分子医学。2008年3月至4月;14(3-4): 184–194.
早老素-1 280Glu→Ala突变改变C末端APP处理产生更长的Aβ肽:阿尔茨海默病的意义
,1 ,1 ,1,2 ,1 ,1 ,1 ,三 ,三 ,4 ,5 ,5 ,6和1
格雷戈里·范·维克
1美国亚利桑那州太阳城太阳健康研究所Longtine分子生物学和遗传学中心
Chera L Esh公司
1美国亚利桑那州太阳城太阳健康研究所龙汀分子生物学和遗传学中心
泰勒·A·科约翰
1美国亚利桑那州太阳城太阳健康研究所龙汀分子生物学和遗传学中心
2美国亚利桑那州格兰代尔中西部大学微生物系
莱尔·巴顿
1美国亚利桑那州太阳城太阳健康研究所龙汀分子生物学和遗传学中心
沃尔特·卡巴克
1美国亚利桑那州太阳城太阳健康研究所龙汀分子生物学和遗传学中心
院长C Luehrs
1美国亚利桑那州太阳城太阳健康研究所龙汀分子生物学和遗传学中心
托马斯·比奇
三美国亚利桑那州太阳城太阳健康研究所W H Civin神经病理学实验室
阿曼达·J·纽尔
三美国亚利桑那州太阳城太阳健康研究所W H Civin神经病理学实验室
弗朗西斯科·洛佩拉
4哥伦比亚安提奥基亚大学神经病理学系
贝尔纳迪诺·盖蒂
5美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学病理学和实验医学系印第安纳阿尔茨海默病中心
鲁本·维达尔
5美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学病理学和实验医学系印第安纳阿尔茨海默病中心
爱德华多·卡斯塔尼奥
6阿根廷布宜诺斯艾利斯Leloir基金会研究所
亚历克斯·E·罗赫
1美国亚利桑那州太阳城太阳健康研究所龙汀分子生物学和遗传学中心
1美国亚利桑那州太阳城太阳健康研究所Longtine分子生物学和遗传学中心
2美国亚利桑那州格兰代尔中西部大学微生物系
三美国亚利桑那州太阳城太阳健康研究所W H Civin神经病理学实验室
4哥伦比亚安提奥基亚大学神经病理学系
5印第安纳阿尔茨海默病中心,印第安纳大学病理学和实验医学系,美国印第安纳州印第安纳波利斯
6阿根廷布宜诺斯艾利斯Leloir基金会研究所
2007年10月1日收到;2008年1月14日接受。
摘要
早老素(PS)突变增强了从淀粉样前体蛋白(APP)衍生的Aβ42肽的产生。Aβ42物种优先产生的途径尚未阐明,PS突变导致早发性痴呆的机制也尚未建立。采用组织学、免疫组织化学、生物化学和质谱法相结合的方法,我们检测了一名表达PS1 280Glu→Ala家族性阿尔茨海默病突变的患者产生的淀粉样物质的结构和形态性质。观察到大量弥漫性斑块,其染色模式和形态与之前描述的PS病例不同,白质内也有离散的淀粉样斑块。除了发现CT99和Aβ42肽的数量增加外,我们的研究还揭示了Aβ肽的复杂阵列的存在,其长度远远超过42/43个氨基酸残基的种类。保留在膜壁内的较长Aβ物种的疏水性增加可能会影响质膜和细胞器的结构和功能。这些C-末端较长的肽可能通过立体效应,通过关键淀粉样降解酶(如neprilysin和胰岛素降解酶)抑制周转率。为了了解阿尔茨海默病的病理生理学,并有助于设计治疗干预措施,需要全面了解膜结合Aβ因γ-分泌酶改变而产生的有害副作用。
简介
阿尔茨海默病(AD)越来越影响老年人,现在已成为老年人中第三大常见的死亡原因。随着平均预期寿命的增加,AD患者的数量将几乎呈指数级增长,预计到2050年,病例将增加四倍(1). AD的病理特征是在脑的细胞外间隙和血管壁中大量积累可溶性和纤维状淀粉样β(Aβ)肽。40/42(43)沉积在AD脑中的氨基酸Aβ肽是由β和γ分泌酶对更大的、膜锚定的1型β淀粉样前体蛋白(βAPP)的连续蛋白水解作用产生的。当βAPP被α-和γ-分泌酶的联合序列活性裂解时,会生成较短的Aβ肽(P3),对应于Aβ序列残基17–42。所有Aβ肽都具有有限的水溶性,因为它们包含疏水性βAPP跨膜结构域氨基酸序列。
第二个AD特征是细胞内产生神经纤维缠结(NFT),主要由超磷酸化tau蛋白和膜糖脂残余物组成(2–4). 和淀粉样蛋白和NFT积聚相关的是慢性神经炎症和严重的血管病变。这些损害了脑组织灌注和有氧代谢,导致突触急剧丧失、神经元死亡和胶质增生,导致严重的灰质和白质萎缩。
早老素是γ分泌酶的组成部分,γ分泌酶是一种膜结合的天冬氨酸蛋白酶,由四个相互作用的分子组成:早老素(PS),含有蛋白酶活性中心;尼卡司汀;APH-1;和PEN-2(5–7). 在人类中,两个PS基因编码PS1和PS2分子,它们的氨基酸序列65%相同(8).
