，血红素加氧酶-1（HO1），谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GCLM）的调节亚单位，胱氨酸转运体亚单位(x连续油管)以及生长停滞和DNA损伤诱导基因34（Gadd34）(图4A）(福尔纳切等。, 1989;梁等。, 1990;他等。, 2001;沙沙贵等。2002年;莱沃宁等。, 2004).

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塞拉斯托尔激活哺乳动物的抗氧化反应。（A） 从用指定剂量的雷公藤红素或二甲基亚砜载体处理的RKO细胞中分离出RNA，并按照材料和方法对所示转录物的cDNA进行PCR反应。18秒对RNA水平进行分析，以确定等负荷。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。（B） 用荧光素酶构建物转染RKO细胞20–24 h。用指示浓度的雷公藤红素处理细胞8 h，裂解细胞，检测萤火虫荧光素瘤酶活性，并用标准化的转染效率雷尼利亚荧光素酶活性。结果（平均值±标准偏差）来自三次重复细胞处理，是两个独立实验的代表。

为了确定HSF1、Nrf2和Atf4是否被雷公藤红素激活，我们使用了一个先前生成的报告文库，其中包含这些转录因子的结合位点（即分别为HSE、抗氧化反应元件[ARE]和营养敏感反应元件[NSRE]）调控荧光素酶表达的最小启动子上游的克隆(West和Marnett，2005年). 在用这些质粒瞬时转染RKO细胞的治疗中，我们发现雷公藤红素诱导每个转录因子的报告基因表达高于控制载体（pGL3-前体）(图4B） ●●●●。总之，这些结果表明，雷公藤红素在哺乳动物细胞中诱导氧化防御和热休克反应，就像在酵母中一样，并且它们表明雷公藤黄素促进HSF1、Nrf2和Atf4的同时激活。

雷公藤红素的生物效应受到游离硫醇的抑制

我们的结果表明雷公藤红素具有硫醇修饰分子的信号传导特征(加斯赫等。2000年;考斯顿等。, 2001). 如果雷公藤红素通过硫醇反应机制在细胞内发挥作用，那么过量的游离硫醇将阻止靶向修饰，从而降低其药理效力。因此，我们用10μM雷公藤红素（celastrol）处理含有HSE-lacZ（Hsf1）或ARE-lacZ（Yap1）报告子的酵母细胞，在50μM的浓度下加入或不加入还原剂DTT。结果表明，在我们的测定中，DTT显著阻断了雷公藤红素介导的两种反应的激活，而单独使用DTT没有效果(图5A） ●●●●。我们通过研究DTT在HeLa细胞中阻止celastrol介导的HSF活化的能力，扩展了这些结果热休克蛋白70.1-荧光素酶报告子(韦斯特海德等。, 2004). 用5μM雷公藤红素处理该细胞系，并在0至250μM的DTT浓度范围内培养。我们观察到，随着DTT浓度的增加，荧光素酶诱导受到剂量依赖性抑制，当DTT浓度超过约10倍时，抑制率为50%(图5B） ●●●●。同样，雷公藤红素与250μM DTT孵育后，RKO细胞中热休克反应和抗氧化反应诱导转录物的诱导减少(图5C） ●●●●。这些数据表明，DTT阻断了雷公藤红素在哺乳动物和酵母细胞中对两种不同应激途径的激活，这与雷公藤黄素与反应性硫醇相互作用以调节热休克和抗氧化反应的模型一致。

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雷公藤红素的生物效应被游离硫醇阻断。（A） 通过处理含有HSE的BY4741细胞，评估DTT对雷公藤红素介导的酵母Hsf1和Yap1诱导的影响-lacZ公司质粒或ARE-拉奇质粒（pCEP12）仅含有雷公藤红素（10μM），雷公藤红素（10µM）用DTT（50μM）预孵育5分钟，或指示的对照品培养1小时，然后进行β-半乳糖苷酶分析。结果显示为三个独立实验的SD平均值。（B） DTT抑制哺乳动物HSF雷公藤红素活化的功效通过融合萤火虫荧光素酶报告子和热休克蛋白70.1启动子片段。在细胞处理8小时之前，将塞拉斯托尔（5μM）与指定浓度的DTT混合30分钟，然后进行荧光素酶分析。（C） 对热休克反应和抗氧化反应诱导基因进行测试，以了解DTT对RKO细胞中雷公藤红素的影响。Celastrol（3μM）在细胞处理前与250μM DTT孵育1h。在RNA分离和转录分析之前，RKO细胞在指定的条件下培养6小时。结果代表了两个独立的实验。（D） 用糖皮质激素受体检测系统（p413GPD-rGR和pYRP-GRElacZ）转化的BY4741细胞按A所述处理，然后用10μM DOC或单独载体处理1.5 h。β-半乳糖苷酶活性按材料和方法.

