美国国家科学院程序。1998年6月9日；95（12）：6624–6629。
苔藓抑制素1合成类似物的设计、计算机建模、溶液结构和生物学评价
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保罗·温德
†斯坦福大学化学系，斯坦福，CA 94305-5080；和‡亚利桑那州立大学癌症研究所和化学系，亚利桑那州坦佩市，邮编85287
杰夫·德布拉班德
†斯坦福大学化学系，斯坦福，CA 94305-5080；和‡亚利桑那州立大学癌症研究所和化学系，亚利桑那州坦佩市，邮编85287
帕特里克·G·哈伦
†斯坦福大学化学系，斯坦福，CA 94305-5080；和‡亚利桑那州立大学癌症研究所和化学系，亚利桑那州坦佩市，邮编85287
Juan-Miguel Jimenez公司
†斯坦福大学化学系，加利福尼亚州斯坦福94305-5080；和‡亚利桑那州立大学癌症研究所和化学系，亚利桑那州坦佩市，邮编85287
迈克尔·F·T·科勒
†斯坦福大学化学系，斯坦福，CA 94305-5080；和‡亚利桑那州立大学癌症研究所和化学系，亚利桑那州坦佩市，邮编85287
布莱斯·利帕
†斯坦福大学化学系，斯坦福，CA 94305-5080；和‡亚利桑那州立大学癌症研究所和化学系，亚利桑那州坦佩市，邮编85287
清敏公园
†斯坦福大学化学系，斯坦福，CA 94305-5080；和‡亚利桑那州立大学癌症研究所和化学系，亚利桑那州坦佩市，邮编85287
卡斯滕·西登比德尔
†斯坦福大学化学系，斯坦福，CA 94305-5080；和‡亚利桑那州立大学癌症研究所和化学系，亚利桑那州坦佩市，邮编85287
乔治·R·佩蒂特
†斯坦福大学化学系，斯坦福，CA 94305-5080；和‡亚利桑那州立大学癌症研究所和化学系，亚利桑那州坦佩市，邮编85287
†斯坦福大学化学系，斯坦福，CA 94305-5080；和‡亚利桑那州立大学癌症研究所和化学系，亚利桑那州坦佩市，邮编85287
由加利福尼亚州斯坦福大学John I.Brauman沟通
摘要
苔藓抑制素是从海洋苔藓动物中分离出来的一个独特的新型癌症化疗候选家族。尽管其治疗活性的生化基础尚不清楚，但这些大内酯对蛋白激酶C（PKC）同工酶具有高度亲和力，竞争PKC上的佛波酯结合位点，并刺激激酶活性在体外和体内与佛波酯不同，它们不是第一阶段的肿瘤促进剂。描述了一类独特的合成苔藓抑制素类似物的设计、计算机建模、NMR溶液结构、PKC结合和功能分析。这些类似物（7b、7c和8）保留了苔藓抑制素的假定识别域，但通过删除和修改C4-C14间隔区而简化。模拟原型（7a）的计算机模拟表明，它优先存在于两个不同的构象类别中，其中一个与bryostatin 1的晶体结构密切相关。合成类似物7c的溶液结构通过核磁共振波谱测定，发现与之前报道的苔藓抑制素1和10的结构非常相似。类似物7b、7c和8与PKC同工酶紧密结合K我分别为297、3.4和8.3 nM。与相应的苔藓抑制素衍生物一样，对照7d表现出弱PKC亲和力，衍生物9也表现出弱的PKC亲和性，缺少间隔区。与苔藓抑制素一样，缩醛7c也表现出显著的在体外对几种人类肿瘤细胞株的生长抑制活性（1.8–170ng/ml），为开发简化的、可合成的苔藓抑制素类似物迈出了重要一步。