迄今为止,已经报道了160多个PS1突变、11个PS2突变和27个βAPP突变(http://www.molgen.ua.ac.be/ADMutations网站)总的来说,AD表型表现出一定程度的变异。许多PS突变增加了β-分泌酶C末端(CT)99氨基酸长片段(CT99)的产生,该片段随后被γ-分泌酶切割以产生Aβ肽(CL Esh和AE Roher,未发表的观察结果)。有证据表明,在这一过程中,γ-分泌酶首先在βAPP的ɛ位点(对应于残基49–50的Aβ序列)裂解,产生一种称为βAPP胞内结构域(AICD)的转录因子。然后,γ-分泌酶或未标记的羧肽酶在γ位点水解生成Aβ42肽(9,10)虽然一些证据支持Aβ和AICD的产生是两种完全独立于γ-分泌酶的现象(11).
人们普遍认为,PS突变通过影响βAPP的加工而优先产生Aβ42,从而导致神经退行性变和痴呆(12). 此外,PS突变导致家族性阿尔茨海默病(FAD)发病的早期似乎与Aβ42的增加和Aβ40水平的相应降低有关(13). 一些PS突变的另一个共同特征是产生大量Aβ肽,其N端在残基3处被截断,而在残基11处则更为丰富(14,15)表明PS突变同时影响β-和γ-分泌酶活性。然而,在转基因小鼠中,一些PS突变在缺乏Aβ肽的情况下会导致神经退化,这表明Aβ的产生本身可能不是AD发展的所有方面所必需的(16).
我们研究了一名患有PS1 280Glu→Ala突变的痴呆患者的Aβ相关肽的化学成分。这种常染色体显性突变在哥伦比亚麦德林地区尤为普遍。
除了预期增加的CT99、Aβ42和丰富的弥漫性斑块数量外,我们的研究还揭示了肽的存在时间远长于42/43氨基酸残基种类。这些较长的Aβ肽可能对了解FAD和散发性AD(SAD)的发病机制和发展具有重要意义。
材料和方法
临床报告(PS1 280Glu→Ala)
一名49岁男性患者在3年的时间里表现出持续的短期记忆丧失和体力下降。此外,患者还报告有抑郁、易怒、言语流利性下降、人格改变和吞咽过度,但仍能管理日常生活活动。脑电图显示无异常波形,甲状腺功能在正常范围内。家族史显示,患者的母亲在43岁时患有痴呆症。两年后,吞咽过度仍在继续,记忆力丧失估计约为80%,日常生活活动和漫无目的游荡能力的部分缺陷明显。患者患有妄想症、严重失眠、名义失语症和过度反射反应。52岁时,患者开始产生幻觉,出现严重失语症,偶尔出现肌阵挛,严重失眠和帕金森氏步态。在此阶段,吞咽过度消失。患者无法管理日常生活活动,失禁,体重严重减轻。54岁时,患者完全失语症和健忘症。他还表现出流涎、吞咽困难、僵硬和肌阵挛等帕金森病症状,每天发作两到三次。患者54岁时死亡。
神经病理学
在尸检后立即(尸检间隔3.3小时)进行的尸检显示严重的脑萎缩(脑重1053克),在额叶、顶叶和颞叶更为明显。从额叶、顶叶和颞叶获取石蜡切片(6μm),并用苏木精和伊红(H&E)、坎贝尔-西泽银染技术和硫黄素-S染色。使用抗Aβ40(抗Aβ5074P;Chemicon/Millipore,Billerica,MA,USA)的多克隆抗体以1:300稀释度进行免疫细胞化学。使用21F12单克隆抗体(Elan,South San Francisco,CA,USA)以1:1000稀释度检测Aβ42。使用多克隆抗AβAβN3pE抗体(IBL,Gunma,日本)检测Aβ残基3(1:100稀释)下的焦谷氨酰修饰。使用单克隆抗体(AT8 Polymedco,Cortland Manor,NY,USA)以1:300稀释度检测Ser202和Thr205残基的tau磷酸化。
Aβ肽的免疫测定
将100 mg来自PS1 280Glu→Ala的额叶大脑皮层和两个非痴呆(ND)对照病例在800 mL 5 M胍基HCl、50 mM Tris-HCl pH 8.0中用电动研磨机在4°C下均质。连续摇晃3小时后,将样品在60000℃下离心克在4°C的Ti 50.4 Beckman转子中放置30分钟。根据制造商的说明,收集上清液,并使用抗Aβ40和抗Aβ42抗体(美国明尼苏达州明尼阿波利斯免疫生物学实验室和比利时免疫遗传学实验室)进行ELISA分析。
大小排阻色谱法分离多肽
将来自表达PS1 280Glu→Ala突变的受试者的3克大脑皮层从下方的白质中分离出来,并在Potter-Elvehjem玻璃组织研磨机中用20毫升90%玻璃蒸馏甲酸(GDFA)匀浆。在室温(RT)下静置15分钟后,将匀浆倒入两个聚异丙醇管中,并在40000℃下离心1小时克(SW 41Ti转子Beckman转子),温度为5°C。丢弃漂浮在试管顶部的脂质层,收集GDFA清澈上清液(18 mL)。将一半的GDFA可溶性样品(9 mL)等分到500μL微离心管中,分别在尺寸排除Superose 12柱(1 cm×30 cm;Amersham/General Electric,Piscataway,NJ,USA)上进行快速蛋白液相色谱(FPLC),用80%(v/v)GDFA在室温下以15 mL/h的流速平衡和显影。在280 nm处监测洗脱液吸光度。M对应的分数第页收集并合并10–2 kDa,添加5 mL 10%(w/v)两性离子甜菜碱溶液,通过真空离心将分数体积减少至200μL(Savant/GMI,拉姆齐,明尼苏达州,美国)。为了最大限度地减少来自收集部分侧翼区域蛋白质的污染,将收集到的10-2kDa部分汇集在一起,并在相同条件下进行第二轮FPLC纯化,以生成六个最终的10-2KDa样品,这些样品体积缩小,标记为GDFA可溶性部分,并储存在−80°C下。
