粘蛋白降解剂某种肠道细菌是人类肠道的丰富居民^{▿ †}

摘要

人体肠道粘膜表面暴露于大量细菌；浓度接近10¹⁴每个个体的生物数，代表1000多个物种(14). 这种肠道微生物群被认为是与宿主结盟进化而来的，这种共生关系在覆盖上皮并由含水粘蛋白组成的保护性粘液层中尤为重要(1)，它们是高分子量糖蛋白和其他宿主编码产物。粘液为肠道细菌提供了许多生态优势，因为它是这些细菌的直接营养来源，尤其是在碳源有限的结肠中(15). 通过在培养基中加入粘蛋白作为主要碳源和能源，我们能够分离出一种新型细菌，某种肠道细菌多功能计算机^T型(6)，属于疣状克罗地亚门，最近被确认为细菌(9). 对从粪便或活检样本中产生的已报道的克隆文库的结果分析显示，8个16S rRNA序列显示出≥98%的序列相似性水平，3个序列显示出与A.粘球菌（图。​（图1），1)表明它们可能代表该属的其他物种阿克曼西亚这些序列来自健康人的克隆文库(7,8,10,12,17; K.Saunier等人，未发表的数据）和炎症性肠病患者的活检(12; R.A.Hutson和M.D.Collins，未发表的数据），以及食草动物等动物(13)和老鼠(16). 在本研究中，我们设计、验证并使用了一种针对16S rRNA基因序列的特异探针A.粘球菌用荧光原位杂交（FISH）结合流式细胞术检测健康成人和婴儿粪便样本中这种新型粘蛋白降解菌的流行率和比例。

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图1。

显示位置的系统发生树A.粘球菌和中的克隆序列疣状克罗地亚门。逗号后面的数字是登录号。Bar=10%序列差异。

探头设计和验证。

的16S rRNA基因序列A.粘球菌及其近亲（表​（表1）1)使用CLUSTAL-X对96个肠道16S rRNA基因克隆的序列进行了比对，并检查了具有保守序列和可变序列的区域。基于这种比对，一个16S rRNA寡核苷酸探针靶向16S rRNA基因序列的高变区V9的一部分A.粘球菌是设计的。一个与1437到1456核苷酸相对应的区域大肠杆菌被选中。使用探针匹配功能，根据核糖体数据项目II软件包的小亚单位rRNA数据库检查新设计的探针(4)，并使用BLAST执行NCBI数据库的相似性搜索序列(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). 根据寡核苷酸探针数据库的命名法，该探针被命名为S-St-Muc-1437-a-a-20（Muc-1437）(2)其序列为：5′-CCTTGCGGTTCAGAT-3′。寡核苷酸探针序列已储存在probeBase中(11). 所有寡核苷酸探针均购自德国乌尔姆热电公司，并在5′端和3′端用Cy5、Cy3或异硫氰酸荧光素双重标记。EUB-338探针（5′-GCTGCTCCCGTAGGAGT-3′）作为阳性对照(三)非EUB探针（5′-ACATCCTACGGGGAGGC-3′）作为阴性对照，监测非特异性结合(18). 使用EUB-338或核酸染色TOTO-1碘化物（荷兰莱顿Invitrogen）进行细菌总数和细胞计数。TOTO-1是一种膜无关核酸，与细胞核酸结合时具有很高的荧光增强和量子产率。属于属的50个细菌菌株阿托波菌属,拟杆菌,双歧杆菌,梭菌属,科林塞拉,粪球菌属,肠球菌,大肠杆菌属,真杆菌属,粪杆菌属,拉氏螺属,乳酸杆菌,大球星,Mitsuokella公司,消化链球菌,普雷沃菌属,罗斯布里亚,瘤胃球菌,链球菌,维洛内拉、和维奇瓦利斯(5)用于优化和验证FISH探针。MUC-1437的杂交条件A.粘球菌如Zoetendal等人所述，通过增加杂交缓冲液中甲酰胺的浓度进行优化(19). 为了量化杂交细胞，使用FACSCalibur流式细胞仪（Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA）对样品进行分析，该流式细胞计配备有一个空气冷却氩离子激光器，在488 nm处提供15 mW的功率，并结合一个670 nm的标准滤光片设置的红光二极管激光器。对于总细胞计数，样品在1 nM TOTO-1（分子探针，荷兰莱顿）存在下在室温下培养5分钟。将配有细菌计数试剂盒（荷兰莱顿Molecular Probes BV）的未标记珠子（直径6.0μm）添加到最终浓度为10的TOTO-1染色样品中⁶beads/ml和作为内标物校准样品体积。相对丰度（比例）A.粘球菌-通过测定与Cy5标记的MUC-1437杂交的细胞数量与TOTO-1染色的细胞数量的比率来估计类细菌。使用WinMDI 2.8版软件进行分析(http://facs.scripps.edu/software.html)或CellQuest Pro项目（Becton Dickinson Immunocytometry Systems，加州圣何塞）。

