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生殖生物内分泌。2008; 6: 4.
在线发布2008年1月29日。 数字对象标识：10.1186/1477-7827-6-4
预防性维修识别码：PMC2254628型
PMID：18230131

雌二醇和FSH对性腺机能减退（hpg）小鼠睾丸成熟的影响

海伦·贝恩斯,#1 玛格丽特·奥恩瓦格乌,#1 格雷厄姆·哈斯蒂,#1 罗曼·怀尔斯,#1 特里·M·梅休,#1和弗朗西斯·埃布林（Francis JP Ebling）通讯作者#1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

性腺机能减退（hpg）小鼠被广泛用作研究精子发生的内分泌调节的动物模型。众所周知，用雌二醇对这些GnRH缺乏小鼠进行慢性治疗可以诱导睾丸成熟，并在质量上恢复正常的精子发生。当前研究的目的是调查雌二醇的这些作用是直接作用于睾丸，还是通过自相矛盾地刺激垂体FSH分泌而间接作用。

方法

最初，使用Western blot和免疫组织化学分析hpg小鼠的组织，以确定雌二醇的潜在作用部位。在主要研究中，通过组织学分析和Leydig体视学定量评估，用雌二醇植入物或每天注射重组人FSH或两者结合治疗hpg小鼠50天，以确定雌二醇是否会对FSH的睾丸发育产生添加或协同作用，支持细胞和生殖细胞增殖。

结果

Western blot分析显示，hpg小鼠睾丸和垂体提取物中有适当分子量的ERα免疫反应带，免疫组织化学研究证实，hpg鼠垂体前叶细胞、Leydig和肾小管周细胞的细胞核中有ERα。组织学和形态计量学分析表明，雌二醇单独治疗在促进支持细胞生成和生精上皮增殖方面与FSH一样有效，从而产生伸长的精子细胞。雌二醇和FSH联合治疗没有比单独治疗产生更大的效果，尽管增加FSH的剂量显著增加了生精小管体积和睾丸重量，并在相同的时间范围内进一步增加了支持细胞数量。相反，雌二醇导致精囊湿重显著增加，而FSH对该组织无影响，也不增强雌二醇的作用。

结论

由于ERalpha受体在hpg小鼠的垂体中大量表达，而雌二醇对睾丸发育的影响不超过FSH，因此我们得出结论：雌二醇对雄性小鼠睾丸发育的作用是在雄性小鼠垂体中进行的马力（hpg）小鼠主要是通过刺激垂体释放FSH。

背景

传统上，哺乳动物精子发生的调节被认为依赖于促性腺激素和雄激素的相互作用，然而，最近在实验啮齿动物和人类中的观察表明，雌激素在这一过程中起着额外的作用[[1,2]查看]。人类研究表明，睾丸中存在芳香化酶，以及体细胞和生殖细胞室中ERβ的两个剪接变异体的表达，尽管ERα的表达似乎仅限于传出小管[三]. 芳香化酶或ERα基因失活突变的男性所表现出的不育现象说明了雌激素在男性生殖中的重要性[4]. 小鼠已被广泛用于研究雌激素在男性生殖中的作用，实际上是雌激素受体的靶向缺失[5]和芳香化酶[6]首次证明雌激素在精子生成中的作用。与灵长类动物相比，ERα在小鼠的Leydig细胞中大量表达，尽管ERα基因敲除雄性小鼠的不育可能是由于传出小管中的液体吸收不足，而非主要的精子生成缺陷所致[7]. ERα在啮齿动物睾丸间质细胞中的作用尚不清楚。