反相色谱法分离多肽
使用高效液相色谱法(HPLC)和反相Zorbax 300SB-C8柱(9.4 mm×250 mm;安捷伦,圣克拉拉,加利福尼亚州,美国)在80°C下进一步分离含有10-2 kDa肽的GDFA可溶性分数FPLC样品。为了在装填前提高Aβ肽的溶解度,通过真空离心将FPLC 10-2kDa组分还原至约200μL的体积,并添加80%的GDFA,以产生500μL的最终体积用于柱装填。色谱采用溶剂“a”:水/0.1%(v/v)三氟乙酸(TFA)和溶剂“B”:乙腈/0.1%(v/v)TFA的流动相混合物进行开发,以1.5 mL/min的流速操作,在90 min内产生20%至60%乙腈的线性梯度。在214 nm处监测洗脱吸光度。通过真空离心将收集的部分体积减少至100 mL,并提交至Western blot、MALDI-TOF和SELDI-TOF-质谱分析。
一维西方印记
将来自散发性AD(SAD)、ND年龄匹配对照组和PS1 280Glu→Ala病例的脑组织(100 mg)在4°C的800 mL 1 X PBS(pH 7.4)中均质化,其中含有完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(德国曼海姆罗氏诊断公司)。用BCA蛋白检测试剂盒(Pierce)定量总蛋白。有关SDS-PAGE和蛋白质印迹的完整方案,请参阅参考文献17用抗Notch 1抗体检测Notch细胞内结构域(NICD)(Chemicon,Temecula,CA,USA)。这种抗体只识别Notch蛋白的γ分泌酶叶形式。用来自皮尔斯(美国伊利诺伊州罗克福德)的山羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)结合二级抗体检测抗体反应带。
二维西方印记
分别将来自PS1 280Glu→Ala和两个SAD病例(79岁和89岁)以及一个对照病例(82岁)的50 mg灰质均匀化于700 mL均质缓冲液中(7 M尿素,2 M硫脲,4%3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基氨]-1-丙磺酸水合物[CHAPS],1%二硫苏糖醇[DTT],40 mM Tris-HCl pH 8,蛋白酶抑制剂鸡尾酒[Roche Diagnostics,德国曼海姆])。使用特氟隆均质器进行20次敲击后,对样品进行声波处理,在RT下孵育1小时,然后再次进行声波处理。然后将样品在120.2 TLA转子(加州富勒顿贝克曼)中以10000 g在4°C下离心20分钟。收集每个样品的上清液,并在1000道尔顿分子量截止(MWCO)袋中用蒸馏水透析3小时(18). 对透析后的样品进行超声波处理,并进行BCA蛋白分析以量化总蛋白水平(Pierce)。200μg总蛋白在RT条件下在复水缓冲液中培养30分钟(9 M尿素,2%[v/v]CHAPS,2 M硫脲,1.25%[v/v]IPG缓冲液pH值3-10[GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA],18 mM DTT,0.002%[v/v]溴酚蓝)。再水化蛋白质在室温下平衡为11 cm IPG条带,pH值为3–10(GE Healthcare),持续16 h。使用Ettan IPGphor系统(GE Hearthcare,完成12150 V-h的总施用量。将板条在5 mL平衡缓冲液中培养15 min,平衡缓冲液包含50 mM Tris-HCl、6 M尿素、30%(V/V)甘油、2%(V/V)SDS、0.002%(V/V)溴酚蓝和65 mM DTT,室温下培养15 min,然后在相同的缓冲液中用200 mM碘乙酰胺代替DTT在室温下平衡15分钟。在200 V的条件下,在标准Tris-HCl、4–20%丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)和1X Tris/甘氨酸/SDS缓冲液(Bio-Rad)中对板条进行二维电泳60分钟。将万花筒预处理蛋白质分子量标准(Bio-Rad)加载到每个凝胶上。电泳后,凝胶在含有20%(v/v)甲醇的1X Tris/甘氨酸转移缓冲液中平衡15 min,分离的蛋白质在30 v下电泳转移到0.45μm硝化纤维素膜(Bio-Rad)上1 h。Western blot分析(17)用抗βAPP的9个C末端氨基酸的抗体CT9APP(Chemicon)进行检测。
矩阵辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)
将HPLC馏分减少至约30 mL,并将5 mL样品添加到5 mLα-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)饱和溶液中,该饱和溶液溶解于50%(v/v)乙腈/0.1%(v/v)TFA中。在样品板上发现0.5 mL等分样品,通过MALDI-TOF Voyager DE STR质谱仪上平均100次激光照射获得质谱(美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司)。使用CalMix 2混合物(Applied Biosystems)进行校准。MALDI-TOF的特点和使用的校准标记的组成在其他地方介绍(17).
