背景
IV型粘液表皮病（MLIV）是一种遗传性神经发育和神经变性疾病，影响患者的多种功能[1-三]。患者脑部MRI扫描发现的胼胝体很薄，表明胚胎大脑发育不足[1，三]。导致视神经萎缩和失明的神经退行性过程发生在所有儿童患者身上[4]。患者患有严重的精神运动障碍，大多数人不会走路和说话。MLIV患者也有失血，或壁细胞无法分泌胃酸[5，6].
MLIV患者的细胞表现出一些缺陷。许多组织，包括角膜、胃壁细胞和胰腺，都有含有纤维蛋白颗粒内含物、多层膜和水泡的大液泡[5-10]。MLIV细胞在这些大液泡中积累的内吞脂质的降解和/或转运方面表现出延迟[11-15]。MLIV成纤维细胞也显示出溶酶体与质膜融合的缺陷，以响应钙的治疗2个+离子载体离子霉素[16].
MLIV中突变的基因是MCOLN1型，编码粘蛋白-1（ML1）[17-19]。ML1被预测有六个跨膜结构域，是第2组瞬时受体电位（TRP）相关的阳离子通道[20]。ML1是一种非选择性、pH调节的阳离子通道，优先选择单价阳离子[21-24]。皮肤成纤维细胞中ML1的一个可能的细胞生物学功能是作为质子泄漏通道，调节内体/溶酶体酸化的速率[25]。ML1定位于晚期内吞室，其过度表达导致这些结构异常[15，22，23，26-28].
ML1首先被转运到质膜，随后被内吞并靶向溶酶体[15，27-29]。然而，ML1的转运也依赖于AP-1适配器复合体，而不是AP-2或AP-3适配器复合体。这表明存在第二条从跨高尔基网络到溶酶体的直接转运途径[30]。ML1可以在第一个细胞内环中被裂解，并且两个部分仍然相关。目前尚不清楚这种裂解是发生在内体/溶酶体还是在转高尔基网络中，以及它是蛋白质失活所必需的还是其正常加工的一部分[22，30].
哺乳动物中还有另外两种粘蛋白。粘蛋白-1、粘蛋白-2和粘蛋白-3相互作用形成同源和异源多聚体[27]。尽管粘蛋白-3的定位需要与其他两种同源物中的任何一种相互作用，但这三种蛋白质都定位于晚期内体/溶酶体[27]。因此，目前尚不清楚MLIV患者的一些症状是否是由于缺乏ML1导致粘蛋白-3定位错误所致。虽然粘蛋白-2没有已知的突变，可变地址(弗吉尼亚州)小鼠粘蛋白-3突变导致耳聋和色素缺陷[31，32]。由于缺乏ML1的DT40 B淋巴细胞没有表现出明显的溶酶体缺陷，因此粘蛋白之间可能存在一些功能冗余，而相比之下，显性阴性形式的ML1或粘蛋白-2的过度表达导致了MLIV细胞的大空泡缺陷特征[33].
CUP-5是唯一的秀丽隐杆线虫粘蛋白是晚期内体溶酶体生物生成所必需的[34，35]。类似于MLIV的细胞异常杯-5导致一些细胞中大液泡的积累和胚胎死亡，主要是由于发育/组织退化缺陷[34，36，37]。粘蛋白功能是保守的，因为人类ML1或粘蛋白-3的表达可以修复这两种缺陷。粘脂蛋白-2尚未进行测试。
在这项研究中，我们试图更准确地定义ML1功能的位点，并确定ML1水平降低的细胞中的主要缺陷。我们使用RAW264.7细胞，因为秀丽线虫巨噬细胞具有精细的溶酶体转运途径，使我们能够可视化溶酶体运输的中间步骤。在这里，我们表明ML1是巨噬细胞内动态晚期内体/溶酶体贩运事件所必需的。
结果
ML1与不同内吞室标记物的共定标
我们制作了一个稳定的RAW264.7克隆，其中GFP-ML1在CMV启动子的控制下表达。在这些稳定的克隆中，大约70%的细胞表达GFP-ML1。与CUP-5类似的GFP融合功能齐全，可修复以下所有缺陷杯-5（空）蠕虫，而与人类ML1相似的融合可以修复成纤维细胞中的MLIV缺陷[16，35].
为了确定GFP-ML1的亚细胞定位，我们使用针对早期内体蛋白HRS、在晚期内体和高尔基体之间循环的M6PR、晚期内体/溶酶体脂质LBPA和溶酶体标记物LAMP1的抗体对这些细胞进行免疫染色（图。) [38-42]。与先前将ML1定位于其他细胞类型的晚期内吞隔室的研究一致，我们发现GFP-ML1与晚期内吞标记物的共同定位更广泛（图。) [15，22，26-28]。GFP-ML1与LBPA共定位的高发生率是一个新结果，表明ML1主要定位于含有内囊泡和板层的腔室[41，43].