我们和其他研究小组已经利用了性腺机能减退(马力（hpg）)鼠标[8]由于GnRH基因截短，不能产生成熟的GnRH-十肽，作为研究雌激素在男性生殖功能中作用的模型[9,10].幽门螺杆菌小鼠之所以不孕，是因为它们不产生促性腺激素，因此睾丸的发育不会超过新生儿期[11]. 众所周知马力（hpg）LH小鼠可以刺激类固醇生成[12]用FSH和雄激素治疗可以诱导质量正常的精子发生[13,14]. 然而，我们也观察到，单用慢性雌二醇治疗就可以诱导马力（hpg）老鼠[9,15,16]尽管这与垂体和血清FSH浓度的矛盾增加有关。这种雌激素诱导的FSH分泌增加的重要性尚不清楚：目前尚未确定直接作用于睾丸水平的雌二醇是否足以在睾丸中产生定性精子发生马力（hpg）雌二醇在诱导精子发生中的作用是否更间接，是否通过FSH生成的增加发生。

本研究旨在探讨雌二醇直接（睾丸）和间接（垂体）作用在刺激精子发生中的相对贡献。该研究的最初目的是使用免疫组织化学和Western blotting定位垂体和睾丸中的ERα马力（hpg）为了确定该突变株中促进精子发生的雌激素作用的推测位点，我们对小鼠进行了研究。主要目的是测量雌二醇对小鼠睾丸发育和精子发生的定性和定量影响马力（hpg）有无rhFSH的小鼠。如果雌二醇和rhFSH联合治疗被证明比这两种单独治疗更有效（即有协同作用），我们可以得出结论，这些激素发挥不同的作用。然而，如果雌二醇和rhFSH联合治疗的效果与较高剂量的rhFSH的预期效果一样（即相加效应），那么我们可以得出结论，雌二醇很可能通过刺激FSH分泌发挥作用。

方法

概述

所有动物程序均由诺丁汉大学地方伦理审查委员会批准，并按照1986年《动物科学程序法》（英国）（项目许可证PPL 40/2372）执行。物质管理遵循实验动物科学协会（LASA）指南[17]. 成人马力（hpg）雄性小鼠通过其微阴茎、缩短肛门生殖器距离和小阴囊进行鉴定。

Western blot程序

垂体和睾丸马力（hpg）和年龄匹配的同窝小白鼠（大约135天大）被置于pH7.4（PBS）的磷酸盐缓冲盐水中，其中含有蛋白酶抑制剂。组织在冰上超声处理3×10秒，在1300 RPM下离心5分钟，提取上清液并在-20°C下保存，直至使用。睾丸和垂体蛋白在100°C和5%巯基乙醇存在下培养5分钟。然后立即将样品放在冰上冷却并装入凝胶中。蛋白质样品在10%SDS凝胶上分离，并转移到硝化纤维素膜（Amersham）上。在25°C的PBS中用5%的牛奶（漫威）封闭膜1小时，然后在4°C的温度下孵育过夜，用识别ERα的兔子体内培养的多克隆抗血清（美国圣克鲁斯MC-20的1:50稀释）。过夜培养后，在PBS中清洗膜，然后在PBS/Tween 20中清洗，然后用1:2000抗兔IgG过氧化物酶结合物培养（英国普尔Sigma）。蛋白质的可视化是通过超级信号系统实现的（Pierce，美国）。通过将其流动性与已知分子量的标准标记蛋白进行比较，估算蛋白质的分子量。通过分析胶片扫描并使用NIH图像计算机包进行密度测定，评估由条带强度指示的蛋白质相对量。

免疫组织化学

将睾丸和垂体组织浸入4%多聚甲醛中固定，然后将其包埋在石蜡中，以便在切片机上切割5μm的切片。然后将安装好的切片放在二甲苯中去除石蜡，然后放在浓度降低的乙醇中，然后用自来水使组织再水化。垂体和睾丸切片在0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6中通过全功率（650W）微波2×5分钟进行抗原回收。为了研究雌激素受体分布，在磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液中清洗切片，并用3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶。在PBS中清洗后，用正常山羊血清（Vector Labs，Peterborough，UK）封闭样品，然后用之前验证过的兔多克隆ERα抗血清（MC-20，Santa Cruz）在4°C下以1:50的稀释度孵育过夜。切片在PBS中洗涤，并与生物素化的抗兔IgG在25°C下孵育1小时，然后加入抗生物素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（Elite ABC:Vector Labs，Peterborough，UK）。用二氨基联苯胺（DAB）孵育显示免疫反应性，将切片浸泡在自来水中停止反应。切片用曙红复染。通过增加乙醇浓度进行脱水后，使用DePeX安装介质（英国普尔Sigma）安装切片。