表面增强激光解吸电离飞行时间(SELDI-TOF)质谱(MS)
在选定的HPLC峰中,Western blot分析显示Aβ肽存在于1000 MW截止袋中,针对50 mM Tris-HCl(pH 8.0)透析1 h,针对10 mM Tris-HCl(PH8.0)进行透析1 h。在ProteinChip阵列上应用之前,透析样品体积减少到约50μl。在使用样品之前,对透析的峰值样品进行三次超声波处理,每次1s。然后使用SELDI-TOF质谱仪对样品进行分析(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市Ciphergen/Bio-Rad)。通过将4μl PBS加载到芯片斑点上并在RT下培养15分钟,制备PS20蛋白质芯片®阵列。将4μl多克隆抗Aβ40抗体和抗Aβ42抗体(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分别以0.38 mg/mL和0.57 mg/mL的浓度加载到芯片上。将抗体改良蛋白芯片在室温下的湿度室中培养1 h。用4μl乙醇胺(1 M,pH 8.0)封闭芯片表面30 min。用4微升PBS+0.5%(vol/vol)Triton X-100分别清洗一次样品斑点,用4微l PBS分别清洗两次样品斑点。将蛋白质芯片加载4μl声波样品、4μl Aβ1-40或1-42肽标准物DMSO(加利福尼亚州肽研究所,加利福尼亚州纳帕,美国)作为阳性对照,并在4°C的湿度室中培养过夜。去除样品结合溶液后,分别用4μl PBS+0.5%Triton X-100清洗斑点两次,用4μl PBS清洗一次,再用4μl蒸馏水清洗一次。让芯片风干,并将20%CHCA饱和乙腈溶液和0.1%TFA涂抹两次(0.5μl);芯片可以在两次使用之间晾干。分子质量赋值是在Ciphergen Seldi蛋白质生物学系统II中通过100次平均注射完成的,使用CiphergenAll-in-One肽标准进行外部校准。
结果
PS1 280Glu→Ala突变表达的大脑皮层组织的显微镜检查显示大量弥漫性斑块,经Campbell-Switzer银染强烈染色(). 这些弥漫性斑块没有表现出H&E染色阳性的其他PS突变中描述的棉花斑块(CWP)的形态学和组织化学/免疫细胞化学特征(15,19,20). PS1 280Glu→Ala突变中的弥散斑块H&E为阴性,大小不均匀,从10–110μm不等,形状和边界不规则,由无定形蓬松物质的凝集形成(). 其中一些斑块显示出更清晰的中心,有时还显示出密集的中心核和营养不良的神经炎。在某些情况下,几个斑块合并成较大的融合结构。少数斑块被硫黄素-S强烈荧光(). 弥漫性斑块中,皮质内散布着数量适中(约5%)的致密淀粉样核心斑块,边缘呈刷状,以及淀粉样纤维骨架松散聚集的斑块,这些斑块被硫黄素-S强烈染色。这两种淀粉样斑块与SAD患者中观察到的淀粉样斑块相似。有趣的是,在深部白质中可见有刷状边界的异位淀粉样斑块核心,有时是孤立的,有时是成簇的(). 适量的血管壁含有丰富的硫黄素-S染色反应性淀粉样蛋白,表明存在纤维性Aβ(). 针对AβN-末端区的抗体,在位置3处具有焦谷氨酰,证明在具有淀粉样蛋白沉积物和致密淀粉样蛋白核心斑块的血管中以及在有限数量的弥漫性斑块中存在AβN3pE(数据未显示)。此外,大量神经丝、NFT和弥漫性斑块被抗金(AT8)抗体染色(). 所有弥漫性斑块和核心斑块的抗Aβ42(21F12)抗体均呈强阳性(). 相比之下,极少数斑块的抗aβ40抗体染色呈阳性(). 与之前PS1 280Glu→Ala突变的特征一致,免疫分析表明,与Aβ40(1.11μg/g)相比,大脑中Aβ42的数量增加了(3.27μg/g湿重)。为了进行比较,2个ND对照组的Aβ平均含量分别为:Aβ40和Aβ42的湿重0.12μg/g和0.055μg/g。
PS1 280Glu→Ala皮质和白质Aβ斑块和tau沉积的组织化学和免疫组织化学分析。A) 用Campbell-Switzer银染技术在100倍放大下显示大量斑块的区域。B) 在高倍放大(200倍)下,斑块似乎由聚集的无定形绒毛材料组成。C) 放大100倍后,硫黄烷-S染色的银染色阳性斑块数量减少,表明存在淀粉样纤维。D) 由Aβ42抗体21F12染色的淀粉样核心斑块的深白质簇。放大200倍。E) 一组被硫黄素-S染色的白质淀粉样蛋白核心斑块。注意刷状边界和原纤维的辐射方向,类似于SAD斑块结构,放大200倍。F) 显示纤维Aβ沉积的皮质血管簇。总的来说,PS 280Glu→Ala的脑血管淀粉样变为轻度至中度。硫黄烷-S染色,100倍放大。G) 对大量弥漫性斑块进行AT8抗体染色,检测嵌入这些病变中的NFT的存在。高倍镜下,AT8抗体似乎集中在营养不良的神经突内,类似于SAD老年斑的情况。切片还显示了皮质神经元内大量的NFT,放大25倍。H) 实际上,大脑皮层中被21F12抗体染色的所有弥漫性和淀粉样斑块都是针对Aβ升高的,在放大25倍的残留物42处终止。相比之下,使用aβ40抗体在25倍放大镜下对减少的皮质斑块进行染色(I)。比例尺:A、C、F=100μm;B、 D=50微米;E=20μm;G、 H,I=500μm。
为了确定PS1 280Glu→Ala突变是否影响APP CT区域的处理,生成2D Western blot,与抗CT9APP抗体反应,并与AD和ND病例的分子模式进行比较。PS1突变病例表明,与其中一例AD和ND病例中所见的数量相比,CT APP肽(CT99)的数量更大(). 然而,经密度正常化后,其中一例AD患者的CT APP肽含量略高(). 表达PS1 280Glu→Ala突变的皮层的蛋白质印迹与针对Notch细胞内结构域(NICD)产生的抗体反应,显示出Mr为~50 kDa和~30 kDa的显著条带,在SAD和ND病例中相对较弱().