苔藓抑制素（图。)包含一组结构和功能新颖的20个大环内酯，最初从水母以及其他海洋苔藓动物，因为它们对小鼠P388淋巴细胞白血病具有显著活性(1). 随后，这些大环已被确定为癌症化疗的重要先导，并且bryostatin 1最近已进入治疗黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤和肾癌的二期人类临床试验（有关bryostation临床试验的最新信息，请访问网站：http://cancernet.nci.nih.gov/prot/protsrch.shtml). 这种化合物继续在一期临床试验中进行评估，单独或与其他药物联合用于治疗其他类型的癌症(2). 苔藓虫毒素独特的生物化学特性使人们对苔藓虫毒素更感兴趣。已发现Bryostatin 1可促进骨髓祖细胞的正常生长(三,4)，以提供体内防止电离辐射的正常致死剂量(5)作为免疫刺激物，影响白细胞介素2和干扰素的正常产生。
苔藓抑制素和选定的半合成衍生物的结构和PKC结合亲和力。
不幸的是，苔藓蛋白的天然丰度低以及与分离相关的困难阻碍了阐明其分子作用模式和加速其临床开发的努力。苔藓抑制素1的初步分离B.内毒碱例如，需要500公斤湿动物(1,2)获得足够的材料用于结构表征和生物测定。这种和其他苔藓抑制素的后续分离产生的产量从10−3到10−8% (2). 为了生产足够的材料用于人类治疗B.内毒碱目前正在调查中(6). 然而，目前用于研究和临床研究的这些分子的供应仍然有限。
苔藓抑制素治疗效果的生化基础尚未建立。然而，已知苔藓抑制素在低纳米到微微摩尔浓度下竞争性地抑制佛波酯与蛋白激酶C（PKC）的结合(7)并刺激类似的激酶活性在体外(8–10). 然而，值得注意的是，它们只诱导了典型佛波酯反应的一个子集，并阻止了它们本身不会引发的佛波酯的作用。示例包括HL-60早幼粒细胞白血病细胞的分化(8,11)在Friend红白血病细胞中(12)、JB6小鼠表皮细胞增殖(13)C3H10T1/2细胞中花生四烯酸的释放(14)，和小鼠皮肤中的第一阶段肿瘤促进(15). 了解这些和其他苔藓抑制素活性的结构基础，对于开发更简单、临床上更优的化疗药物以及促进其作为PKC信号转导级联中探针的应用至关重要。
1988年，Wender、Blumberg和Pettit集团(16)据报道，提出的PKC激动剂的药效学模型可用于合理解释结构不同的苔藓抑制素、佛波酯和1,2-二酰基-锡-甘油（DAG），内源性PKC激活剂(17)，可能会竞争PKC上的同一站点。虽然竞争性结合不需要存在共同的药效团，但该假设为合理化这些天然产物的结合行为提供了一个可测试的起点。为此，将相对刚性的佛波酯中所有可能的杂原子三元的原子间距与DAG低能构象中的杂原子三元间距进行了比较。该分析的最佳相关性映射到苔藓抑制素1的C1羰基、C19羟基和C26羟基（图。). 确定了其他相关性，并从可比性到弱相关性进行了排序。
DAG的计算低能构象(顶部)佛波的x射线结构(中部)和苔藓抑制素1(底部). 垂直虚线连接异质原子（潜在识别元素），其相对空间坐标在每个结构中都是可比较的。亲脂性区域在DAG中被截断，在phorbol中被省略以便于澄清。该区域由DAG中的酯类（R）、佛波醇中的C12、C13双酯类和苔藓抑制素1的C4-C16片段占据。
由此产生的假设和当前研究的起点是，苔藓抑制素的A环和B环可以部分用作间隔物，远程控制假定需要识别的组（C1、C19和C26）的方向和流动性。这一假设与当时已知的苔藓蛋白结构-活性关系一致，并与最近对新发现的苔藓蛋白的研究一致(18,19). 值得注意的是，它还在从头开始的新型PKC活化剂的设计(20). 这个假设现在已经被用于设计简化的、完全合成的苔藓抑制素类似物，这些类似物保留PKC结合亲和力，并且在所研究的案例中，具有显著水平的在体外细胞生长抑制活性。
材料和方法
合成Bryostatin类似物和对照品。
化合物7b-d日,8和9（参见图。)根据图中概述的一般策略制备和纯化。一个所有化合物的分析数据与其报告的结构完全一致。实验细节将在单独的披露中描述(21).