对于使用类固醇生成酶3β羟基类固醇脱氢酶（3βHSD）的表达来鉴定Leydig细胞的研究，遵循了类似的方案，但省略了用3%过氧化氢进行预处理。切片在爱丁堡大学Ian Mason教授捐赠的多克隆兔抗3βHSD抗血清（稀释度为1:1000）中孵育过夜，该抗血清先前已验证可用于啮齿动物[18,19]. 切片在PBS中清洗，并在25°C下用生物素化抗兔IgG孵育1小时，然后用荧光素-亲和素复合物孵育（Vector Labs）。在PBS和蒸馏水中清洗后，用Vectashield（Vector Labs）覆盖切片，用指甲油密封，并在徕卡DMRB荧光显微镜下观察。

实验方案：雌二醇和rhFSH的作用

全身麻醉下，男性马力（hpg）如前所述，将3至7个月大的小鼠植入含有2%雌二醇（n=11）或胆固醇（n=15）的皮下胶囊[9]. 的子组马力（hpg）然后每天用1 IU的rhFSH（n=6）或载体（n=5）治疗携带雌二醇植入物的小鼠50天。相应地马力（hpg）每天用1 IU rhFSH（n=5）或5 IU rhFS H（n=6）或载体（n=5）治疗含胆固醇植入物的小鼠50天。rhFSH的剂量基于之前的剂量反应研究中使用的剂量马力（hpg）小鼠和被设计为产生亚最大（1 IU/天）和最大（5 IU/日）效应[14]. 实验第50天，在最后一次FSH治疗后2 h，在终末麻醉（静脉注射戊巴比妥钠）下通过心脏穿刺采集血样。在以13000 rpm转速旋转之前，让血液在室温下凝结，然后将血清样本存储在-20°C下，直到进行分析。采集血液后，切除垂体、睾丸、附睾和精囊，修剪脂肪和结缔组织并称重。将一个睾丸放置在Bouin的固定液中，然后将其嵌入石蜡中，以便在切片机上切割5 um切片，并用苏木精-伊红染色，以进行光学显微镜分析。

形态计量（体视学）分析

主要形态计量学的目的是估计睾丸内生精小管和生精上皮的体积。为此，体视学估计[20,21]通过多阶段系统均匀随机抽样设计，对组织图像进行随机定位和定向。随机选择每个睾丸约四个切片，每个切片六个显微镜视野进行分析。通过OpenLab软件（英国考文垂Improvision）在徕卡DM4000B亮场显微镜上采集图像，并使用测微计刻度作为外部校准标准，以×1000的最终放大倍数打印场。睾丸成分的体积密度通过随机叠加一个透明网格来确定，该网格由一个二次数组中的35个测试点组成。测试点落在一个给定的睾丸上，其成分被汇总到所有部分的所有领域。落在给定成分（小管、管腔、上皮）上的总点数除以落在睾丸切片上的总点数，可以对其体积密度进行无偏估计。随后根据体积密度和处理后的睾丸体积的乘积估计每个睾丸的每种成分的绝对体积。为了评估小管体积的变化是否归因于口径或总长度的变化，在使用无偏计数框架选择小管后测量曲精小管的平均直径[20]. 对于椭圆轮廓，测量短轴。为了指示生殖细胞发育的程度，一名对实验治疗一无所知的观察者也对收集用于体视学分析的每个睾丸的24个区域进行了评分，以表明存在的最成熟的生殖细胞类型。