ML1与不同隔间标记物的共同定位.A）稳定GFP-ML1（绿色）细胞的共焦图像，用于标记所示的标记（红色）。LBPA面板中的嵌件是单个隔间的放大。棒材为10μm。B） 定量与面板A中每个标记重叠的GFP-ML1染色分数。条形代表标准偏差。C） 用mCherry-ML1（mCH-ML1，红色）和GFP或YFP融合到指示标记（绿色）的细胞共转染的共焦图像。棒材为10μm。D） 量化与面板C中每个标记重叠的mCherry-ML1染色分数。条形图表示标准偏差。
我们还将红色荧光蛋白mCherry与ML1的氨基末端进行了功能融合。为了确定该融合蛋白显示与GFP-ML1相同的定位模式，我们用mCherry-ML1和GFP-ML或YFP-Lamp1表达质粒共同转染细胞。与Lamp1免疫荧光染色一致，mCherry-ML1与YFP-Lamp1和GFP-ML1共同定位（图。). 然后我们用表达质粒的mCherry-ML1和GFP-Rab7（晚期内体/溶酶体）共同转染细胞[44]。我们发现mCherry-ML1与GFP-Rab7有显著的共定位。
GFP-ML1与内吞底物的共放大
为了进一步确定ML1在溶酶体室中的定位和行为，我们检测了GFP-ML1相对于内吞可溶性溶质的定位。我们用BSA-AlexaFluor 594脉冲稳定的GFP-ML1克隆1分钟，然后在不同的追踪时间后固定细胞（图。). 从这一分析中可以得出四个主要结论。首先，我们发现BSA-AlexaFluor 594和GFP-ML1之间的共同定位逐渐增加，在15分钟左右达到峰值，24小时内保持不变（图。). 其次，总是有一些舱室含有BSA-AlexaFluor 594，但没有贴上GFP-ML1标签，即使在24小时的时间点，当所有BSA-AlexaFluor 584都在终端舱室中时也是如此。第三，我们看到许多小管从GFP-ML1标记的隔间发出（图。). 第四，我们看到BSA-AlexaFluor 594在直径为300-500 nm的亚结构中的浓度，这些亚结构通过小管连接到内吞室。GFP-ML1定位于这些内吞室，包括小管和附着的亚结构（图。，15分钟变焦）。这些GFP-ML1标记的小室数量显示BSA-AlexaFluor 594的极化分布，在实验的时间过程中增加，在15分钟的时间点达到每细胞约15+/-2的峰值，在以后的时间点保持不变。这些结构不是GFP-ML1过度表达的结果，因为它们在未转染的RAW264.7细胞中很明显（数据未显示）。
GFP-ML1与可溶性内吞分子的共放大.A）稳定GFP-ML1（绿色）细胞的共聚焦图像，这些细胞内吞BSA-AlexaFluor 594（红色）1分钟，然后在固定前追逐指定的时间。15分钟时间点的底部面板表示顶部面板中所示区域的放大倍数。未经认可的面板中的棒材为5μm。B） 定量BSA-AlexaFluor 594与GFP-ML1在不同追踪时间的共定位程度。条形图代表标准偏差。C） 稳定GFP-ML1（绿色）细胞的共聚焦图像，这些细胞内吞右旋糖酐-罗丹明（红色）1分钟，然后在固定前追逐指定的时间。一些追逐时间未显示。15分钟时间点的底部面板表示顶部面板中指示的区域的人工放大。未经认可的面板中的棒材为5μm。D） 定量不同追踪时间下右旋糖酐-罗丹明与GFP-ML1共定位的程度。条形图表示标准偏差。
我们还通过GFP-ML1标记的隔间检查了液相标记物右旋糖酐-罗丹明的进展[45]。我们基本上看到了使用右旋糖酐-罗丹明时的相同行为，包括不同时间点的共定位程度，以及右旋糖胺-罗丹胺极化分布的亚结构的出现（图。).