(一个)制备苔藓抑制素大环缩醛类似物的聚合合成策略。虚线对应于分隔符域中可能不需要的键。(B类)苔藓抑制素1（蓝色）晶体结构与第7页（黄色）计算为高于全球最小值2.17 kcal/mol。叠加结构的C1、C19和C26氧原子之间的均方根偏差=0.131Å。为了清楚起见，苔藓抑制素1中的C20侧链被描述为醋酸盐。
合成苔藓蛋白类似物和对照的结构和PKC结合亲和力。
PKC结合分析。
PKC是从大鼠脑细胞液的DEAE-纤维素色谱和1%Triton萃取颗粒组分中获得的，如前所述(22). 根据Tanaka的说法，合成类似物与PKC同工酶混合物的竞争结合是进行的等。(23). 简单地说，为每次分析新鲜制备标准缓冲溶液，其中含有50 mM Tris●HCl、100 mM KCl和2 mg/ml BSA。将此混合物的一部分和1 mg/ml磷脂酰丝氨酸（PS；1,2-二-（顺-9-十八烷基）-锡-甘油-3-磷酸-我-将丝氨酸、Avanti Polar Lipids）添加到其中，并在0°C下将所得混合物超声四次，持续30秒，两次循环之间暂停30秒。向剩余缓冲液中添加≈0.1单位/ml的PKC。通过依次添加60μl含PS缓冲液、200μl含PKC缓冲液、20μl待测化合物和20μl 150 nM C20标记佛波-12,13-二丁酯制备反应瓶([三H] PDBu）（杜邦/NEN）在2.5%二甲基亚砜/H中2O解决方案。将未标记的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯以17μM的浓度添加到用于测量非特异性结合的试管中。将小瓶在37°C下孵育100分钟，然后放在冰上5分钟。按照前面的描述过滤和清洗样品(23). 在计数之前，将过滤器在3ml细胞闪烁闪烁液中浸泡12小时。每种浓度的三次试验平均每分钟计数。
核磁共振波谱和分子模型。
质子核磁共振谱记录在500 MHz的C6D类6或CDCl三在25°C下运行的Varian Unity 500上的溶液。从其原始格式转换后，对自由感应衰减（FID）进行处理并用费利克斯95.0（Biosym Technologies，San Diego），位于Silicon Graphics R5000 Indy工作站上。在傅里叶变换之前，每个FID被零填充到1024个点，并用90°相移正弦贝尔平方函数切趾。在t1中转换之前，将FID的第一个点乘以0.5。
通过使用双量子滤波相关光谱（DQF-COSY）、全相关光谱（TOCSY）和核过热效应光谱（NOESY）进行质子分配。100-ms混合时间谱中的NOESY交叉峰体积在费利克斯，归一化为最弱的交叉峰，然后分为强、中、弱类别。归一化前，甲基交叉峰体积除以三(24). 然后将交叉峰强度转换为核间距约束，并应用于化合物分子模拟产生的最低能量结构第七章。强约束可以在1.8和2.5Å之间变化，没有能量惩罚，中等约束在1.8和3.5 \8491；之间，弱约束在1.8到5.0 \8491]之间。然后，使用宏模型v.4.5(25). 在所有计算中，均采用广义Born/溶剂可及表面积模型模拟氯仿溶剂化(26). 将该结构在10 ps的温度下达到900°K，然后以1.0 fs的时间步长平衡10 ps。在随后的100-ps模拟中，也在900°K下以1.0-fs的时间步长对1000个结构进行了采样。然后，通过使用截断牛顿共轭梯度最小化的最大2000次迭代，将这些结构最小化至收敛。NMR约束在整个最小化过程中保持不变。
结果和讨论
模拟设计。