对Leydig和Sertoli细胞数量进行定量评估，以获得净细胞增殖的相关测量。通过随机叠加禁止线无偏计数框架获得估计值[20]在3β-HSD（莱迪格细胞标记物）免疫染色组织的放大显微照片上，或在苏木精和伊红染色的组织切片上，支持细胞的细胞核可以通过其特征位置和外观（例如三分核仁[11]). 利用这个计数框架，利用睾丸单位面积的细胞核轮廓数来获得基于模型的单位体积组织（Nv（v）). 为此，我们获得了每种细胞类型的细胞核截面厚度（T，总是5μm）和平均直径（D，μm）的估计值。为了估计平均核直径，测量了随机选择的10个核的直径。在明确假设每个细胞都包含一个细胞核的基础上，根据以下公式计算出每个睾丸的特定细胞类型总数（N）

N=否v（v）×V睾丸

其中V睾丸表示睾丸体积（cm三)睾丸质量（g）除以组织密度计算。后者为1.05 g/cm三[22].

激素分析

使用商用人类FSH ELISA试剂盒（IDS Ltd UK）测量血清FSH浓度，以确定重组hFSH循环水平，使用大鼠FSH免疫放射试剂盒（IDS Ltd U K）测量总循环FSH浓度（即内源性和外源性）。小鼠垂体提取物或未经处理的野生型小鼠血清中的FSH浓度没有与大鼠标准液平行稀释，并且大鼠IRMA中的rhFSH具有实质性交叉反应性（1 mIU rhFSH读数约为大鼠FSH标准液的1.5 ng/ml）因此，所有实验样品在同一稀释度下进行单次分析比较，必须将其视为相对浓度而非绝对值。大鼠FSH IRMA的最低检测限为0.2 ng/ml，灰烬内CV为2.0%。人类FSH ELISA的最低检测限为1 mIU/ml，灰烬内CV为7.5%。

统计分析

使用单因素方差分析法对器官重量数据进行分析，然后使用Tukey的多重比较测试（Prism v4.0，GraphPad Software，加州圣地亚哥）。FSH值采用Kruskal-Wallis非参数检验（也称为Prism）进行分析，因为当值低于检测限时，他们被分配该值用于统计分析。

结果

垂体和睾丸中的雌激素受体免疫反应

Western blot显示成人垂体组织提取物中有一条清晰的ERα免疫反应带马力（hpg）分子量约为64KDa的小鼠（图。​（图1，1，顶部）。与马力（hpg）4只和4只野生型小鼠。在两种睾丸提取物中约64 KDa处也观察到ERα免疫反应带马力（hpg）和野生型小鼠，再加上分子量稍低的条带，这可能是降解产物（图。​（图1，1，底部）。在基因型之间没有观察到两条带丰度的统计差异（图。​（图1）。1). 免疫组织化学显示ERα在垂体前叶细胞中有明确的核定位马力（hpg）小鼠和野生型产仔伴侣（图。​（图2）。2). ERα免疫反应性在睾丸Leydig细胞和管周类肌细胞的细胞核中均显著马力（hpg）鼠标（图。​（图2，2，左）。年龄匹配的野生型睾丸中的Leydif细胞也表达ERα免疫反应性（图。​（图2，2右），一些肾小管周细胞也表达ERα（图。​（图2，2，右侧）。此外，在野生型小鼠中，基底膜附近的细胞有一些阳性的免疫染色，细胞核形状不规则，几乎肯定是支持细胞（图。​（图2，2，右侧）。当用兔IgG替换初级抗血清时，免疫反应信号缺失（图。​（图2，2，左下角）。

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ERα免疫反应的Western blot分析性腺机能减退患者垂体（顶部）和睾丸（底部）提取物的Western blot分析示例(马力（hpg）)和年龄匹配的野生型（+/+）小鼠。膜用MC-20 ERα抗血清（Santa Cruz）染色。