最近，雷公藤红素被证实具有抑制核激素受体成熟和功能的能力，这一过程需要分子伴侣Hsp90(穆斯等。, 2006). 我们使用由大鼠糖皮质激素受体（GR）与携带糖皮质激素反应元件驱动β-半乳糖苷酶（GRE）的质粒组成的检测系统，检测雷公藤红素是否作为核激素受体反式激活的抑制剂-拉奇)（皮卡德，1990年）。用脱氧皮质酮（DOC，GR的合成激活剂）处理含有质粒的酵母1.5小时，在仅用二甲基亚砜处理的细胞中诱导6倍(图5D） ●●●●。相反，DOC暴露前用10μM雷公藤红素预处理1h，可阻断激素依赖性诱导。用雷公藤红素和五倍过量的DTT处理细胞时，没有观察到这种效果。总之，这些发现基于关键活性硫醇的修饰，为雷公藤红素在酵母和人类细胞中的作用模式提供了解释。

讨论

在这项研究中，我们试图阐明三萜类雷公藤红素在应激反应中提供细胞保护的机制。雷公藤红素激活Hsf1，促进分子伴侣表达，提高酵母和哺乳动物细胞在致命热休克时的生存能力，这一发现表明了一种高度保守的生化机制(图1). 此外，雷公藤红素能有效诱导酵母和哺乳动物细胞中参与外源性解毒的基因，作为抗氧化反应的一部分(图2和​和44和表1). 此响应位于酿酒酵母由转录因子Yap1调节，Yap1是一种核聚积蛋白，在其调节域中的特定半胱氨酸残基修饰后促进靶基因表达(图3). 雷公藤红素与游离硫醇的孵育可以阻止抗氧化反应、热休克反应和核激素受体功能的调节(图5)，表明该化合物具有硫醇反应机制。

各种氧化剂和电泳剂是热休克反应和抗氧化反应的有效诱导剂(森本和桑托罗，1998年;丁科瓦·科斯托娃等。, 2005). 虽然雷公藤红素不是一种直接的蛋白质氧化剂，但两个预测的亲电中心位于雷公藤黄素的a环和B环内(图6)其中，多个靶蛋白中的亲核氨基酸残基（例如半胱氨酸）可能会反应形成共价加合物(黄等。, 1998;杨等。, 2006). A环和B环中双键排列发生改变的雷公藤红素结构类似物缺乏这些反应中心，作为炎症信号的抑制剂，其药理作用较弱(他等。, 1998;黄等。, 1998). 此外，雷公藤红素与过量硫醇（例如DTT）的孵育会导致其在多种生物检测中失活(图5) (李等。, 2006). 因此，这些结果表明，雷公藤红素A环和B环的亲电特性通过修饰半胱氨酸残基上的许多蛋白质改变了酵母和哺乳动物细胞的信号反应。

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雷公藤红素介导的细胞适应和细胞保护模型。雷公藤红的环由斜体大写字母（A–E）标识，详细描述见讨论Celastrol治疗可以激活热休克和抗氧化途径，导致一些细胞保护基因的表达增加。