ML1水平降低导致脂质向高尔基体的转运延迟
我们制作了两个独立分离的RAW264.7稳定克隆，称为LS9和LS10，表达组成组蛋白H1启动子的shRNA并靶向MCOLN1型.级别MCOLN1型mRNA显著减少，分别为LS9和LS10中RAW264.7水平的19.8+/-3.2%和18.7+/-1.7%（图。). 的级别MCOLN2型mRNA没有变化，LS9和LS10中RAW264.7水平分别为97.4+/-2.5%和102.6+/-3.1%（图。). 我们无法检测到MCOLN3号机组重复Northern blot实验中的RNA（数据未显示）。
MCOLN1型RNAi克隆.A）对从RAW264.7、LS9或LS10细胞中分离出的15μg总RNA进行Northern blot。探测了相同的过滤器MCOLN1型、剥离和再保护GAPDH公司再次剥离并重新保护MCOLN2型.B）用吖啶橙（AO）染色的RAW264.7、LS9和LS10细胞的共焦图像。棒材为6μm。C） AO染色隔间和右旋糖酐-regon Green（OG）染色隔间的染色强度定量。条形图表示标准偏差。D） RAW264.7、LS9和LS10细胞的共聚焦图像，其终末小室预先加载了右旋糖苷蓝（DEX-CB，红色）。添加BSA-Body-LacCer（B-LacCer，绿色）30分钟，并在固定前追赶指定时间。箭头表示两个标记的共同定位。棒材为5μm。
降低RAW264.7细胞中的ML1水平不会导致晚期内体/溶酶体区室的过度酸化。这是通过用pH-敏感染料吖啶橙对细胞进行染色或用pH敏感的内吞底物右旋糖酐-Regon Green 488（图。). 先前的研究得出了关于MLIV成纤维细胞溶酶体超酸性的相互矛盾的数据[25，46，47]。在我们的RAW264.7 RNAi系中，末端区室缺乏过酸作用可能是由于残留的ML1活性、粘脂蛋白-2的冗余和/或ML1的假定pH调节功能可能是组织特异性的。
MLIV成纤维细胞也显示荧光类脂类似物Body-LacCer从内吞室向高尔基体的转运延迟[12，15]。为了确定RAW264.7细胞是否有类似缺陷，我们用右旋糖酐-半胱氨酸蓝预先标记RAW2647、LS9和LS10细胞的末端隔室，用Body-LacCer脉冲细胞30分钟，并追踪45分钟或90分钟。45分钟时，所有Body-LacCer均到达RAW264.7的核周高尔基体，且未与右旋糖苷蓝共存（图。). 相反，虽然一些Body-LacCer到达LS9和LS10细胞中的核周高尔基体，但Body-LacCer与右旋糖酐-半胱氨酸蓝色标记的隔间仍存在显著的共定位，表明Body-LachCer从这些隔间中退出的延迟（图。).
ML1水平降低导致内吞蛋白向溶酶体的转运延迟
先前的结果表明，CUP-5在秀丽线虫是将内吞的BSA从晚期内体运输到溶酶体所必需的[35]。为了确定溶酶体转运是否也需要ML1，我们在第一天用荧光标记培养细胞4小时，然后在没有标记的情况下培养24小时，用BSA-AlexaFluor 594装载RAW264.7、LS9或LS10细胞的末端隔室。大约5%的LS9和LS10细胞显示出一个显著增大的末端室，其中含有荧光内吞标记（图。). 在缺乏ML1特异性抗体的情况下，我们无法确定这些抗体是否代表ML1水平降低最多的细胞，或者是否所有细胞中ML1的缺失都会产生类似的低渗透表型。据报道，DT40 B淋巴细胞中ML1的完全丢失不会影响终末小室的大小[33].
蛋白质的转运和内吞缺陷MCOLN1型RNAi克隆.A）RAW264.7、LS9和LS10细胞的共聚焦图像，这些细胞的末端隔室预先加载了BSA-AlexaFluor 594（BSA-AF 594，红色）。将BSA-AlexaFluor 488（BSA-AF 488，绿色）添加到细胞中10分钟，并在固定前追踪所示时间。棒为5μm。B） HEL的蛋白印迹被内吞5分钟并追踪指定时间。C） 相对于0时间点保留在单元格中的HEL的量化。条形图表示两个独立分析的标准偏差。
为了确定内吞蛋白向LS9和LS10细胞的终末隔室的转运是否存在延迟，我们将BSA-AlexaFluor 488脉冲送入终末隔室内预先加载了BSA-AlexaFluor 594的细胞中（图。). 经过10分钟的脉冲后，大多数BSA-AlexaFluor 488已到达RAW264.7细胞中BSA-AlexaFluor 594染色的终末隔室。这种在野生型细胞中的共同定位在追踪15或30分钟后保持不变（图。). 相反，在LS9和LS10细胞中，在10分钟脉冲后，BSA-AlexaFluor-488和BSA-AlexaFluor-594染色的小室没有共同定位，无论是正常大小的小室还是放大的小室（图。)，经过15分钟的追逐，一些BSA-AlexaFluor 488已经到达了终端隔间，这一共同定位在30分钟内完成（图。).