由于天然苔藓抑制素的可用性有限，以及在其选择性修饰中遇到的困难，迄今为止，结构活性研究大多局限于天然产物本身和密切相关的衍生物。然而，这些研究揭示了一些与类似物设计相关的信息。比较苔藓抑制素1–10与PKC的结合亲和力表明1和R2组对绑定的影响不大（图。，条目1-10）。类似地，C13-C30烯烃的还原或环氧化衍生的类似物仍然保持显著的亲和力（图。，条目11和13）。相反，C13-C30和C21-C34烯烃均被氢化的类似物显示出明显降低的亲和力（图。，条目12）。C19羟基的消除（图。，条目16和17）或C26的立体化学反演（图。，条目14）对亲和力有更显著的影响。最后，C26的乙酰化消除了显著的结合（图。，条目15）。综上所述，这些观察结果表明，苔藓抑制素的结合仅受到C4-C16结构域变化的轻微影响，但由于C19-C26结构域的变化而显著降低。
苔藓抑制素的构效关系和计算机建模（图。)表明苔藓蛋白样识别可以在保留识别结构域功能但包含简化间隔物（C4-C16）的类似物中实现。原则上，间隔物的结构可以根据需要改变，以简化合成并调节药代动力学性能，前提是其在定位和限制识别域中的功能作用得以保持(19). 第一代模拟系列（图。一个)旨在探索这一假设。为了系统地比较间隔区在这些设计类似物中的作用和苔藓抑制素的作用，在设计的类似物中苔藓他汀的识别域保持不变。分子C7-C13外围的功能性被完全消除，C14被氧气取代以促进合成。得到的目标大环缩醛（图。一个,1)被视为中间体的酸催化分子内缩醛化的产物秒-醛类2由一般结构的羧酸酯化而成4带有苔藓抑制素片段三从合成的角度来看，这种方法在几个重要方面具有吸引力：首先，大缩醛化代表了一种独特的(28)以及通过控制C15的相对立体化学来封闭23元内酯的潜在通用解决方案；第二，该策略高度收敛，并且在合成后期没有要求的碳-碳键结构，第三，所提议的化学预计可以容忍多种缩醛4无并发症。最后，该策略可能用于通过涉及片段耦合的组合合成创建模拟库三含有各种现成的酸-缩醛。
为了快速评估设计的类似物与苔藓抑制素之间的构象对应性，首先通过分子力学计算确定类似物的构象，并与已知的苔藓他汀类的固态和溶液结构进行比较。原型化合物第7页在MM2力场的多整合模式中，对其构象空间进行了广泛的搜索宏观模型v.4.5(25). 该模拟物的一万个构象被随机生成，并通过使用截断牛顿共轭梯度最小化。
水溶剂化通过广义Born/溶剂可及表面积模型进行模拟(26). 共发现2784个独特构象，并将其最小化以达到良好的收敛性，这一过程的有效性显而易见，因为在最后2500次迭代中，只发现了两个在全球最小值2 kcal/mol范围内的新构象。该分析中的最低能量结构分为两个不同的构象家族，随后对这两个家族与已知的bryostatin 1固态结构和bryostatin10密切相关的溶液结构进行了相似性检查(29). 有趣的是，相对于苔藓抑制素1，由于C3羟基和相邻的C1内酯羰基之间的特征氢键，含有计算出的全球最小值的每个家族成员都发生了实质性的扭曲。然而，第二个低能构象家族的成员开始以高于全球最低值1.9 kcal/mol的能量出现，显示出与天然苔藓抑制素一致的内部氢键模式；也就是说，C19半缩酮参与了与C3醇的跨环氢键，而C3醇又与B环吡喃的氧原子相类似。图。B类描述了苔藓抑制素1的晶体结构，该晶体结构叠加在第二构象家族的代表成员上，计算如下第7页能量比全球最低值高2.17 kcal/mol。比较两种结构之间的潜在药效元素（C1、C19和C26杂原子），均方根偏差为0.131Å。有趣的是，将苔藓抑制素1（C20醋酸盐）提交到相同的计算中，产生了两个低能构象家族，与在第7页因此，无论是从视觉上还是通过计算，都发现所设计的类似物的低能量计算结构与bryostatins的实验建立的结构表现出良好的一致性。
Bryostatin类似物7亿和第7页c根据图。一个(21). 醋酸盐7天被合成为阴性对照，类似于相应的苔藓抑制素衍生物，其不与PKC显著结合。模拟8其中，通过用构象限制取代A环吡喃，间隔区进一步简化第三级-采用类似的合成策略构建了丁基。最后，化合物9它包括识别域而不是间隔域，作为一个附加控件来测试间隔子在定位识别元件中的作用（见图。).