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ERα的免疫组织化学定位马力（hpg）老鼠性腺机能减退小鼠垂体（上面板）或睾丸中ERα的免疫组织化学定位示例(马力（hpg）（左面板）或年龄匹配的野生型小鼠（+/+，右面板）。注意，许多垂体前叶细胞在两者中表达核ERα免疫反应马力（hpg）和+/+小鼠。ERα-ir在睾丸的Leydig细胞（lc）和肾小管周围肌样细胞（pt）中丰富马力（hpg）在野生型小鼠的某些支持细胞（sc）中也存在。左下角的面板显示了一项对照研究，其中省略了初级抗血清，该部分来自马力（hpg）睾丸。所有显微照片均以相同的放大倍数拍摄，因此左上角面板中的20μm比例尺适用于所有面板

雌二醇和rhFSH对生殖器官重量的影响

单用雌二醇或单用1 IU rhFSH治疗可显著增加睾丸重量（P<0.05）高峰值与经车辆处理的对照组相比（图。​（图3A）。3A级). 雌二醇加1 IU rhFSH联合治疗并没有使睾丸重量增加到高于单独治疗的水平（图。​（图3A）。3A级). 高剂量rhFSH治疗（5IU）确实使睾丸重量进一步增加，因此睾丸重量是对照组的四倍（P<0.001；图。​图3，三，顶部）。低剂量（1IU）rhFSH治疗不会显著增加附睾重量（图。​（图3B），第3页)而在接受雌二醇的两组中（即单独使用雌二醇或使用1 IU rhFSH的雌二醇）有显著增加（P<0.001，图。​图3B）。3B公司). 5 IU rhFSH治疗后附睾重量增加较小（图。​（图3B）。3B公司). 同样，在接受雌二醇治疗的两组中，精囊重量都有很大增加（P<0.001，图。​图3C），3C公司)而FSH治疗均未影响该器官（图。​（图3C3C公司).

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器官重量和血清FSH浓度马力（hpg）雌二醇和/或rhFSH治疗后的小鼠.配对睾丸（顶部）、附睾（第二组）和精囊（中间组）的湿重，以及男性FSH的血清浓度马力（hpg）人类FSH ELISA（第四组）和大鼠RIA（底部）中测定的小鼠。用含有胆固醇（chol）或2%雌二醇（E）的皮下植入物对各组小鼠进行50天的治疗，并每天用1或5 U重组人FSH（Gonal-F™）作为载体进行治疗。数值为组平均值±SEM，组大小如图所示*与胆固醇植入物和载体治疗组相比，P<0.05、**P<0.01和***P<0.001；@与所有其他组相比，P<0.01。

血清FSH浓度

使用人类FSH试剂盒对血清样本进行的检测证实，在接受rhFSH治疗的小鼠中可以检测到rhFSH（图。​（图3D），三维)高剂量处理（5IU）产生的FSH循环浓度显著升高（P<0.01；图。​图3D）。三维). 在大鼠放射免疫分析FSH试验中，rhFSH具有显著的交叉反应性，因此我们无法在接受rhFSH治疗的动物中直接测量内源性小鼠FSH。然而，可以做出一些推论。在马力（hpg）只服用雌二醇的小鼠，循环FSH显著增加（p<0.05）（图。​（图3E）。第三方). 血清FSH总量也显著高于马力（hpg）与对照组相比，接受1IU rhFSH的小鼠马力（hpg）组（图。​（图3E），第三方)，并且在接受5IU的小鼠中成比例增加（图。​（图3E）。第三方). 在高峰值同时接受雌二醇和1 IU rhFSH的小鼠FSH也比对照组成比例增加马力（hpg）只接受雌二醇的小鼠。