在观察到溶酶体转运的延迟后，我们询问内吞蛋白的降解是否存在延迟。因此，我们用母鸡卵溶菌酶（HEL）脉冲细胞5分钟，并在不同的追逐时间测定细胞中剩余的HEL。与RAW264.7细胞相比，LS9和LS10细胞在不同的追踪时间显示内吞HEL的细胞水平增加（图。). BSA转运和HEL降解结果表明，ML1是内吞蛋白高效转运到溶酶体所必需的。
MCOLN1 RNAi RAW264.7细胞中扩大区室的性质
为了确定MCOLN1型-RNAi克隆，我们用BSA-AlexaFluor 594预加载其终末隔室，并对这些细胞进行各种标记物染色（图。). M6PR或HRS均未对增大的空泡进行染色，表明它们不具有典型的早期或晚期内体特征。这些扩大的液泡染色LAMP1和Rab7，这与它们的溶酶体性质一致。此外，他们对LBPA进行了强烈染色，这与从MLIV患者中分离出来的细胞相一致，这些细胞的隔室扩大，包括多泡膜和多层膜[5-10].
中扩大隔间的性质MCOLN1型RNAi克隆RAW264.7和LS9细胞的共聚焦图像，其末端隔室预先加载了右旋糖酐-罗丹明（红色），并对所示标记进行了染色（绿色）。除了转染到野生型和MCOLN1型-单元格。棒材为5μm。
ML1水平降低导致MHCII向质膜的转运延迟
GFP-ML1定位于晚期内吞LBPA阳性的隔室，可能是脂质和内吞蛋白质从这些隔室有效排出所必需的。主要组织相容性复合体II（MHCII）定位于抗原提呈细胞的LBPA阳性晚期内胚体/溶酶体隔室，并在这些细胞的刺激下被转运至质膜[48，49]。为了确定这种转运步骤是否需要ML1，我们首先确定MHCII是否在正常生长的细胞中与GFP-ML1共定位，或者在向细胞中添加100μg/ml的LPS一天后。先前已经证明，这种LPS治疗可以诱导RAW264.7巨噬细胞分化为树突样细胞，同时上调MHCII和其他树突状细胞表面标记物的质膜水平[50，51].
在没有LPS的情况下，我们在RAW264.7巨噬细胞的GFP-ML1阳性囊泡中看到一些MHCII表达（图。). 向这些细胞中添加LPS导致所述的细胞大小和形态增加，MHCII表达显著增强。在这些LPS处理的细胞中，MHCII与GFP-ML1共同定位于小管上皮细胞室（图。). 由于细胞细胞质中残留着大量的MHCII，我们无法清楚地看到MHCII被转运到质膜上。
GFP-ML1与MHCII的共定标及MHCII向质膜的转运.A）固定和渗透GFP-ML1细胞的共聚焦图像，在没有LPS的情况下或在100μg/ml LPS中48小时后共同染色以检测MHCII（红色）和GFP-ml（绿色）。棒材为10μm。B） RAW264.7、LS9和LS10细胞的共聚焦图像染色以检测表面MHCII，无论是在没有LPS的情况下还是在100μg/ml LPS中24小时后。所有图像均采用相同的曝光和放大倍数拍摄。C） 图B所示的LPS处理的细胞中质膜上MHCII水平的定量。条形图表示每种菌株至少60次测量的标准偏差。D） 固定和渗透RAW264.7、LS9和LS10细胞的共聚焦图像在100μg/ml LPS中共同染色24小时后检测MHCII（红色）和LBPA（绿色）。棒材为10μm。
为了确定MHCII运输到RAW264.7细胞的质膜是否需要ML1，我们用LPS处理RAW264.7、LS9和LS10细胞一天，并对细胞进行染色以检测质膜上的MHCII。在没有脂多糖的情况下，三个品系都没有出现任何表面染色。在存在LPS的情况下，RAW264.7、LS9和LS10显示质膜染色，表明MHCII在所有三条线中都被运输到质膜（图。). 然而，LS9和LS10细胞质膜上的MHCII水平大约比RAW264.7细胞低四倍（图。). 我们在使用两种不同的抗MHCII抗体以及在存在或不存在IFN-γ的情况下看到了相同的结果，IFN-γ升高了MHCII总水平（未公布的数据）。RAW264.7、LS9和LS10细胞表达的细胞内MHCII水平与渗透后免疫荧光染色测定的细胞内水平相似（图。). 在所有三种细胞系中，MHCII定位于LBPA阳性的细胞内隔室（图。). 这些结果表明，在没有ML1的情况下，MHCII向质膜的转运效率降低。