雷公藤红素在酵母和哺乳动物细胞中诱导热休克反应的机制仍有待研究，它可能包括通过靶向一个或多个分子伴侣和蛋白酶体中的半胱氨酸残基，使参与蛋白质折叠和周转的几种蛋白质复合体失活。分子伴侣机制或蛋白酶体失活可促进Hsf1活化并增加Hsp水平(韦斯特海德和森本茂，2005年). 为了支持这一推理，雷公藤红素诱导的基因表达谱与化学遗传筛选中报道的Hsp90抑制剂的基因表达图谱相似(穆斯等。, 2006)并在酵母中对Hsp90客户GR进行功能性灭活(图5D） ●●●●。这些结果表明，雷公藤红素对Hsp90伴侣活性有显著影响，尽管抑制Hsp90的确切生化机制尚不清楚。一些蛋白质组学研究已确定Hsp90和其他分子伴侣（例如，Hsp70，肽基脯氨酸异构酶）是半胱氨酸修饰剂的靶点，这些分子在体外复性分析中使Hsp90与Hsp70失活(碳纤维等。, 2004,2005). 总之，这些发现表明，雷公藤红素及其相关分子可能使多个分子伴侣失活。此外，雷公藤红素促进多泛素化蛋白的积累并抑制蛋白酶体功能，特别是通过灭活其糜蛋白酶样活性(杨等。, 2006). 雷公藤红素可能通过修饰参与蛋白质折叠和清除的多种蛋白质中的半胱氨酸残基来促进Hsf1活化。

为了探索雷公藤红素对氧化防御基因的调控，我们将重点放在Yap1上，因为它是由半胱氨酸修饰剂直接调控的。当暴露于氧化剂或电泳剂时，Yap1积聚在细胞核中，在那里它促进参与外源性解毒和输出的多个基因的表达，包括TRX2型,5菲律宾第纳尔,序号Q2,FLR1（飞行高度层1）,YCF1型、和自动液位计1(库格和琼斯，1994年;威米等。, 1994;宫城县等。, 1996;阿拉科等。, 1997;科尔曼等。, 1997;公家等。, 1997). 在我们的微阵列实验中，所有这些基因都是由雷公藤红素强烈诱导的(表1). 氧化剂和电泳剂通过修饰核输出序列内或附近的半胱氨酸促进Yap1核保留和活性。使用雷公藤红素，我们观察到Yap1在GPX3系列-核聚积所需的C-末端半胱氨酸残基与H氧化所涉及的残基有很大不同2O（运行）2(图3). 总之，我们的结果表明，雷公藤红素通过羧基末端结构域内一个或多个半胱氨酸残基的直接内合而不是通过氧化来调节Yap1。

在酵母和哺乳动物细胞中，全球基因表达谱实验表明雷公藤红素诱导两个关键的转录调控子(图2) (穆斯等。, 2006). 这些基因受多种转录因子调控，包括Hsf1和Yap1酿酒酵母哺乳动物细胞中的HSF1、Nrf2和Atf4。因此，我们提出了雷公藤红素激活这些转录因子的模型；促进参与解毒和反应性物种输出、蛋白质折叠和蛋白质周转的基因表达；并为应对进一步的环境挑战提供保护(图6). 由于这些基因中的许多具有基本的细胞保护作用，雷公藤红素和相关分子通过修饰靶蛋白中的半胱氨酸来诱导适应性反应是一个很有前途的治疗探索领域，可以预防或改善多种疾病的影响，包括心血管疾病、癌症、，和蛋白质聚集障碍。

补充材料

【补充资料】

致谢

我们感谢德克萨斯大学西南微阵列设施的Anwou Zhou博士提供的卓越技术援助，感谢Ambro van Hoof博士提供的TAP-tag质粒，感谢Elizabeth Craig博士提供的抗Ssa3/4抗体，感谢Scott Moye-Rowley博士提供的ARE-lacZ报告质粒。我们还感谢Matthew Wood博士提供Yap1调控域报告构建，以及Eric Weiss博士的实验室协助酵母成像实验。这项工作得到了美国癌症学会研究学者拨款MBC-103134和国家普通医学研究所拨款GM-074696（给K.A.M.）和国家神经疾病和中风研究所拨款NS-047331（给R.B.S.和R.I.M.）的支持。J.D.W.获得了美国国立卫生研究院国家研究服务奖F32 GM-078965的支持。

使用的缩写：

AAD公司芳醇脱氢酶
是抗氧化反应元件
附件4激活转录因子4
客户需求日富含半胱氨酸结构域
文件脱氧皮质酮
二甲基亚砜二甲基亚砜
DTT公司二硫苏糖醇
GFP公司绿色荧光蛋白
像素3谷胱甘肽过氧化物酶3
希腊糖皮质激素受体
健康、安全与环境热冲击元件
高铁1号线热休克转录因子1
热休克蛋白热休克蛋白
高铁热冲击响应
编号2NF-E2相关因子-2
PGK公司磷酸甘油酸激酶
TAP接头串联亲和纯化
Yap1号机组酵母AP-1。