缩醛7c的溶液结构。
将设计化合物的计算结构与已知的苔藓抑制素溶液和固态结构进行比较，作为快速初步筛选潜在模拟候选物的方法。合格候选人的合成随后允许直接确定其解决方案结构。为此，乙缩醛第7页c进行了一系列高场一维和二维质子核磁共振实验。苔藓抑制素10的溶液结构(29)作为参考点。两者之间的密切关联1CDCl中H的化学位移和多重性三之间第7页c在大多数假定的药效区（C16到C23）都观察到了苔藓抑制素10。由于结构中脂肪族质子数量较多，导致信号分辨率在1至2 ppm之间（四甲基硅烷的下场）缺乏第7页c相对于苔藓抑制素10，通过将溶剂改为C来解决6D类6在这种情况下，所有关键共振及其分裂模式都是唯一指定的。
这些共振表现为一组尖锐的谱线，其耦合常数与旋转平均值显著偏离，表明化合物第7页c在室温下主要以单一、稳定的构象存在。化合物的相敏核过热效应光谱（NOESY）、全相关光谱（TOCSY）和双量子滤波相关光谱（DGF-COSY）第7页c单位：C6D类6分析以确定整个结构中质子之间的同一性和类别距离。根据该分析，生成了33个独特的内部距离约束，随后应用于最初为缩醛计算的最低能量构象第7页在分子动力学模拟之前，该计算的结构与NMR数据不一致，因为大于0.25Å违反了五个施加的距离约束（图中的虚线。一个). 随后的受限气相分子动力学模拟和最小化确定了95个独特的构象，其中6个构象在全球最小值的2 kcal/mol范围内。低能构象满足所有适用于它们的核过热效应约束，并与已发表的bryostatin 1的晶体结构以及bryostatin10的溶液结构进行了比较。正如在晶体结构中观察到的那样，观察到两个关于C25-C26键的旋转体，一个是能量最低的构象，另一个能量高2.1 kcal/mol。将能量最低的构型与bryostatin 1的晶体结构叠加（全重原子比较），均方根偏差为0.506Å。通过将我们的最低能量构象的药效原子叠加到苔藓抑制素1中的对应物上，计算出的均方根偏差为0.313Å，这表明两者在向PKC呈现假定药效三联体的能力方面具有显著的相关性。
(一个)最初计算的最低能量构象立体图第7页虚线连接的质子的核间距与观测到的核过热效应数据不一致第7页c（违规≥0.5Å）(B类)构象立体图第7页2.1 kcal/mol（高于全球最小值）与核磁共振数据完全一致。
合成Bryostatin类似物和对照的PKC结合测定。
类比7亿,第7页c、和8和控件7天、和9对其结合大鼠脑PKC同工酶混合物的能力进行了评估。选择C20标记的佛波醇-12,13-二丁酸竞争试验来测定这些化合物的相对结合亲和力，因为关于PKC结合标准的信息丰富，其以前用于测定苔藓抑制素的结合，以及其现成可用性。类比7亿,第7页c、和8被发现以特定的饱和方式与抑制常数结合(K我)如图所示。.控制7天和9在所研究的范围内，对PKC表现出最好的弱亲和力。在每种情况下，K我根据50%的抑制浓度（IC50)从平均cpm与[模拟]的非线性回归图中获得。非特异性结合在[phorbol 12-肉豆蔻酸13-醋酸盐]=17μM下测定Kd日第页，共页[三H] 在相同的分析条件下，PDBu被测定为1.3 nM(23).
模拟物7c的生长抑制活性。
有关表中所示已知癌细胞系评估的详细信息请参阅参考。31.