讨论
巨噬细胞，比如秀丽线虫体腔细胞是高度内吞的细胞。由于这些细胞中溶酶体途径的动态性质，在技术上更容易描述溶酶体转运中的中间步骤。在这项研究中，我们表明ML1主要定位于LBPA阳性溶酶体腔室，并且是从这些腔室有效运输至少两种分子所必需的。
ML1在RAW264.7巨噬细胞中的定位
ML1主要定位于LBPA阳性、Lamp1阳性和Rab7-阳性的隔室。过度表达的GFP-ML1与早期（HRS-阳性）和晚期（M6PR-阳性）内胚体标记物的有限共定位与ML1被转运到表面，随后被内吞并通过各种内胚体转运，然后在这些LBPA阳性的小室中积累一致[15，27-29]。目前尚不清楚ML1在早期步骤中是否具有单独的功能，例如在HRS阳性或M6PR阳性的内体中。我们认为这是不可能的，因为如果从一个部门到另一个部门的贩运有所延误，那么我们预计由此产生的扩大结构将是这两个部门的混合体。ML1水平的降低导致扩大的隔间，这些隔间对HRS或M6PR都不染色，但对LBPA、Lamp1和Rab7都染色。
RAW264.7巨噬细胞内吞溶质的转运
在转运到溶酶体的过程中，在中间结构中发现了内吞的BSA和葡聚糖，其中BSA和右旋糖酐集中在由小管连接到母体隔室的亚结构中。GFP-ML1定位于所有这些结构。这与之前在体腔细胞中观察到的情况惊人相似[35]。亚结构的直径为300至500纳米，考虑到实验的时间进程，很可能是含有溶酶体内腔蛋白浓度的亚室。这些“芽”的剪断会将溶酶体导向的蛋白质从LBPA阳性的其他隔室中分离出来。这是或类似于在体外和活细胞中观察到的杂交细胞器中溶酶体的重组[52，53].
虽然还不清楚BSA、右旋糖酐和其他很可能的分子是如何集中在亚结构中的，但这些亚结构在拓扑上与质膜的内吞内陷相似。在这些亚结构中内吞溶质浓度的一个可能机制是使用清道夫受体，该受体将结合管腔分子和细胞质适配器，以将这些受体集中在亚结构中。ML1不太可能具有这样的功能，因为昆虫体腔细胞中缺乏CUP-5并不会阻止BSA在亚结构中的浓度，尽管它确实阻止了BSA从母细胞室中的分离[35].
如果GFP-ML1主要发现于终末前腔室，那么为什么我们总是检测到GFP-ML与内吞分子定位的高共同发生率，即使在追踪时间较晚。我们认为这是因为终末溶酶体室不断与晚期内胚体室融合，并将其内容物传递给后者，形成所谓的杂交细胞器[52，53]。如上所述，出芽和裂变反应用于重组溶酶体[52，53].
即使在摄取荧光BSA后的24小时追逐时间，也总是有一些末端区室含有内吞示踪剂，并且不染色GFP-ML1。我们认为这些代表了GFP-ML1被灭活的致密核心溶酶体，可能是如之前所述的组织蛋白酶B介导的裂解[22]。这些致密核心溶酶体持续与早期GFP-ML1阳性细胞室融合。
溶酶体转运途径中的ML1需求
我们表明，降低ML1水平会导致Body-LacCer向高尔基体、内吞蛋白向终末室和MHCII向质膜的转运延迟。如前所述，Body-LacCer在转运至高尔基体的过程中与内吞的右旋糖酐共定位，并且考虑到右旋糖苷与GFP-ML1定位的发生率很高，很可能与GFP-ML1定位。同样，MHCII和GFP-ML1广泛地共同本地化。
在我们的模型中，我们认为ML1主要定位于溶酶体前M6PR-阴性、LBPA阳性的隔室，作为分子运输到不同目的地的枢纽（图。). 像BSA和右旋糖酐这样的可溶分子集中在从这些隔间发出并分离的亚结构中。裂变反应后，这些亚结构与溶酶体融合，在此期间ML1失活，可能是由于pH值降低和蛋白酶激活。先前的研究结果表明组织蛋白酶B参与了溶酶体间室的蛋白水解裂解和ML1通道活性的抑制[22]。这是一个反复的过程，在这个过程中，ML1阴性溶酶体不断与GFP-ML1标记的小室融合，从而传递部分消化的肽片段以加载到MHCII上。MHCII向质膜的转运还涉及到小管上皮细胞中间产物，因此在小管与质膜融合之前，可能还需要ML1来形成或切断小管[49].