脚注

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E07-10-1004)2008年1月16日。

参考文献

  • 雅培A.神经学家在药物筛选工作中取得了成功。自然。2002;417：109。[公共医学][谷歌学者]
  • Alarco A.M.、Balan I.、Talibi D.、Mainville N.、Raymond M.AP1介导的多药耐药性酿酒酵母要求FLR1（飞行高度层1）编码主要促进剂超家族的转运体。生物学杂志。化学。1997;272:19304–19313.[公共医学][谷歌学者]
  • Azevedo D.、Tacnet F.、Delaunay A.、Rodrigues-Pousada C.、Toledano M.B.，H在Yap1内的两个氧化还原中心2O（运行）2和巯基反应性化学物质信号。自由基。生物医学。2003;35:889–900.[公共医学][谷歌学者]
  • Bagatell R.、Paine Murrieta G.D.、Taylor C.W.、Pulcini E.J.、Akinaga S.、Benjamin I.J.、Whitesell L.。热休克因子1依赖性应激反应的诱导改变hsp90结合剂的细胞毒性活性。临床。癌症研究。2000;6:3312–3318.[公共医学][谷歌学者]
  • Boorstein W.R.，Craig E.A.的转录调控SSA3型，HSP70基因来自酿酒酵母.分子细胞。生物。1990;10:3262–3267. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Carbone D.L.、Doorn J.A.、Kiebler Z.、Ickes B.R.、Petersen D.R.在慢性酒精性肝病大鼠模型中用4-羟基壬醛修饰热休克蛋白90。《药理学杂志》。实验治疗师。2005;315:8–15.[公共医学][谷歌学者]
  • Carbone D.L.、Doorn J.A.、Kiebler Z.、Sampey B.P.、Petersen D.R.通过4-羟基-2-壬醛抑制Hsp72介导的蛋白质折叠。化学。研究毒物。2004;17:1459–1467. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Causton H.C.、Ren B.、Koh S.S.、Harbison C.T.、Kanin E.、Jennings E.G.、Lee T.I.、True H.L.、Lander E.S.、Young R.A.根据环境变化重塑酵母基因组表达。分子生物学。单元格。2001;12:323–337. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Christians E.S.、Yan L.J.、Benjamin I.J.热休克因子1和热休克蛋白：防止急性细胞损伤的关键合作伙伴。批评。护理医学。2002;30：S43–S50。[公共医学][谷歌学者]
  • Cleren C.、Calingasan N.Y.、Chen J.、Beal M.F.Celastrol可预防MPTP和3-硝基丙酸诱导的神经毒性。神经化学杂志。2005;94:995–1004.[公共医学][谷歌学者]
  • Coleman S.T.、Epping E.A.、Steggeda S.M.、Moye-Rowley W.S.Yap1p以氧化剂特异的方式激活基因转录。分子细胞。生物。1999;19:8302–8313. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Coleman S.T.、Tseng E.、Moye-Rowley W.S.酿酒酵母基本区域-亮氨酸拉链蛋白调节网络在自动液位计1结构基因。生物学杂志。化学。1997;272：23224–23230。[公共医学][谷歌学者]
  • Corson T.W.，Crews C.M.《传统药物的分子理解和现代应用：胜利与试验》。单元格。2007;130:769–774. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Delaunay A.、Isnard A.D.、Toledano M.B.H2O（运行）2通过Yap1转录因子的氧化进行感应。EMBO J。2000;19:5157–5166. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Delaunay A.、Pflieger D.、Barrault M.B.、Vinh J.、Toledano M.B.。硫醇过氧化物酶是一种H2O（运行）2受体和氧化还原转换器在基因激活中的作用。单元格。2002;111:471–481.[公共医学][谷歌学者]
  • Dinkova-Kostova A.T.、Holtzclaw W.D.、Kensler T.W.Keap1在细胞保护反应中的作用。化学。研究毒物。2005;18:1779–1791.[公共医学][谷歌学者]