表1
| 人癌细胞系 | GI公司50微克/毫升 |
|---|
| BXPC-3（胰腺） | 6.0 × 10−3 |
| NCI-H460（肺非小细胞） | 1.2 × 10−1 |
| FADU（咽部） | 1.8×10−3 |
| DU-145（前列腺） | 1.7 × 10−1 |
讨论
苔藓抑制素能引起一系列独特的生化反应，有望用于癌症治疗。然而，对它们的分子作用模式知之甚少。由于材料的缺乏以及选择性修饰复杂的苔藓抑制素功能的困难，结构活性研究受到了限制。本研究旨在提供有关苔藓抑制素的结构特征的见解，这些结构特征有助于苔藓生长抑制素与PKC的结合。这种方法反过来又有助于建立所需的信息，以设计更简单、潜在更优的临床候选者，这些候选者可以通过实际合成来实现。
由于这些海洋衍生的大环在哺乳动物生物化学中的作用部分取决于其识别元件的空间阵列，因此最初进行了计算机搜索，以确定苔藓抑制素和其他与苔藓生长抑制素竞争与PKC结合的化合物中可能的常见识别元件。基于距离相关性，确定了几种常见功能的阵列并进行了优先排序，最佳相关性对应于苔藓抑制素1中C1、C19和C26处的氧，这一发现与当前的结构-活性关系相一致。该分析进一步表明，苔藓抑制素结合是两个功能域之间的合作事件：一个是识别域，包含与受体接触的元素，另一个是间隔子，用于正确定位和约束识别域。
设计的类似物7亿,第7页c、和8合并bryostatin 1的识别域和简化间隔区替代物。原型可用构象的广泛计算分析第7页，不同于第7页c只有在C20时，为了便于计算，才显示出对两个低能构象家族的偏好，其中一个相当好地对应于已知的bryostatin 1固态结构。该计算机评估提供了潜在活性类似物的快速筛选，在这种情况下，导致选择和合成7亿,第7页c、和8.缩醛的溶液结构第7页c揭示了C14被氧取代和C7、C8、C9和C13取代基的缺失不会改变大环相对于天然产物的基态构象偏好。为了确定这些变化是否对活性构象或识别构象产生影响，我们评估了设计的类似物在与氚化佛波酯竞争中结合PKC同工酶的能力，这是一种以前针对苔藓抑制素建立的分析方法。所有三个类似物都与K我s低至3.4和8.3毫摩尔。这些亲和力与观察到的苔藓抑制素1-10的亲和力一致（图。)并且比测定的苔藓抑制素17和18的亲和力更好。在一种情况下（模拟第7页c)到目前为止的研究表明，有可能对几种人类肿瘤细胞株进行生长抑制的功能性检测，并观察到对所研究的细胞株具有显著活性。
在类似物的修饰上观察到与苔藓抑制素的进一步相似性。因此，与bryostatin 1一样，C26醋酸盐7天在分析条件下没有检测到结合。模拟量缺乏有效绑定9表示仅识别元素是必要的，但不足以进行识别。正如预期的那样，还需要间隔符来定向和约束识别特征，以实现最佳关联。亲和力急剧下降7亿相对于第7页c表明C3羟基在这一取向中起着重要作用。分子模拟研究与模拟物的溶液结构第7页c与跨环氢键网络的形成相一致，该氢键网络包括C3和C19羟基以及B环缩醛氧基之一。
模拟8,其缺乏A环但由于叔丁基的定向影响而呈现与其他类似物相似的计算构象，是所检测的类似物中最简单的并且也表现出强大的结合活性。
苔藓抑制素的低天然丰度和临床用途使得除了最简单的结构改变外，几乎无法进行其他所有的改变，留下了许多关于其细胞效应的分子基础的问题尚未解决。简化类似物可以模拟苔藓抑制素的溶液和结合行为，在一种情况下，其功能活性是基于苔藓他汀结构设计真正简单、临床上优越的药物的重要步骤。此外，这些可合成的化合物允许进一步评估苔藓抑制素活性的结构基础及其分子作用模式。
致谢
我们感谢Jean-Charles Chapuis博士和Jean M.Schmidt博士对已知癌细胞系评估的帮助，感谢Daria Mochly-Rosen教授为我们的结合分析提供实验室设施。国家卫生研究院向P.a.W.（CA31845）提供了资金支持。向J.D.（富布赖特-霍斯/北大西洋公约组织）、P.G.H.（国家卫生研究院）、J.-M.J.（富布莱特/西班牙教育和科学部）、C.-M.P.（韩国科学与工程基金会）、C.S.（亚历山大·冯·洪堡基金会）提供博士后研究金，感谢Eli Lilly获得M.F.T.K.和B.L.研究生奖学金。
工具书类
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