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基因表达模式。作者手稿；PMC 2009年2月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
基因表达模式。2008年2月；8(3): 155–160.
2007年11月17日在线发布。 doi（操作界面）：2016年10月10日/j.gep.2007.11.001
预防性维修识别码：262948下午
美国国立卫生研究院：NIHMS41105标准
PMID：18077221

动态基因表达林-28小鼠和鸡胚胎发育期间

横山智治,a、，b条 桥本美美,一 清水裕仁,一 上野裕久,一 肯塔·乌奇贝,a、，c（c） 木村一郎,b条和麻原浩司a、，日期：，*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

这个秀丽隐杆线虫异时性基因第28行调节线虫主干的发育时间。我们报告了林-28小鼠和鸡胚胎中的同源物。整个底座就地杂交揭示了林-28在发育中的小鼠和鸡肢芽中。鼠标林-28在E9.5时，前肢和后肢均检测到表达，但在E10.5时前肢消失，最后在E11.5时前肢和后肢消失。鸡肉林28，在第15/16期首次在肢体原基中检测到，随着时间的推移也被下调。小鼠和鸡的氨基酸序列林-28基因高度保守林-28在小鼠和鸡的肢体发育过程中，表明这一异慢性基因在脊椎动物肢体发育期间也保持不变。

关键词：异慢性基因，全量就地杂交，小鼠，小鸡，肢芽，林-28、MicroRNAs、发育时间、动态表达、胚胎

1.结果和讨论

胚胎发育受到时空基因表达的严格调控；然而，调节发育时间的系统在很大程度上是未知的。利用线虫进行的一系列诱变研究秀丽隐杆线虫作为一个模型，已经确定了一组基因，即所谓的“异慢性基因”，它在胚胎发生的特定时间段表达，在决定发育事件的相对时间方面起着关键作用(安布罗斯和霍维茨，1984年;Lee等人，1993年). 在这些异慢性基因中，第28行参与特定的发育事件，在线虫的四个幼虫阶段中的第二个阶段观察到(Moss等人，1997年). 还应注意的是第28行受林-4，编码microRNA的异慢性基因之一(Moss等人，1997年). 这些研究证明了非编码RNA通过转录后控制在发育中的关键作用。

林-28在不同物种中保存良好，编码一个约25kDa的蛋白质，带有RNA-结合基序和一个“冷休克”域（CSD）(Moss等人，1997年). 人类林-28在胚胎干细胞中表达(Richards等人，2004年)用免疫组织化学方法在胚胎的各种组织中也检测到小鼠Lin-28蛋白(Yang和Moss，2003年). 重要的是林-28随着发育的进行，下调或局限于有限数量的组织。例如，Lin-28蛋白在发育中的支气管上皮中表达，在成人支气管组织中消失。此外，它在成人肠道的隐窝/绒毛细胞中下调。这些结果表明林-28作为一个异慢性基因秀丽线虫在哺乳动物中是保守的。

为了进一步研究林-28在胚胎发育过程中，我们完成了整群就地利用小鼠和鸡不同发育阶段的胚胎进行杂交。

尽管林-28在E9.5时在整个小鼠胚胎中普遍表达(图1a，a′)，在前肢和后肢芽顶部外胚层嵴（AER）附近的最远端间质中观察到强烈表达(图1b，b′，白色箭头）。有趣的是，在E10.5林-28前肢几乎消失，表达仅限于后肢和后肢水平的更多尾干(图1c–e). 在后肢的横切面上，林-28在AER下方的远端间质中表达(图1d′)以及E9.5。我们还检测到林-28在神经管里(图1e)、间脑、中脑(图1f)和眼原基(图1f)在E10.5中。E11.5时，在神经管中检测到表达(图1g和h)在眼睛里(图1g)却从后肢消失了(图1g和h).