50个菌株的最佳鉴别(5)和A.粘球菌使用20%的甲酰胺浓度实现，在这些条件下，没有非目标生物体与MUC-1437-Cy5探针发生交叉杂交（数据未显示）。因此，这些条件被视为特定于A.粘球菌进一步对粪便样本进行FISH分析。值得注意的是，当细胞与通用细菌探针EUB-338杂交时，杂交细胞的百分比介于非EUB和MUC-1437信号的值之间（参见补充材料中的图S1，面板A至C）。这可以解释为EUB-338探针的序列和16S rRNA序列的相应区域之间的两个不匹配A.粘球菌值得注意的是，我们还在16S rRNA序列中发现A.粘球菌与FISH分析中常用的阳性对照细菌探针（EUB-338）的两个不匹配，以及A.粘球菌在EUB-338杂交后，细胞仅显示出微弱的信号。回顾过去，这说明了为什么A.粘球菌之前尚未识别。

量化A.粘球菌在粪便中。

收集了50名6个月和12个月大的芬兰婴儿（25名女性和25名男性）、13名健康的荷兰成年人（8名女性和5名男性；年龄为26至40岁）和13名芬兰成年人（所有女性；年龄为26-34岁）的新鲜粪便样本。这些志愿者在前一年没有接受过任何喂养试验、特定饮食或抗生素治疗。样品采集后立即进行处理，固定样品在20%（vol/vol）的甲酰胺缓冲液中进行杂交，如上所述。对于总细胞计数，样品在TOTO-1碘化物存在下培养，如上所述。成对和未成对t吨测试用于统计分析A.粘球菌粪便样本中的细胞。用TOTO-1染色并用Cy5标记的非EUB和MUC-1437杂交后获得的细胞计量点图如补充材料中的图S1，面板D至F所示。A.粘球菌细胞（参见补充材料中的图S1，面板F）在FL4信号（Cy5荧光）中表示为黑人群体与非杂交细胞分离（灰色）。百分比A.粘球菌在来自荷兰个体的13个样本中有92%，并且在其中12个样本中清楚地检测到这种生物。对于这12名受试者，基于珠法的点图分析得出的平均值为粪便总细胞的1.26%±0.85%，对应于8.24×10⁸± 7.35 × 10⁸电池g（湿重）⁻¹.等级A.粘球菌细胞在检测限（<0.1%）和总粪便细胞的3.08%之间，男女个体之间没有显著差异（数据未显示）。随后，A.粘球菌还使用13名芬兰受试者的粪便进行了量化。结果表明：A.粘球菌占1.32×10⁹± 1.50 × 10⁹电池g（湿重）⁻¹占细菌总数的2.04%±0.90%。荷兰人和芬兰人之间的差异（图。​（图2）2)发现不显著(P（P）= 0.08). 共有50名6个月和12个月大婴儿的粪便用于量化A.粘球菌使用MUC-1437进行FISH流式细胞术。The concentration ofA.粘球菌在6到12个月之间显著增加(P（P）<0.001）（图。​（图2），2)，该生物体的水平为1.41×10⁸± 3.23 × 10⁸和4.92×10⁸± 4.20 × 10⁸细胞g（湿重）粪便⁻¹对于6个月和12个月大的婴儿，分别占细菌细胞的0.86%±1%和1.56%±0.58%。这些数据表明A.粘球菌在生命早期肠道定植，1年内水平接近成人水平。

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图2。

量化A.粘球菌芬兰（F）婴儿和成人以及荷兰（D）成人粪便中的（对数细胞/g[湿重]），结果以方框图和胡须图表示。每个方框从第25个百分位延伸到第75个百分位，一条线表示中位数。排除异常值后，晶须显示最高和最低值，异常值由点表示。

视角。

总之，我们描述了针对肠道生物的新型系统发育探针MUC-1437的首次验证和应用。数据表明，粘液利用生物A.粘球菌在生命早期定植于肠道，在1年内，其水平接近健康成年人的水平，约占总微生物群的1至3%。丰富的A.粘球菌在人类肠道中的表达为进一步研究其在健康和疾病中与粘蛋白降解有关的作用提供了新的视角。

补充材料

致谢

脚注

参考文献