ML1功能模型图中显示了ML1（绿点）相对于可溶性内吞分子（红色阴影）的定位。灰色圆圈和薄片是LBPA染色膜。未显示与HRS和M6PR共同定位的ML1。
降低ML1水平会导致这些溶酶体转运事件的延迟而不是阻塞。在BSA转运的情况下，我们使用的分析只能检测到转运的延迟，而不能检测到完整的整块，例如ML1是形成或断开亚结构所必需的，而不是溶酶体与晚期内体融合所必需的。此外，粘蛋白-2可能与ML1有多余的功能，因为MCOLN1型在DT40 B淋巴细胞中，主要负羧基端GFP融合物ML1或粘蛋白-2的过度表达均显示出这种表型。
最后，我们不知道ML1是否直接参与Bodipy-LacCer运输、BSA运输和/或MHCII运输。一种可能性是ML1在所有这些运输步骤中都发挥着类似的作用，例如在小管扩张和/或切断中。或者，在一个运输步骤中可能需要ML1，这样ML1水平的损失/减少会延迟这一步骤，导致基质在轮毂室中的积累，并且这种积累会间接干扰其他运输路径。未来的研究将确定这些运输路径中ML1的具体要求。
方法
细胞培养和转染
小鼠RAW264.7巨噬细胞（ATCC，Manassas，VA）在含有2 mM谷氨酰胺的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中生长，并在37°、95%空气、5%二氧化碳条件下补充10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素（Invitrogen，Carlsbad，CA）。LS5，GFP-ML1稳定克隆，LS9和LS10MCOLN1型RNAi稳定克隆在相同条件下生长，包括250μg/ml的G418。
使用Fugene 6（印第安纳波利斯罗氏）进行质粒转染。
分子方法
标准方法用于操作重组DNA[54]。根据制造商的说明，使用扩展长模板PCR系统（罗氏）进行聚合酶链反应（PCR）。所有其他酶均来自新英格兰生物实验室（马萨诸塞州贝弗利），除非另有说明。
质粒
所有PCR片段插入质粒后测序。
编码EGFP与小鼠ML1氨基末端融合蛋白的质粒pHD300是约1.7 kb的PCR片段（模板：小鼠cDNA；引物：5'CACACAAAGCTTATGGCACCCCCGGCGCGCGCGC 3'和5'CACCAGTCACTTCACCAGGCGCGCGTC 3'）后面的三+萨尔I并插入pEGFP-C3的相同站点（Clontech，Mountain View，CA）。
通过限制性消化720 bp PCR片段（模板：pmCherry；引物：5'CACACACCACGGTCGCCACATGGTGCCACCATGGTGAGGCGAGGAGGGGG 3'和5'CACCAAGAGATCTGTACTCGTCGCCCCCCGCGCGCG 3'），制备质粒pHD334，其中红色荧光蛋白mCherry取代pEGFP-C3相同框架中的EGFP年龄我+Bgl公司II并插入pEGFP-C3的相同位点[55].
质粒pHD339编码mCherry与小鼠ML1氨基末端的融合蛋白，通过亚克隆约1.7kb获得后面的三+萨尔I从pHD300片段到pHD334的相同位点。
表达小鼠的质粒pHD307MCOLN1型shRNA是通过退火和连接两个互补寡核苷酸84696（5'AGCTTAAAAAATCAGCCTCTCATACATTCCTCTCTCTTGAAATGATGAAGAGGCTGAGGGGGG 3'）和84697（5'GATCCCTCAGCCTCTCTATCTACTACATTCACATTCAAGAGAGTAGAGAGAGACTGGAGCTGTATTTA 3'）到Bgl公司二-后面的III切割pSUPER-neo（Oligoengine，西雅图，华盛顿州）。该shRNA在组蛋白H1启动子前表达，并靶向小鼠中的序列5“UCAGCCUCAUCUACAU 3”MCOLN1型mRNA。
制作MCOLN1 RNAi克隆
我们使用质粒pHD307鉴定了两种稳定的转染体LS9和LS10。为了确定RNAi的效率，我们在凝胶上运行来自RAW264.7、LS9或LS10细胞的15μg总RNA。Northern印迹用补充DNA片段进行探测MCOLN1型，至MCOLN2型、或至GAPDH公司。已探测到相同的筛选器MCOLN1型、剥离和再保护GAPDH公司再次剥离并重新保护MCOLN2型.使用ImageJ软件（N.I.H.，Bethesda，MD）对谱带强度进行量化。要确定MCOLN1型或MCOLN2型在LS9（或LS10）相对于RAW264.7细胞中，我们将MCOLN1型由GAPDH公司在LS9（或LS10）中带以获得每个菌株的“相对水平”。将LS9（或LS10）的“相对水平”除以RAW264.7的“相对水平”，再乘以100，得出MCOLN1型或MCOLN2型信使核糖核酸水平。RNA分离和Northern杂交重复两次，以计算平均值和标准偏差。