  • Fornace A.J.，Jr，Nebert D.W.，Hollander M.C.，Luethy J.D.，Papathanasiou M.，Fargoli J.，Holbrook N.J.哺乳动物基因由生长停滞信号和DNA损伤剂协调调节。分子细胞。生物。1989;9:4196–4203. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gasch A.P.、Spellman P.T.、Kao C.M.、Carmel-Harel O.、Eisen M.B.、Storz G.、Botstein D.、Brown P.O.酵母细胞对环境变化响应的基因组表达程序。分子生物学。单元格。2000;11:4241–4257. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gasch A.P.、Werner-Washburne M.《酵母对环境压力和饥饿反应的基因组学》。功能。集成。基因组学。2002;2:181–192.[公共医学][谷歌学者]
  • Hahn J.S.、Hu Z.、Thiele D.J.、Iyer V.R.通过热休克转录因子对应激反应生物学进行全基因组分析。分子细胞。生物。2004;24：5249–5256。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hahn J.S.、Neef D.W.、Thiele D.J.酵母热休克转录因子介导的蛋白酶体表达协同激活的应激调节网络。微生物摩尔数。2006;60:240–251.[公共医学][谷歌学者]
  • Harding H.P.等人。综合应激反应调节氨基酸代谢和抗氧化应激。分子细胞。2003;11:619–633.[公共医学][谷歌学者]
  • Harshman K.D.、Moye-Rowley W.S.、Parker C.S.酵母中SV40 AP-1识别元件的转录激活是由一种与GCN4不同的类似AP-1的因子介导的。单元格。1988;53:321–330.[公共医学][谷歌学者]
  • He C.H.，Gong P.，Hu B.，Stewart D.，Choi M.E.，Chio A.M.，Alam J.作为Nrf2相互作用蛋白的激活转录因子4（ATF4）的鉴定。血红素氧化酶-1基因调控的意义。生物学杂志。化学。2001;276:20858–20865.[公共医学][谷歌学者]
  • He W.，Huang F.C.，Gavai A.，Chan W.K.，Amato G.，Yu K.T.，Zilberstein A.新型细胞因子释放抑制剂。第三部分：雷公藤红素截短类似物。生物有机医药化学。莱特。1998;8:3659–3664.[公共医学][谷歌学者]
  • Heemskerk J.、Tobin A.J.、Bain L.J.教授新药新招。神经变性药物筛选联合会会议，2002年4月7日至8日，美国华盛顿特区。《神经科学趋势》。2002;25:494–496.[公共医学][谷歌学者]
  • Hieronymus H.等。基于基因表达信号的化学基因组预测确定了一类新的HSP90通路调节剂。癌细胞。2006;10:321–330.[公共医学][谷歌学者]
  • Hightower L.E.将培养的动物细胞暴露于氨基酸类似物或嘌呤霉素中，可快速合成几种多肽。《细胞生理学杂志》。1980;102:407–427.[公共医学][谷歌学者]
  • Holmberg C.I.、Illman S.A.、Kallio M.、Mikhailov A.、Sistonen L.核HSF1颗粒的形成因应激刺激而异。细胞应激伴侣。2000;5:219–228. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Huang F.C.，Chan W.K.，Moriarty K.J.，Zhang D.C.，Chang M.N.，He W.，Yu K.T.，Zilberstein A.新型细胞因子释放抑制剂。第一部分：三萜类。生物有机医药化学。莱特。1998;8：1883年至1886年。[公共医学][谷歌学者]
  • Jamieson D.J.、Rivers S.L.、Stephen D.W.分析酿酒酵母过氧化物和超氧化物胁迫诱导的蛋白质。微生物学。1994;140:3277–3283.[公共医学][谷歌学者]
  • Jurivich D.A.、Sistonen L.、Kroes R.A.、Morimoto R.水杨酸钠对人体热休克反应的影响。科学。1992;255:1243–1245.[公共医学][谷歌学者]
  • Kuge S.、Arita M.、Murayama A.、Maeta K.、Izawa S.、Inoue Y.、Nomoto A.酵母Yap1p核输出信号的调节是由氧化还原信号诱导的可逆二硫键形成介导的。分子细胞。生物。2001;21:6139–6150. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kuge S.，Jones N.YAP1依赖性激活TRX2型对于酿酒酵母通过过氧化氢氧化应激。EMBO J。1994;13:655–664. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kuge S.、Jones N.、Nomoto A.氧化应激对yAP-1核定位的调节。EMBO J。1997;16:1710–1720. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kuge S.、Toda T.、Iizuka N.、Nomoto A.Crm1（XpoI）依赖于萌发酵母转录因子yAP-1的核输出对氧化应激敏感。基因细胞。1998;三：521–532。[公共医学][谷歌学者]