PS1 280Glu→Ala突变、SAD和ND对照样品的Western blot由抗CT9APP抗体和识别NICD结构域的抗体形成。为了最大限度地减少技术错误,在相同条件下同时使用200μg总蛋白对PS1、SAD和ND病例进行2D Western blots(A到D)。CT99肽及其翻译后修饰形式被装箱在印迹的右下角。扫描密度测定显示,PS1突变(A)中的CT99肽比一例SAD病例(C)和ND对照(D)中的更丰富。另一个SAD病例(B)在按密度归一化后,CT99肽的数量略有增加。E) Notch的一维Western印迹。NICD抗体在~80、60、50和30 kDa处检测到显著的条带,在PS1突变中更为明显,这表明NICD及其降解副产物具有更显著的代表性。SAD、ND和PS1的总蛋白负载量为25μg。
GDFA溶解大脑皮层,然后离心,有效地分离出在试管顶部漂浮成致密层的脂质膜部分。仔细收集上清液,避免受到顶层脂质和含有酸不溶性蛋白质(主要是血管交联胶原材料)的小颗粒的污染。用尺寸排除色谱法分离酸性上清液中的分子,得到两个主要部分:大于和小于10kDa().
PS1 280Glu→Ala样品的色谱图。A) 在尺寸排除的Superose 12柱中对酸溶性部分进行FPLC跟踪。将在54至66分钟保留(实线追踪)时间内洗脱的10–2 kDa组分从三次连续运行中汇集,并在相同条件下重新进行色差测定,以将侧面污染降至最低(见连字号追踪)。B) 在C8反相柱上分离的2–10 kDa FPLC馏分的HPLC色谱图。使用Aβ40和Aβ42抗体通过Western blots对所有组分进行评估。斜线表示乙腈梯度的斜率。缩写词t、d和m分别指Aβ-40和Aβ-42标准的三聚体、二聚体和单体形式。
通过C8反相色谱法进一步分离从尺寸排阻色谱法获得的GDFA可溶性10-2 kDa级分,产生13个峰,通过Aβ-蛋白质印迹法进行研究。七个组分含有Aβ40和Aβ42()Aβ42明显富集于Aβ40。有趣的是,Western blotting分析还揭示了淀粉样肽的意外多样性,其中含有大量低聚物以及较短形式(小于4500 M)第页).
通过反相色谱法分离的GDFA可溶性级分的MALDI-TOF和SELDI-TOF质谱(MS)分析证实了存在一系列与截短、完整和较长的Aβ肽序列相对应的肽物种。MALDI-TOF显示了N末端位于位置1到47,C末端位于位置11到55的肽。SELDI-TOF使用Aβ42作为捕获抗体,证明存在从位置1到31开始的肽和从位置37到55的C末端的肽。还表示了未经修饰和化学修饰的Aβ序列。一些Aβ肽被AβMet35氧化为甲砜或亚砜修饰,每种情况下的Mr增加16或32道尔顿。在MALDI-TOF和SELDI-TOV质谱中也观察到残基Glu3和/或Glu11环化为其焦戊酰衍生物,在这两种情况下,Mr都减少了18道尔顿。实验诱导的Aβ、Ser8和Ser26、Thr43和Thr48位置的甲酰化增加了M第页28道尔顿或整数倍。描述了Aβ肽的MALDI-TOF Mr,其N末端位于残基1至27,C末端位于残基44至55。所有MALDI-TOF光谱在预期和观察到的Aβ肽质量之间的误差幅度为±1道尔顿。使用Aβ42捕获抗体的SELDI-TOF光谱分析也证明存在长度超过43个氨基酸残基的Aβ肽,这些氨基酸残基具有C末端,从残基44到残基55不等,如SELDI-TOF质量测定的精度为±0.1%道尔顿,平均偏差为±1.9道尔顿。此外,SELDI-TOF光谱表明,有三种Aβ肽延伸到了55号残基之外,并推测与APP序列相对应:29–90、28–89和34–93(Aβ标记法)。
表1
具有C末端≥Aβ44的PS1肽的MALDI-TOF
观测质量 | 计算的质量 | 肽片段 | 观测质量 | 计算的质量 | 肽片段 |
---|
4827.81 | 4828.48 | 1–45 | 3071.75 | 3072.62 | 14–43 |
5254.11 | 5255.04 | 1–49 | 4311.65 | 4311.31 | 14–54 |
5483.84 | 5483.44 | 2–52 | 2834.03 | 2834.37 | 15–42 |
5611.79 | 5611.62 | 2–53 | 3573.99 | 3574.33 | 15–49 |
4529.62 | 4529.16 | 3–44 | 3546.03 | 3545.33 | 16–50 |
5069.41 | 5068.87 | 3–49 | 2778.66 | 2778.31 | 17–44 |
4400.46 | 4400.04 | 4–44 | 2891.31 | 2891.47 | 17–45 |
4514.10 | 4513.20 | 4–45 | 3318.02 | 3318.02 | 17–49 |
4612.14 | 4612.33 | 4–46 | 3318.54 | 3318.02 | 17–49 |
4826.66 | 4826.60 | 4–48 | 3417.79 | 3417.16 | 17–50 |
5282.30 | 5283.25 | 4–52 | 3661.98 | 3661.51 | 17–52 |
4892.23 | 4891.71 | 5–50 | 2778.66 | 2778.31 | 18–45 |