摄取的时间过程：GFP-ML1
实验开始前，将盖玻片上生长的细胞在DMEM/F-12培养基（Invitrogen）中培养至少1小时。将牛血清白蛋白（BSA）-AlexaFluor 594（Invitrogen）溶解，并在37°下以1 mg/ml的速度添加到DMEM/F-12中的细胞中1分钟。或者，将右旋糖酐MW 10000-罗丹明（Invitrogen）以1 mg/ml的浓度添加到DMEM/F-12中的细胞中，在37°下持续1分钟。在培养的第一分钟后，用含有1 mg/ml BSA的DMEM/F-12替换培养基，并在37°的不同追逐时间后固定细胞。将PBS中的冰镇2%多聚甲醛添加到细胞中，并在室温（RT）下培养1小时，进行固定。盖玻片用PBS清洗三次，然后装入载玻片上的Slowfade安装介质（Invitrogen）中查看。共定位百分比是指与GFP-ML1共定位的BSA-AlexaFluor 594（或右旋糖酐罗丹明）染色的离散结构的数量除以截面中BSA-AlexaFluor 584（或左旋糖酐罗丹明）着色结构的总数，再乘以100。图表显示了至少20个不同单元格的平均值。
摄取时间进程：MCOLN1-
实验开始前，将盖玻片上生长的细胞在DMEM/F-12培养基中培养至少1小时。将BSA-AlexaFluor 594以1 mg/ml的浓度添加到DMEM/F-12中的细胞中，在37°下持续1小时。将培养基替换为常规培养基，并将细胞放置24小时，以预先标记终端隔间。在实验开始前，细胞再次在含有2 mM谷氨酰胺的DMEM/F-12培养基中培养至少1小时。将BSA-AlexaFluor 488（Invitrogen）以1 mg/ml的浓度添加到DMEM/F-12中的细胞中，在37°下持续10分钟。细胞用DMEM/F-12清洗一次，在含有1mg/ml BSA的DMEM/F-112中培养，细胞在37°的不同追逐时间后固定。将PBS中的冰镇2%多聚甲醛添加到细胞中，并在室温（RT）下培养1小时，进行固定。在将盖玻片装入Slowfade安装介质（Invitrogen）中查看之前，用PBS清洗盖玻片三次。
免疫荧光
对于常规免疫荧光，将生长在盖玻片上的细胞固定在室温下PBS中4%多聚甲醛中20分钟，或固定在100%甲醇（保持在-20°）中20分钟。室温下用PBS清洗细胞三次，每次5分钟。在50 mM NH中培养副甲醛固定细胞4室温下在PBS中加入Cl 10分钟，然后用PBS再清洗两次。在封闭缓冲液（1%BSA，0.1%皂苷，PBS）中封闭30分钟。然后将细胞在封闭缓冲液中稀释的一级抗体中在RT下孵育2小时，用PBS洗涤3次，在封闭缓冲液中以1:200稀释的Cy2或Cy3标记的二级抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA）中在RT下孵育1小时，用PBS洗涤3次，并安装在幻灯片上的Slowfade安装介质（Invitrogen）中以供查看。
对于MHCII的表面染色，在存在或不存在100μg/ml LPS的情况下生长24小时的细胞首先用冰镇PBS清洗三次，然后用1×PBS/1 mg/ml BSA在4°下稀释的一级抗体培养两小时。然后用1×PBS/1 mg/ml BSA在4°下洗涤细胞三次，每次五分钟，然后在4°条件下用1×PBS/1 mg/ml BSA稀释的二级抗体中培养一小时。再次清洗细胞，然后在4%甲醛中固定1小时，然后用PBS清洗并加载到载玻片上。这些细胞的共焦图像是使用相同的曝光和放大率获得的。使用Adobe Photoshop（加利福尼亚州圣何塞Adobe Systems Incorporated）对表面MHCII标记的强度进行量化。
使用的抗体/稀释液为鸡抗GFP/1:200（马萨诸塞州剑桥市Abcam）、大鼠抗Lamp1/1:1（爱荷华州爱荷华市发育研究杂交瘤银行）、小鼠抗溶血素（双）磷脂酸（LBPA）/1:1[41]，兔抗甘露糖6-磷酸（CI-M6PR）/1:500，兔抗HRS/1:250[42]，和大鼠抗鼠主要组织相容性复合体II（MHCII）–M5/114.15.2/1:5（BD Biosciences，San Jose，CA）[56]或小鼠抗鼠主要组织相容性复合体II（MHCII）–34-5-3/1:5（BD Biosciences）。对于34-5-3抗体，Fc Block与一级抗体以1:50的稀释度混合（BD Biosciences）。
共定位百分比是指GFP-ML1染色结构的数量，这些结构与不同隔间的标记物共定位，除以截面中GFP-ML1-染色结构的总数，再乘以100。图表显示了至少20个不同单元格的平均值。
吖啶橙染色