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的表达模式林-28发育中的小鼠胚胎（a–b′）林-28在E9.5普遍表达，在前肢和后肢芽、眼睛、耳泡（a）、间脑、中脑和后脑（a′）、鳃弓和神经管（b）中强烈表达。（b′）b.（c–f）后肢水平的横切面在E10.5时，前肢（c）的表达减少，但后肢（d，d′）、背根神经节（d，白箭头）和神经管（e，黑箭头）的表达保持不变。眼睛、间脑和中脑也是林-28在这个阶段（f）为阳性。（g和h）在E11.5，Lin-28的表达主要在前肢和后肢中消失（后肢中轻微检测到）。眼睛和神经管的顶端边缘仍然被染色。所有面板显示在顶部前面。棒材，200μ米（b′，d′），1毫米（a，a′，b，c，d，e，f，g，h）。缩写：FL，前肢；HL，后肢；ot，耳泡；di，间脑；mes，中脑；met，中脑；DRG，背根神经节；nt，神经管；AER，顶外胚层嵴。

的表达式林-28在发育中的肢体中，芽尤其有趣，因为它在前肢和后肢中有不同的表达。此外，已知只有少数基因以前肢或后肢特异的方式表达。例如，T-box转录因子(Tbx公司)基因，Tbx5，在前肢特别表达，而Tbx4中，成对的类同源结构域转录因子基因，坑x1，和同源盒基因Hoxc9，c10，和c11，只在后肢表达。要比较林-28(图2E)利用其他前肢或后肢特异性基因，我们也完成了整个坐骑就地杂交检测Tbx5型(图2A),Tbx4型(图2B),坑x1(图2C)和霍克斯10(图2D)成绩单。很明显林-28与其他前肢或后肢特异性基因不同，随着发育的进行，这些基因会发生显著变化，这些基因在整个发育阶段都持续存在于前肢或后肢。

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动态林-28小鼠肢芽全坐骑mRNA的表达就地杂交检测Tbx5型（A） ，Tbx4型（B） ，坑1（C） ，霍克斯10（D） 、和林-28（E） 用小鼠E9.5、10.5、11.5胚胎进行mRNA检测。前肢（FL）和后肢（HL）的背视图随发育阶段而显示。星号表示肢芽中的表达。（A）Tbx5型表达仅限于前肢。（B） 相比之下，Tbx4型信使核糖核酸主要在后肢检测到，但在前肢没有检测到。坑1（C） 和霍克斯10（D） 表达也只在后肢检测到。林-28首先在前肢和后肢检测到表达（E9.5）；然而，前肢（E10.5）和后肢（E11.5）的表达减弱。在每个面板中，从背面观察肢体，从前面到顶部，从后面到底部。肢体表情模式的示意图如右侧所示。棒材，500μ米。

要检查此动态表达式模式是否林-28在脊椎动物胚胎中是保守的就地利用鸡胚进行杂交(图3). 如所示表1鸡Lin-28和小鼠Lin-28（蓝盒）的氨基酸序列比对表明，这两种蛋白质高度同源。此外，CSD（下划线）和逆转录病毒型CCHC锌指基序（星号）在鸡、小鼠和秀丽线虫Lin-28蛋白(莫斯和唐，2003).

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鸡的表达模式林-28不同阶段（a–c）鸡肉林-28在15/16期胚胎中普遍表达。在假定的肢体原基中也检测到强表达（b，c；a，b′增大；b的横切面）。（d–h）林-28信使核糖核酸从喙干和前肢略微消失（e，f；d增大），但在后肢（f，白色箭头，f′；f的横截面）和PSM（f，白色箭头，f〃；f的白色箭头截面）中仍可检测到。在此阶段，还观察到耳泡（g，黑色箭头）、视网膜（g，白色箭头）、鳃弓、中脑和菱形边界（h，白色箭头林-28从身体上消失，但在PSM（j，黑色箭头）、DRG（j，白色箭头）和后肢后部（白色箭头）（k，i）可见微弱的表达林-2821、24期未检测到躯干、前肢和后肢的表达。棒材，200μ米（b′，f′，f〃），1毫米（a–f，g–l）。缩写：FL，前肢；HL，后肢；PSM，眼前中胚层；mes，中脑；ot，耳囊泡；胸罩，鳃弓；视网膜；r1～7，菱形1～7；DRG，背根神经节。

表1

小鼠、鸡和秀丽线虫Lin-28同源物

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使用Clustal W方法进行分析。同源残基用灰色阴影表示。黑色条表示“cold-shock”DNA-binding域。星号表示一对CCHC锌指图案。注意，小鼠和鸡的Lin-28氨基酸序列高度保守（灰色和蓝色）。接入号码：鼠标[肌肉]林-28（209aa）：NP_665832号，鸡肉[五倍子]林-28（202aa）：NP_001026944号,秀丽线虫[秀丽隐杆线虫]林-28（227 aa）：AAC47476型.