睾丸组织学

测试来自马力（hpg）用胆固醇植入物和载体治疗的小鼠具有典型的未发育外观，小直径生精小管缺乏管腔（图。​（图4，4，表​表1）1)支持细胞通常位于基底层附近（图。​（图4）。4). 未观察到圆形和伸长的精子细胞，该对照组的生殖细胞发育未超过初级精母细胞阶段。所有其他组的睾丸切片马力（hpg）用雌二醇或rhFSH治疗的小鼠表明，睾丸重量的增加反映了生精上皮的发育和管腔的存在（图。​（图4，4，表​表1）。1). 大多数小管中都存在伸长的精子细胞，尽管在接受高剂量FSH治疗的组中，这些精子细胞在小管中更为丰富（图。​（图4）。4). 形态计量分析显示，与胆固醇+载体治疗的对照组相比，单独使用雌二醇和单独使用1 IU/天rhFSH都会增加生精上皮的体积，从而增加总小管体积马力（hpg）老鼠（表​（表1）。1). 与对照组相比，联合雌二醇+1 IU/天rhFSH也显著增加了这些参数，但与对照组比较，联合治疗并未显著增加小管发育的任何参数马力（hpg）只接受其中一种治疗的小鼠（表​（表1）。1). 与单独或联合使用雌二醇和1 IU/天rhFSH治疗相比，每天使用5 IU rhFSH确实显著增加了生精上皮体积、小管体积和总小管长度（表​（表1）。1). 3β-HSD免疫染色显示，睾丸间质中富含Leydig细胞马力（hpg）鼠标（图。​（图5），5)但只有每天用5IU的rhFSH处理后，Leydig细胞数量才显著增加（图。​（图6，6，下面板）。相反，单用雌二醇治疗显著增加了支持细胞的数量（图。​（图6，6，上部面板），高剂量的rhFSH治疗，以及雌二醇加1 IU rhFSH/天的联合治疗（图。​（图66).

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雌二醇和/或rhFSH治疗后的睾丸组织学睾丸组织学的典型例子马力（hpg）小鼠接受含有胆固醇（chol）或2%雌二醇（E）的皮下植入物，并每天用载体、1或5U重组人FSH（Gonal-F™）治疗50天。比例尺代表50μm。

表1

睾丸的形态分析马力（hpg）雌二醇和/或rhFSH治疗后的小鼠

胆固醇载体雌二醇载体胆固醇1 IU FSH雌二醇1 IU FSH胆固醇5IU FSH
N个三4455
车身重量（g）29.7 ± 3.230.0 ± 2.529.5 ± 2.529.8 ± 2.829.0 ± 3.2
睾丸重量（mg）12.0 ± 0.124.2 ± 1.8一27.2 ± 3.3一27.2 ± 1.7一46.6 ± 4.8美国广播公司
管子直径（μm）50.3 ± 0.771.6 ± 3.3一66.3 ± 1.6一72.3 ± 2.2一77.3 ± 3.5一
小管容积（μl）3.8±0.711.2 ± 1.1一12.1±0.3912.2 ± 1.1一21.8 ± 2.3美国广播公司
小管长度（m）2.2 ± 0.42.8 ± 0.23.3 ± 0.23.0 ± 0.24.6 ± 0.3美国广播公司
小管（睾丸百分比）76.9 ± 9.991.3 ± 1.492.5 ± 0.8一87.9 ± 1.594.0 ± 0.7一
sem外延vol（μl）3.6 ± 0.69.9 ± 0.9一11.0 ± 0.2一10.5 ± 0.9一19.4 ± 2.0美国广播公司
流明体积（μl）0.1 ± 0.11.3 ± 0.31.6 ± 0.31.1 ± 0.12.4 ± 0.4

数值为组平均值±SEM，n=进行完整体视学分析的小鼠数量。一与胆固醇+载体相比P<0.05，b条与雌二醇+载体相比P<0.05，c（c）与胆固醇+1 IU FSH相比，P<0.05。sem-epith-vol=生精上皮体积

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Leydig细胞马力（hpg）雌二醇和/或rhFSH治疗后的小鼠3β-HSD免疫染色的代表性实例马力（hpg）接受含有胆固醇（chol）或2%雌二醇（E）的皮下植入物的小鼠，以及每天用载体、1或5U重组人FSH（Gonal-F™）治疗50天。比例尺代表50μm。