RAW264.7、LS9和LS10细胞用PBS/0.5 mg/ml BSA洗涤两次，并在室温下在100μm吖啶橙溶液（AO，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）中用PBS/0.5mg/ml BSA稀释10分钟。然后细胞在PBS/0.5 mg/ml BSA中洗涤两次并立即通过共聚焦显微镜成像。所有图像均采用相同的曝光和放大倍数拍摄。未染色的细胞作为对照进行成像，并且在用于显示AO的条件下没有显示任何背景荧光。我们使用ImageJ软件测量单个AO染色区室的平均染色强度。每个应变至少测量100个结构，以确定平均值和标准偏差。
右旋糖酐-受体绿染色
RAW264.7、LS9和LS10细胞用DMEM/F-12培养基清洗一次，并在相同培养基中37°孵育1小时。然后将细胞在含有1 mg/ml右旋糖酐（MW-1000）-俄勒冈州绿488（Invitrogen）的DMEM/F-12培养基中37°培养5分钟。在共聚焦显微镜前，用DMEM/F-12培养基清洗细胞两次，并在37°下再追踪一小时。所有图像均采用相同的曝光和放大倍数拍摄。未染色的细胞作为对照进行成像，在用于显示右旋糖酐-血管内皮素绿488的条件下，未显示任何背景荧光。我们使用ImageJ软件测量单个右旋糖酐-Regon Green 488染色间隔的平均染色强度。每个应变至少测量60个结构，以确定平均值和标准偏差。
Body-LacCer贩运
生长细胞用PBS洗涤两次，用DMEM/F-12培养基洗涤一次。然后将细胞在含有10 mg/ml右旋糖酐（MW-1000）-级联蓝（Invitrogen）的DMEM/F-12培养基中37°培养4小时。用正常培养基替换染色液，细胞在37°下放置24小时。细胞用PBS洗涤两次，用DMEM/F-12培养基洗涤一次，然后在DMEM/F.12培养基中37°放置1小时。然后将细胞在含有5μM BODIPY-FL LacCer-BSA（Invitrogen）的DMEM/F-12培养基中37°培养30分钟。用2ml预热的DMEM/F-12替换染色液，并将细胞在37°下放置45分钟或90分钟。为了去除追逐后的质膜标记，用2ml冰镇DMEM/F-12/5%BSA将细胞交换六次，每次10分钟，然后将平板放在冰上，直到所有样品都准备好进行共焦显微镜检查。除添加染料外，对经过类似处理的未染色细胞进行成像，作为对照，在用于可视化右旋糖酐-半胱氨酸蓝或BODIPY-FL LacCer-BSA的条件下，未显示任何背景荧光。
鸡蛋溶菌酶降解试验
生长细胞用PBS洗涤两次，用DMEM/F-12培养基洗涤一次。然后在DMEM/F-12培养基和107细胞被添加到100毫米的平板上。在37°下2小时后，用37°预热的DMEM/F-12培养基清洗细胞两次。然后在37°预热的鸡蛋溶菌酶（HEL）中以10 mg/ml的速度将细胞培养5分钟，该溶菌酶溶解在DMEM/F-12培养基中。去除该溶液，用37°预热PBS清洗细胞三次，并向细胞中添加5 ml 37°预热DMEM/F.12。用刮擦法将细胞从平板上清除，用吸液管将细胞团打碎。然后将5 ml细胞溶液添加到37°-预热的15 ml试管中，并在37°混合的同时进行培养。这是时间零点。在0分钟、30分钟、60分钟和90分钟时，取出1 ml细胞并添加到预冷的eppendorf管中。细胞在低温下旋转，用冰镇PBS清洗一次，然后在150μl Western加载缓冲液（50 mM Tris pH 6.8，10%甘油，4%SDS，10 mM DTT，0.01%溴酚蓝）中重新悬浮，预热至95°。
对于Western分析，每条车道使用10μl每个样品。水平切割每个过滤器，以便使用兔抗GAPDH（Cell Signaling Technology，Danvers，MA，1:1000稀释）探测上半部，使用兔抗HEL（Abcam，1:5000稀释）探测下半部。对于抗原检测，我们使用与HRP结合的山羊抗兔IgG二级抗体（Pierce，Rockford，IL，1:50000）和Amersham ECL Advance Western Blotting检测试剂盒（Amersham Biosciences，Pittsburgh，PA）。
为了量化HEL随时间的细胞水平，我们使用ImageJ量化扫描图像上HEL和GAPDH带的强度。对于每条通道，我们将HEL强度除以GAPDH强度，以使HEL水平相对于细胞蛋白归一化。然后，我们将30分钟、60分钟和90分钟时间点的归一化HEL数除以0分钟时间点的数，以确定细胞HEL相对于0时间点的百分比。我们注意到，由于基于HRP的ECL检测分析的非线性性质，所报告的细胞系之间的差异可能比此处显示的更稳健。
整个实验重复两次，以获得平均值和标准偏差。
显微镜
使用Nikon PCM 2000对红色染料使用HeNe 543激发，对绿色染料使用Argon 488或使用蔡司Meta 510显微镜拍摄共聚焦图像。