在第15/16阶段，林-28无处不在(图3a)在鸡胚中，推定前肢有强烈表达(图3b，b′箭头）和后肢(图3C箭头）区域，与E9.5小鼠胚胎中观察到的模式相似（参见。图1a，a′). 虽然这种普遍存在的表达在嘴侧体上减少了(图3d)和前肢(图3e)在17/18岁左右，包括后肢表达在内的尾部表达仍然可以检测到(图3f). 在这个阶段，林-28在后肢间质中仍弱表达(图3f′arrow）并在前中胚层强烈表达(图3f，f〃箭头）、中脑、视网膜、鳃弓、耳囊(图3g)和菱形边界(图3h，白色箭头）。在第20阶段，林-28前肢和后肢的表达消失(图3i和j)但在背根神经节仍能检测到(图3j). 第21阶段(图3k)和阶段24(图3l),林-28未在肢芽中检测到就地杂交。

Yang和Moss（2003）用免疫组织化学方法检测小鼠组织切片中Lin-28蛋白的定位(Yang和Moss 2003). 他们发现，在发育早期，Lin-28蛋白强烈定位于许多组织的上皮细胞中，在发育后期，Lin-29蛋白定位于肌肉中。此外，他们还表明，Lin-28最初在不同组织中广泛高水平表达，但随着分化的进行，在许多组织中表达下调(Yang和Moss 2003;Polesskaya等人，2007年). 最近在体外研究表明，在骨骼肌成肌细胞和胚胎癌细胞系P19中，Lin-28与多聚体结合，从而提高IGF-2蛋白合成的效率，而IGF-2蛋白合成对肌肉组织的生长和分化至关重要(Polesskaya等人，2007年).

Yang和Moss揭示，总的来说，Lin-28蛋白在早期发育时定位于上皮细胞，而我们检测到，至少在肢芽中林-28mRNA在E9.5和10.5的远端间质中表达(图1b′和d′）。对于当前研究中观察到的mRNA表达与Yang和Moss描述的蛋白质定位之间的差异，一个可能的解释是林-28在转录后由微RNA调节，如线-4和let-7(Moss等人，1997年;Reinhart等人，2000年;Moss和Tang，2003年). 在这方面，应该指出，另一个秀丽线虫异慢性基因，林-41，它还包含互补的结合位点线-4和let-7采用3′UTR风格林28，当上游microRNA基因let-7被下调(Schulman等人，2005年;Mansfield等人，2004年).Schulman等人（2005）Northern杂交分析也证明林-41mRNA在发育过程中被下调，而上游基因，miR-125型（哺乳动物线-4正交），被上调(Schulman等人，2005年). 迄今为止，没有功能数据表明异慢性基因的分子网络，包括林-28，let-7和林-41，在脊椎动物中是保守的；然而，这些基因在发育中的小鼠肢芽中的动态表达可能表明这些基因在肢体发育中具有潜在作用。

脊椎动物成对肢体的生长依赖于间充质细胞和上皮细胞之间的相互作用，主要由成纤维细胞生长因子（FGF）信号介导。预期肢体区侧板中胚层细胞表达Fgf10，这导致Fgf8型在邻近的上皮组织中。这个Fgf8型-表达上皮发育成正常肢体生长所需的增厚结构，位于背腹边界（AER）(Ohuchi等人，1997年).

基因错误表达实验表明Tbx5型和Tbx4型在建立鸡肢芽的独特形态特征方面发挥作用(Rodriguez-Esteban等人，1999年;Takeuchi等人，1999年). 然而，在小鼠中，有人认为这两个T-box基因通过诱导肢芽发育Fgf10型在间充质中，但不参与建立肢体身份(Naiche和Papaioannou，2003年;Minguillon等人，2005年;Naiche和Papaioannou，2007年). 前肢和后肢规范的分子机制尚不完全清楚。给定的动态表达式模式林28，根据发育阶段，前肢逐渐消失，然后后肢逐渐消失林-28肢体起始时。

在本研究中，我们证明了线虫异慢性基因的小鼠和鸡同源物第28行在胚胎发生过程中，在发育中的小鼠和鸡肢芽中表现出动态表达模式。需要进一步的实验来确定林-28在肢体发育中，如确定前肢和后肢芽发生和分化的时间。

2.材料和方法

2.2。非RI RNA探针的制备

老鼠Lin-28、Hoxc10、Tbx4、Pitx1cDNA克隆由RIKEN提供。老鼠玻璃钢5使用以下引物通过RT-PCR克隆cDNA：F-ATTGAGAACAACCCCTCGC、R-CT CCACTCTGGCACCATGC。