5135.68 | 5136.07 | 5–52 | 3091.11 | 3090.70 | 18–48 |
5492.48 | 5520.60 | 5–55 | 2778.66 | 2778.31 | 19–46 |
4096.03 | 4096.68 | 6–44 | 2891.31 | 2891.47 | 19–47 |
4309.90 | 4308.97 | 6–46 | 3335.17 | 3336.06 | 19–51 |
4979.59 | 4979.89 | 6–52 | 3301.20 | 3302.05 | 20–52 |
5108.06 | 5108.06 | 6–53 | 3430.59 | 3430.22 | 20–53 |
4597.66 | 4598.39 | 7–50 | 3557.86 | 3558.39 | 20–54 |
4729.18 | 4729.58 | 7–51 | 3686.10 | 3686.57 | 20–55 |
5226.44 | 5227.27 | 7–55 | 2313.35 | 2313.74 | 22–45 |
4615.14 | 4614.50 | 8–51 | 2071.10 | 2071.47 | 23–44 |
5025.40 | 5025.10 | 9–55 | 2284.09 | 2283.76 | 23–46 |
3601.87 | 3601.19 | 10–43 | 2841.59 | 2841.51 | 23–51 |
3700.33 | 3700.32 | 10–44 | 2069.31 | 2069.54 | 24–45 |
4024.35 | 4024.77 | 10–47 | 2069.31 | 2069.54 | 25–46 |
4469.74 | 4470.37 | 10–51 | 2284.09 | 2283.80 | 25–48 |
4583.60 | 4583.53 | 10–52 | 2867.80 | 2868.63 | 25–53 |
4076.96 | 4076.86 | 11–49 | 2140.40 | 2139.67 | 27–48 |
4420.44 | 4420.35 | 11–52 | 2351.92 | 2351.96 | 27–50 |
表2
C末端≥Aβ44的Aβ42抗体捕获的PS1肽的自身抗体
观测质量 | 计算的质量 | 肽片段 | 观测质量 | 计算的质量 | 肽片段 |
---|
4824.83 | 4828.48 | 1–45 | 4417.25 | 4419.41 | 12–53 |
5141.54 | 5141.88 | 1–48 | 3422.06 | 3422.05 | 13–45 |
5357.32 | 5354.17 | 1–50 | 3518.90 | 3521.19 | 13–46 |
5140.05 | 5139.95 | 2–49 | 3382.60 | 3384.05 | 14–46 |
5372.96 | 5370.28 | 2–51 | 4055.06 | 4054.96 | 14–52 |
4532.38 | 4529.16 | 3–44 | 4311.99 | 4311.31 | 14–54 |
4640.23 | 4642.32 | 3–45 | 3358.27 | 3360.06 | 15–47 |
5067.06 | 5068.87 | 3–49 | 3575.36 | 3574.33 | 15–49 |
5169.06 | 5168.01 | 3–50 | 3321 | 3318.02 | 17–49 |
4401.68 | 4400.04 | 4–44 | 3661.75 | 3661.51 | 17–52 |
4516.26 | 4513.20 | 4–45 | 3438.07 | 3435.19 | 18–51 |
4824.83 | 4826.60 | 4–48 | 3337.20 | 3336.06 | 19–51 |
5169.06 | 5170.09 | 4–51 | 3575.52 | 3577.40 | 19–53 |
4890.62 | 4891.71 | 5–50 | 3559.66 | 3558.39 | 20–54 |
5139.79 | 5136.07 | 5–52 | 2595.61 | 2596.11 | 21–47 |
5389.45 | 5392.42 | 5–54 | 2595.38 | 2597.11 | 21–47 |
4311.99 | 4308.97 | 6–46 | 2627.90 | 2627.14 | 22–48 |
4640.23 | 4636.39 | 6–49 | 3340.05 | 3339.14 | 22–54 |
5109.74 | 5108.06 | 6–53 | 3339.28 | 3340.14 | 22–54 |
5226.90 | 5227.27 | 7–55 | 2285.36 | 2283.76 | 23–46 |
4055.06 | 4056.74 | 8–46 | 3340.05 | 3338.20 | 23–55 |
4985.72 | 4984 | 8–54 | 3339.28 | 3339.20 | 23–55 |
5110.08 | 5112.18 | 8–55 | 2595.38 | 2595.23 | 24–50 |