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小鼠睾丸间质细胞和支持细胞的数量马力（hpg）雌二醇和/或rhFSH治疗后的小鼠睾丸中Leydig细胞（顶部）和Sertoli细胞（底部）数量的估计马力（hpg）用含有胆固醇（chol）或2%雌二醇（E）的皮下植入物治疗50天的小鼠，以及每天用1或5U重组人FSH（Gonal-F™）载体治疗的小鼠。数值为组平均值±SEM，组大小如图所示*与胆固醇植入物和载体治疗组相比，P<0.05和***P<0.001。

讨论

这些研究的第一个目的是证实ERα受体在垂体和睾丸中的表达马力（hpg）老鼠。补充免疫组化和Western blot研究表明，ERα免疫反应性存在于垂体和睾丸马力（hpg）小鼠的水平与野生型产仔鼠相当。免疫组化研究表明，ERα在大鼠睾丸中的分布马力（hpg）小鼠仅限于间质和肾小管周围肌样细胞中假定的Leydig细胞，这与以前对小鼠的研究一致[23]. 有趣的是，我们还观察到野生型同窝配偶睾丸基底膜附近的角核内ERα免疫反应，这些很可能是支持细胞。以前对小鼠的研究没有报道ERα在该细胞类型中的表达[23]. 我们的观察表明，雌二醇可能通过ERα在垂体和睾丸中发挥作用马力（hpg）鼠标。我们无法用免疫组织化学方法证实ERβ是否也在睾丸中表达马力（hpg）由于抗血清的技术局限性，小鼠的免疫印迹确实显示了两种组织中具有适当分子量ERβ的蛋白带马力（hpg）和野生型小鼠（数据未显示）。以前的研究为小鼠睾丸中ERβ的表达提供了相当矛盾的证据，一些研究表明ERβ在成年小鼠的Leydig细胞和延长精子细胞中的表达[24]，其他人报告小鼠睾丸中ERβ表达的发育性下降，成人中未检测到免疫反应[25]. 小鼠正常睾丸功能似乎不需要ERβ表达[26]，我们的研究集中于ERα受体的作用。

我们再次观察到雌二醇治疗对睾丸的强烈刺激作用马力（hpg）小鼠，与我们之前的研究一致[9,15,16]. 目前的研究表明，雌二醇的这些作用在定性和定量上与FSH治疗的效果非常相似。众所周知，单独使用FSH治疗会诱导睾丸发育马力（hpg）老鼠[14]，尽管我们观察到了更大程度的发展。在我们的研究中，两种剂量的rhFSH都能诱导生殖细胞发育到精液细胞伸长期，也能在小管中形成小管腔，而Singh和Handelsman[14]据报道，相同剂量的rhFSH在相同的持续时间（50天）内主要刺激有丝分裂前生殖细胞增殖，相对较少的细胞发展到圆形精子阶段。我们观察到雌二醇和高剂量rhFSH治疗后支持细胞数量显著增加，Singh和Handelsman[14]未检测到。考虑到雌二醇治疗明显提高了循环FSH浓度，这一观察结果与FSH在小鼠支持细胞增殖中的关键作用一致[27]最近的研究表明，FSH产生的基因诱导马力（hpg）小鼠增加了支持细胞的产生[28]. 我们还观察到马力（hpg）用大剂量FSH治疗的小鼠。FSH对Leydig细胞活性和形态的刺激作用早在马力（hpg）小鼠和可能反映由支持细胞旁分泌产物介导的间接作用[29]. 不幸的是，在各种实验治疗后，没有足够的血清可用于测量循环睾酮浓度，因为我们认为更重要的是测量我们收集的血清中的内源性和重组FSH，以验证我们的治疗方案的疗效。在我们之前的研究中，我们无法测量两种血清睾酮的可检测增加[9,15]或睾丸内睾酮[15]在雌二醇治疗后，但根据以前的研究马力（hpg）FSH治疗可能会增加小鼠睾丸雄激素的产生[29].