  • Lee B.S.、Chen J.、Angelidis C.、Jurivich D.A.、Morimoto R.I.通过抗炎药物对热休克因子1的药理调节可防止应激诱导的细胞损伤。程序。国家。阿卡德。科学。美国。1995;92:7207–7211. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lee J.H.、Koo T.H.、Yoon H.、Jung H.S.、Jin H.Z.、Lee K.、Hong Y.S.、Lee J.J.通过雷公藤醇（一种醌甲基三萜类化合物）靶向IκB激酶抑制NF-κB活化。生物化学。药理学。2006;72:1311–1321.[公共医学][谷歌学者]
  • Leung T.K.、Rajendran M.Y.、Monfries C.、Hall C.、Lim L.人类热休克蛋白家族。新型热诱导性HSP70（HSP70B’）的表达及其cDNA和基因组DNA的分离。生物化学。J。1990;267:125–132. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Levonen A.L.、Landar A.、Ramachandran A.、Ceaser E.K.、Dickinson D.A.、Zanoni G.、Morrow J.D.、Darley-Usmar V.M.氧化还原细胞信号的细胞机制：半胱氨酸修饰在控制抗氧化防御反应中对亲电脂质氧化产物的作用。生物化学。J。2004;378:373–382. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Liu X.-D.，Thiele D.J.氧化应激诱导热休克因子磷酸化和HSF依赖性激活酵母金属硫蛋白基因转录。基因发育。1996;10:592–603.[公共医学][谷歌学者]
  • Maeta K.、Izawa S.、Okazaki S.、Kuge S.、Inoue Y酿酒酵母由糖酵解产生的代谢产物甲基乙二醛调节。分子细胞。生物。2004;24:8753–8764. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • McMillan D.R.、Xiao X.、Shao L.、Graves K.、Benjamin I.J.热休克转录因子1的靶向破坏可消除耐热性和防止热诱导凋亡。生物学杂志。化学。1998;273:7523–7528.[公共医学][谷歌学者]
  • Miyahara K.、Hirata D.、Miyakawa T.yAP-1-和yAP-2-介导的热休克诱导多药耐药ABC转运体基因转录激活酿酒酵母.货币。遗传学。1996;29:103–105.[公共医学][谷歌学者]
  • Morano K.A.、Santoro N.、Koch K.A.和Thiele D.J.A反式-酵母热休克转录因子中的激活域对应激过程中的细胞周期进展至关重要。分子细胞。生物。1999;19:402–411. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Morano K.A.、Thiele D.J.热休克因子对细胞应激、生长和分化信号的功能和调节。基因表达。1999年a；7:271–282. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Morano K.A.，Thiele D.J.Sch9蛋白激酶调节体内Hsp90伴侣复合体的信号转导活性。EMBO J。1999年b；18:5953–5962. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Morimoto R.I.，Santoro M.G.应激诱导反应和热休克蛋白：细胞保护的新药理学靶点。自然生物技术。1998;16:833–838.[公共医学][谷歌学者]
  • Nagai N.、Nakai A.、Nagata K.槲皮素通过下调HSF1抑制热休克反应。生物化学。生物物理学。Res.Commun公司。1995;208:1099–1105.[公共医学][谷歌学者]
  • Nguyen T.、Sherrat P.J.、Pickett C.B.控制抗氧化反应元件介导的基因表达的调控机制。每年。药理学修订版。毒物。2003;43:233–260.[公共医学][谷歌学者]
  • Nieto-Sotelo J.、Wiederrecht G.、Okuda A.、Parker C.S.。酵母热休克转录因子包含一个转录激活域，其活性在非休克条件下受到抑制。单元格。1990;62:807–817.[公共医学][谷歌学者]