4640.23 | 4640.58 | 9–52 | 2285.36 | 2283.80 | 25–48 |
4898.58 | 4896.93 | 9–54 | 2627.90 | 2627.29 | 25–51 |
3337.20 | 3336.90 | 11–42 | 2571.46 | 2570.24 | 26–51 |
3646.91 | 3650.30 | 11–45 | 2681.91 | 2683.40 | 26–52 |
4417.25 | 4420.35 | 11–52 | 2353.09 | 2351.96 | 27–50 |
3518.90 | 3521.19 | 12–45 | 2595.38 | 2596.32 | 27–52 |
讨论
PS1 280Glu→Ala突变产生了大量的弥漫性斑块,其中硫黄素-S阳性淀粉样蛋白斑块的数量较少,这是SAD的特征,表明FAD和SAD的两种根本不同的神经病理学机制。PS1 FAD病例中的弥漫性淀粉样蛋白tau阳性,表明存在营养不良的神经突,伴有自噬体和NFT,并且在结构上与PS CWP和SAD弥漫性斑块不同。PS1 280Glu→Ala突变的另一个特征是深白质内存在明显的淀粉样核心斑块。其他PS1突变中也有白质异位神经元的报道(21,22)这与该位点的PS病理学中的Aβ密切相关。在迄今为止研究的大多数PS突变中,aβ42残基结束的肽比aβ40残基C末端的肽占优势(15,23,24). 在本研究中,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)在新鲜制备的灰质匀浆上测定Aβ40:Aβ42的比率为1:3。
γ-分泌酶表达放松的底物特异性,并具有足够广泛的底物特异性,可在跨膜结构域的多个位点水解βAPP(25). 除了βAPP外,γ-分泌酶还能够裂解超过25种不同的底物,包括Notch,并且能够与40多种非底物蛋白质建立稳定的相互作用(参考文献综述26). 这种蛋白质复合体参与蛋白质运输、钙代谢、细胞粘附、突触活动和细胞信号传递(26)以及神经发生、神经元分化、神经元贩运和神经元凋亡(27–29). 在SAD中,海马中Notch-1表达增加,表明PS突变可能直接导致Aβ诱导的神经元死亡(30,31). 然而,Notch-1和βAPP对γ分泌酶的竞争减少了淀粉样肽的净PS1生成(32,33). 在SAD、ND和FAD PS1 280Glu→Ala病例的大脑皮层中产生的Notch-1蛋白水解副产物的蛋白质印迹比较显示,FAD组织中对应于80kDa NICD的肽水平增加,在SAD和ND脑中观察到的量相对较低。在同一个印迹中,发现了两条额外的谱带(~50和30kDa),这两条谱带在SAD和ND受试者中显著减少。因此,PS分子的突变深刻影响Notch代谢和功能。FAD PS1 280Glu→Ala中βAPP的蛋白水解降解也发生了重要变化,其中相对于AD和ND对照,CT99片段的数量明显增加。更丰富的CT99表明,由于突变导致的PS1酶活性紊乱导致了该片段的积累。CT APP片段与神经毒性、钙代谢改变、长期增强、记忆障碍、自由基生成、炎症细胞因子、趋化因子和乙醛生成增加有关(参考文献综述34). 在过度表达APP羧基末端100氨基酸的CT-Tg小鼠中,也研究了CT99水平增加的后果。这些小鼠表现出神经元、轴突、树突、突触和脑血管的严重退化(35). 此外,小鼠脑室内注射CT100可导致行为障碍(36).
80%GDFA中的大脑皮层均匀化溶解了所有Aβ肽,因为它完全分解了所有细胞和细胞外结构。酸性上清液包含APP/Aβ和蛋白水解衍生物,包括疏水性跨膜结构域。在完整的大脑中,这些肽被分隔在不同的组织隔间,例如神经元、胶质细胞和血管细胞的细胞膜和胞浆。此外,酸性部分还含有可溶性低聚物和不溶性纤维,它们作为细胞外淀粉样蛋白沉积在斑块和血管壁中。酸提取物还包括处于蛋白水解降解过程中的Aβ肽。
先前对SAD的皮质淀粉样斑块核心和脑血管中存在的Aβ肽的研究表明,大多数分子在Val40和Ala42处有C末端,少数终止于Thr43残基。N末端的显著降解和其他翻译后修饰是明显的(37–39). 通过激光显微切割(LMD)和质谱直接检测分离的PS2/APP-Tg小鼠淀粉样斑块中也证实了Aβ肽的化学成分(40). SAD扩散斑块中Aβ肽的特征表明Aβ17-42(P3)和Aβ1-42物种的混合物(41). 水溶性二聚体/低聚物Aβ也在残基40/42处终止(42,43). 携带瑞典双突变的APP23和tg2576转基因小鼠中的淀粉样斑块也产生Aβ肽,其末端残基为40/42,具有与SAD患者中发现的肽相似的特征(44,45). 然而,由于APP717 Val→Phe Indiana突变导致的FAD特征表明,Aβ43至54残基上具有C末端的较长Aβ肽(46)表明γ-分泌酶对APP的切割和特异性受到了实质性的干扰。同样,携带FAD APP 717Val→Phe突变的PDAPP Tg小鼠产生的Aβ肽终止于位置Aβ44至62(17). 使用携带瑞典突变和印第安纳突变的tgCRND8 Tg小鼠进行的其他研究证实了这些结果。这些小鼠还表现出一种新的γ-分泌酶处理模式,产生以44-99、45-99、52-99、54-99残基结尾的CT APP片段(aβ序列编号)。此外,该小鼠菌株产生了多种aβ肽,其C末端从残基43到55(47).