虽然基于模型，但我们对细胞数量的估计与我们自己和他人使用更稳健、基于设计的体视学程序获得的结果一致[9,27,30,31]. 当前研究与辛格和汉德尔斯曼的研究之间的一个重要区别[14]在后一项研究中，50天的rhFSH治疗是在青少年（第21天）开始的，而我们治疗马力（hpg）成年老鼠。我们之前观察到，在马力（hpg）可能反映出GnRH依赖性促性腺激素分泌水平较低的小鼠[1]. 因此，我们的实验性rhFSH治疗可能与略高水平的睾丸发育或雄激素生成的内源性水平相叠加，并考虑到雄激素在小鼠精子发生中的关键作用[13,15]这似乎很可能解释了当前研究与先前研究之间的差异。

当前研究的关键结果是，雌二醇和rhFSH的联合作用不对生精上皮产生更大程度的刺激，仅用两种激素进行治疗。这与我们最初的预测和对新生大鼠的研究相反，在新生大鼠中，苯甲酸雌二醇和纯化的人类FSH联合治疗会对生精上皮的发育产生影响，这些影响在单独使用任何一种激素治疗后都不会出现，包括增加小管直径，管腔的诱导和粗线期精母细胞数量的增加[32]. 观察到较高剂量的rhFSH（每天5IU）治疗确实增加了生精上皮和小管的体积，这进一步表明，缺乏添加剂或协同作用并不是已经达到最大增殖率的结果。鉴于我们观察到的雌二醇和rhFSH在质量和数量上的相似性，我们得出结论，雌二醇对睾丸功能的主要作用是间接的，通过刺激FSH的释放马力（hpg）小鼠实验模型。虽然雌二醇的这种刺激作用在雄性哺乳动物中似乎是一种矛盾的反应，但可以证明的是，在本研究和之前的研究中，循环FSH水平增加了马力（hpg）鼠标。这种对男性的矛盾影响并不是由于马力（hpg）鼠标[16]相反，它似乎反映了这样一个事实：马力（hpg）老鼠在新生儿期被捕[1,11]当类固醇负反馈途径尚未形成时。值得注意的是，雌二醇对小鼠雄性生殖道的某些作用是很可能是直接行动。在当前的研究中，我们观察到雌二醇治疗使精囊的湿重显著增加，而FSH对该组织没有影响，也没有增强雌二醇的作用。这与之前在马力（hpg）鼠标[9]这也为雌二醇对前列腺的直接影响提供了证据[9].

最近的证据表明，雌二醇在胎儿和新生儿早期发育期间在睾丸中发挥自分泌或旁分泌作用，从而抑制Leydig细胞产生雄激素[33]. 也许雌二醇的内分泌作用在马力（hpg）小鼠在协调早期发育方面具有生理作用。虽然雌二醇的产生在睾丸内起到延缓早期雄激素生成的作用，但在垂体中也起到刺激FSH生成的作用并因此促进早期支持细胞增殖。因此，当青春期黄体生成增加并刺激雄激素生成时，小管内的体细胞补体已经建立，并将支持雄激素驱动的精子发生。

竞争性利益

提交人声明他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

HB对生精小管进行组织加工和体视学分析，MOW进行体内研究，Western Blot和ER免疫组化，GRH和RAW对3β-HSD进行免疫染色，并对Leydig和Sertoli细胞数进行定量评估，TMM开发体视学程序并监督其应用，FJPE管理项目并编写和修订手稿。

致谢

这项工作得到阿斯利康合作基金和BBSRC委员会学生奖学金（HB）的支持。我们感谢Serono（英国）赠送重组人FSH（Gonal-F™），感谢爱丁堡大学Ian Mason教授赠送抗3β-HSD抗血清，并感谢匿名审稿人对原稿初稿的积极批评和深刻评论。

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文章来自生殖生物学和内分泌：RB&E由以下人员提供BMC公司