鸡肉林-28（NCBI加入编号。NM_001031774号)采用RT-PCR方法，从14期全胚胎和E5.5头部提取总RNA，合成cDNA。在PCR扩增后，将cDNA片段克隆到pDrive克隆载体（QIAGEN）中。该质粒用限制性内切酶线性化，并用作在体外用以下引物进行转录：（提供845 bp的片段，包括3′UTR和第28行)F-GTCGGGATGGGTCTGTC、R-GAGCTGCCTCCCTGCTC。另一组引物用于确认mRNA的正确表达（提供669 bp的片段，包括3′UTR和部分ORF）：F-AGAGCAAGCCTAAAC，R-TGAGCTCACTGAGCATG。

地高辛（DIG）标记的反义核糖探针通过将引物集和模板与DIG-RNA标记混合物（Roche）和T7/Sp6 RNA聚合酶（罗氏）孵育而转录。

2.3. 动物

怀孕小鼠（ICR株）从商业来源购买。将这些小鼠的胚胎（E9.5–11.5）解剖成冷PBS。

受精鸡蛋从当地农场购买，并在37.5°C的潮湿环境中孵化，直到胚胎达到所需阶段。胚胎分期根据汉堡和汉密尔顿（1951）在含有0.1%吐温20（PBT）的冷PBS中清洗胚胎数次后，取出其羊膜。在PBT中的4%多聚甲醛（PFA）中收集胚胎，并在4°C下轻轻摇晃过夜。在PBT系列中，用分级甲醇（MeOH）对胚胎进行脱水，并在−30°C和100%MeOH中储存直至需要。

2.4. 全贴装原位杂交

整体安装就地杂交程序按照威尔金森（1992）进行了一些修改。

简单地说，在用分级MetOH/PBT系列进行复水后，胚胎用6%的H漂白2O（运行）2在PBT中15分钟，并根据阶段在室温（RT）下用10μg/ml蛋白酶K（罗氏）处理8-24分钟，用0.2%甘氨酸停止，然后在室温下用4%PFA、0.2%戊二醛在PBT中重新固定胚胎20分钟。预杂交（在5×SSC（pH 4.5）、50%甲酰胺、1%SDS、50μg/ml酵母tRNA（罗氏）中，和50μg/ml肝素（Nakarai-tesque）在70℃下进行1h，然后添加DIG-RNA探针（约500 ng/ml）并在70℃进行杂交14h以上。

随后，胚胎在含有甲酰胺、SSC、SDS和0.05%CHAPS的洗涤缓冲液中进行一系列杂交后洗涤。在RT条件下，在含有0.1%吐温20（TBST）的TBS中用10%羊血清（TRACE）封闭1小时后，在4°C的TBST中用抗DIG-AP Fab片段抗体（Roche）和1%羊血清孵育胚胎过夜。用TBST进行一系列洗涤后，用NTMT（5 M NaCl，1 M Tris-HCl（pH 9.5），1 M MgCl）平衡胚胎2和0.1%吐温20）。

在4°C或RT下与硝基蓝四氮唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（NBT/BCIP）（罗氏）进行显色反应，然后将胚胎储存在4℃PBT中4%PFA中。使用可控震源1500分段系统（Ted Pella，Inc.）获得可控震源分段（100μm厚）。

染色样品用SZX12显微镜和DP70 CCD摄像系统（奥林巴斯）拍摄。

致谢

我们感谢Hayashizaki博士提供FANTOM cDNA文库。我们还感谢长井昭彦、Hikata、Hironobu Naito、Takamasa Suzuki和Noritsugu Fukuda提供的技术援助和批判性讨论，以及Asahara实验室的所有成员进行的有益讨论。这项研究得到了美国国立卫生研究院（AR50631）、JST SORST、国家生物医学创新研究所、基因组网络项目（MEXT）的ID05-24拨款和DECODE科学研究援助拨款（MEXT）（H.A.）的支持

脚注

出版商免责声明：这篇文章发表在爱思唯尔杂志上。所附副本提供给作者用于非商业性研究和教育，包括在作者所在机构指导、与同事分享以及提供给机构管理。禁止其他用途，包括复制和分发、出售或许可副本，或发布到个人、机构或第三方网站。在大多数情况下，作者可以将其版本的文章（例如以Word或Tex形式）发布到其个人网站或机构存储库中。鼓励需要有关爱思唯尔存档和手稿政策的更多信息的作者访问：http://www.elsevier.com/copyright（版权所有）

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