用γ-分泌酶抑制剂DAPT处理时,在转染CT APP、PS1和PS2基因的细胞裂解液中,以及它们的野生型(PS1wt、PS1 146Met→Leu、PS1 233Met→Thr、PS1 384Gly→Ala、PS2wt和PS2 141Asn→Ile)中也发现了更长的Aβ肽。这些肽产生Aβ序列,其末端为残基43、44、45、46、48和49(48). 人类骨骼肌也产生更长的Aβ肽,其C末端位于残基44、45和46(49). 最近,LMD从携带PS1 261Val→Ile和PS1 261 Val→Phe突变的FAD患者中分离出CWP。质谱分析表明,CWP斑块由氨基末端截短的Aβ肽组成,其中最丰富的是Aβ3-42/43和Aβ11-42/43,并含有N-末端焦谷氨酰(15).
由于PS1突变,较大且相应更疏水的Aβ肽所在的细胞隔室仍有待确定。从热力学角度来看,细胞浆和细胞器膜是候选者。已经确定Aβ合成的位点是内质网、高尔基体和质膜,APP和分泌酶位于这些部位,并集中在膜内(50,51). 在神经元细胞系的脂筏中,发现了APP、β-分泌酶as-partyl蛋白酶(BACE-1)和γ-分泌酶的四个组分(52,53). 在tg2576 Tg小鼠中,脂筏明显含有APP及其CT碎片、二聚Aβ肽、载脂蛋白E、tau、PS1、BACE-1和neprilysin(NEP)(54). 实验证据表明,PS和APP基因的突变,如PS1 280Glu→Ala和APP 717Val→Phe,会改变酶底物的特异性,并促进生成可能保留在膜中的更长、更疏水的Aβ肽。其他类PS-天冬氨酸蛋白酶可能会裂解APP,产生大量的aβ肽,如FAD患者和表达FAD的转基因动物中产生的肽(55). 马尔切西(56)最近提出,在AD中,通过aβ序列(aβ29-37:Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly)中存在的跨膜Gly-X-X-Gly基序的侧对侧相互作用,可以在膜中保留大量二聚体aβ肽。柯兰和恩格曼(57)提示这些膜内序列基序通过促进螺旋-螺旋稳定相互作用促进二聚化,因为它发生在可溶性的螺旋-螺旋结构中。AβThr43和Thr48的存在进一步稳定了螺旋间氢键。疏水性跨膜结构域的比例增加以及老化过程引起的膜基本脂质成分的变化可能促进较长Aβ肽的保留(58,59). 在AD中,自噬空泡和自噬小体有大量神经炎性堆积,表现为致密和多层小体,其起源仍不清楚,但部分原因可能是较长的aβ肽和/或较长的膜结合aβ肽的滞留。AD自噬空泡中APP、CT片段和分泌酶的存在支持了这一论点(60). 自噬性程序性细胞死亡可能是由未折叠、错误折叠或交替折叠的蛋白质及其毒性积累引起的内质网应激所致61). 这种“凋亡”可能由脑血管病相关的缺血和缺氧损伤触发(61). 最近出现了强有力的论据,声称死亡细胞中的自噬活性可能确实是一种生存策略(62).
由于FAD PS1 280Glu→Ala中γ-分泌酶功能障碍,存在较大且更疏水的Aβ肽,这可能会对脑蛋白酶的转换产生深远影响。其中,NEP和胰岛素降解酶(IDE)的基因缺失导致小鼠体内Aβ的积累,显示出肽底物的典型尺寸限制(63–65). 在NEP(一种跨膜和筏相关的金属内肽酶)的情况下,由于对活性位点的访问限制,生理底物限制在3-4 kDa(66). 反过来,胰岛素降解酶会形成一个空腔,其大小刚好可以容纳胰岛素单体。这种酶能够降解与神经退行性变相关的淀粉样肽,包括Aβ、ABri和ADan,几乎完全以无序单体状态存在(67–69). 因此,突变体PS1产生的较长的Aβ肽可能由于其单体大小或更可能由于其快速二聚化的高趋势而逃脱蛋白水解清除。此外,越来越长的疏水性C末端可选择性地保留在脂质双层中,从而对蛋白质水解施加强烈的热力学限制。
Aβ肽及其长亲属的持续净积累将极大地干扰细胞膜功能,导致严重且不可逆的神经元损伤。如果这一假设被证明是正确的,那么对AD病理生理学的理解以及早期和新型治疗干预措施的设计将增加一个新的维度。
鸣谢
我们欠Daniel Brune和John Lopez的技术建议。我们也非常感谢David Rumsey开发了氨基酸质量搜索(AAMS)程序。本研究得到了国家老龄研究所(NIA)拨款的支持:RO1 AG-19795、NIA亚利桑那州阿尔茨海默病核心中心P30 AG19610、NIA印第安纳州阿尔茨瓦纳州阿尔茨海默病中心P30 AG10133、亚利桑纳州阿尔兹海默病研究联合会、阿尔茨海默氏病协会和COLCIEN-CIAS项目1115-343-19127以及CODI,哥伦比亚麦德林安提奥基亚大学神经科学小组2007-2008年可持续发展计划。
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