  • Okazaki S.、Tachibana T.、Naganuma A.、Mano N.、Kuge S.Yap1中的多步二硫键形成是H的传感和转导所必需的2O（运行）2压力信号。分子细胞。2007;27:675–688.[公共医学][谷歌学者]
  • Ooi C.E.、Rabinovich E.、Dancis A.、Bonifacino J.S.、Klausner R.D.铜依赖性降解酿酒酵母血浆铜转运蛋白Ctr1p在明显缺乏内吞作用时。EMBO J。1996;15：3515–3523。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Puig O.，Rutz B.，Luukkonen B.G.，Kandels-Lewis S.，Bragado-Nilsson E.，Seraphin B.酵母中高效PCR-基因操作的新结构和策略。酵母。1998;14:1139–1146.[公共医学][谷歌学者]
  • Santoro N.、Johansson N.、Thiele D.J.热休克元件结构是热休克转录因子的温度和反式激活域需求的重要决定因素。分子细胞。生物。1998;18:6340–6352. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sasaki H.、Sato H.、Kuriyama-Matsumura K.、Sato K.、Maebara K.、Wang H.、Tamba M.、Itoh K.、Yamamoto M.、Bannai S.亲电反应元件介导的胱氨酸/谷氨酸交换转运体基因表达诱导。生物学杂志。化学。2002;277:44765–44771.[公共医学][谷歌学者]
  • Sethi G.，Ahn K.S.，Pandey M.K.，Aggarwal B.Celastrol，一种新的三萜类化合物，通过抑制NF-κB调节的基因产物和TAK1介导的NFκB活化，增强TNF诱导的凋亡并抑制肿瘤细胞的侵袭。鲜血。2007;109:2727–2735.[公共医学][谷歌学者]
  • Sorger P.K.酵母热休克因子包含可分离的瞬时和持续反应转录激活因子。单元格。1990;62:793–805.[公共医学][谷歌学者]
  • Sorger P.K.，Pelham H.R.酵母中一种热休克元素结合蛋白的纯化和表征。EMBO J。1987;6:3035–3041. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sorger P.K.，Pelham H.R.B.酵母热休克因子是一种必需的DNA结合蛋白，表现出温度依赖性磷酸化。单元格。1988;54:855–864.[公共医学][谷歌学者]
  • Wemmie J.A.、Szczypka M.S.、Thiele D.J.、Moye-Rowley W.S.酵母AP-1蛋白介导的镉耐受需要存在ATP-结合盒转运体编码基因YCF1。生物学杂志。化学。1994;269:32592–32597.[公共医学][谷歌学者]
  • West J.D.、Marnett L.J.脂质过氧化产物4-羟基-2-壬醛诱导的基因表达变化。化学。研究毒物。2005;18:1642–1653.[公共医学][谷歌学者]
  • Westerheide S.D.、Bosman J.D.、Mbadugha B.N.、Kawahara T.L.、Matsumoto G.、Kim S.、Gu W.、Devlin J.P.、Silverman R.B.、Morimoto R.I.Celastrols作为热休克反应和细胞保护的诱导剂。生物学杂志。化学。2004;279:56053–56060.[公共医学][谷歌学者]
  • Westerheide S.D.、Kawahara T.L.、Orton K.、Morimoto R.I.雷公藤内酯醇，一种增强应激诱导细胞死亡的人体热休克反应抑制剂。生物学杂志。化学。2006;281:9616–9622.[公共医学][谷歌学者]
  • Westerheide S.D.、Morimoto R.I.热休克反应调节剂作为蛋白质构象疾病的治疗工具。生物学杂志。化学。2005;280：33097–33100。[公共医学][谷歌学者]
  • Wood M.J.、Andrade E.C.、Storz G.Yap1p转录因子的氧化还原域包含两个二硫键。生物化学。2003;42:11982–11991.[公共医学][谷歌学者]
  • Wood M.J.，Storz G.，Tjandra N.Yap1转录因子定位氧化还原调节的结构基础。自然。2004;430:917–921.[公共医学][谷歌学者]
  • Yan C.、Lee L.H.、Davis L.I.Crm1p介导酵母AP-1样转录因子的调控核输出。EMBO J。1998;17：7416–7429。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 杨浩、陈丹、崔庆春、袁欣、窦庆平、塞拉斯托尔是一种从中国“神藤之雷”中提取的三萜，是一种有效的蛋白酶体抑制剂，可抑制裸鼠前列腺癌的生长。癌症研究。2006;66:4758–4765.[公共医学][谷歌学者]
文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会